Un'applicazione efficace di queste tecniche consentirà la valutazione cinetica di studi farmacologici o il passaggio di contaminanti xenobiotici attraverso una placenta morfologicamente intatta. La tecnica di perfusione della placenta roditrice consente una maggiore produttività degli studi farmacologici o tossicologici, poiché più composti possono essere valutati utilizzando il tessuto di una singola diga. A dimostrare la tecnica sarà Jeanine D'Errico, una studentessa senior del mio laboratorio.
Prima di iniziare la procedura, riempire delicatamente tutte le camere, gli aghi, le micropipette di vetro, i tubi e i serbatoi con soluzione fisiologica di sale riscaldata o PSS, rimuovendo con cura eventuali bolle d'aria con una pipetta di trasferimento a punta fine, se necessario. Ruotare tutti i fermagli a tre modi in posizione off per fissare il fluido all'interno delle pipette. Posizionare una sola cravatta su ciascuna delle due micropipette di vetro preparate per la cannula uterina e sui due aghi a punta smussata designati per la cannulazione ombelicale.
Quindi fissare le cravatte per evitare perdite durante i movimenti della camera. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi in un giorno gestazionale anestetizzato 20 topo incinta femmina, sollevare un corno uterino dall'addome e stendere il corno per lunghe strade, esterno all'animale. Usa suture di seta intrecciate per legare l'arteria uterina alle estremità vaginale e ovarica del corno, inclusa l'ovaia all'interno della sutura con il corno uterino.
Usando le forbici chirurgiche, fare incisioni sul lato prossimale della cravatta dell'ovaio e sul lato distale della cravatta vaginale. Trasferire il corno uterino in una sezionatura foderata in gomma siliconica e riempita con PSS freddo. Con il lato ovaio a sinistra e il lato vaginale a destra, spingere delicatamente un perno sezionante attraverso il corno uterino nella gomma siliconica per stabilizzare l'utero.
Selezionare un'unità fetale placenta materna centrale al corno. Utilizzando pini e forbici fini, rimuovere la membrana amniotica dalla superficie fetale della placenta facendo attenzione ad evitare il cordone ombelicale. Dipanare e ligare il cordone ombelicale per separare il cucciolo fetale.
Dopo aver identificato l'arteria e la vena ombelicale, separare delicatamente e ligare i vasi ombelicali. Quindi tagliare la vena ombelicale leggermente più corta dell'arteria ombelicale per facilitarne l'identificazione. E ligar l'arteria uterina e la vena con forbici chirurgiche.
Mantenendo il corretto orientamento del flusso sanguigno anatomico dell'arteria uterina, posizionare l'unità placentare nella camera del vaso isolata modificata riempita con PSS ossigenato caldo al microscopio sezionato. Utilizzando un paio di forcep fini in ogni mano, cannulate le estremità prossimali e distali dell'arteria uterina sulle micropipette di vetro. Fissare saldamente l'arteria con la sutura di nylon sterile precedentemente posizionata.
Cannulate e fissare l'arteria ombelicale sull'ago smussato calibro 23. Quindi cannucolare e fissare la vena ombelicale sull'ago smussato calibro 25 e riempire tutti i fermavi e i tubi per prevenire bolle d'aria. Ricorda di controllare tutti i fermavi, le cannule e i tubi per le bolle d'aria, poiché un bolo d'aria nel sistema porterà all'angoscia cellulare ed eliminerà il flusso di contro corrente all'interno della placenta.
Collegare tutti i tubi in base alla figura. Posizionare piccole barche di pesatura sotto la cannulazione distale dell'arteria uterina materna e sotto la cannulazione dell'ago della vena ombelicale fetale per catturare l'effluente che emergerà nel corso della procedura. Preparare la piastra di raccolta per l'effluente per un'analisi successiva.
Aprire il fermafo per consentire il flusso di fluido attraverso i tubi verso la placenta e accendere la pompa peristaltica, il controllo della pressione e il monitor di pressione. Aumentare lentamente la pressione a 80 millimetri di mercurio letto sul monitor di pressione. Aprire lentamente il fermagli per consentire il flusso di fluido verso l'arteria uterina.
Riempire tutti i serbatoi per mantenere il volume del fluido durante l'esperimento. Dopo che i tessuti sono stati equilibrati per 30 minuti per consentire alla vascucolatura di adattarsi al nuovo flusso di fluido, stabilire la perfusione di base raccogliendo gli effluenti per 10 minuti da entrambe le barche di pesatura. Misurare il volume di fluido che emerge attraverso l'arteria uterina e la vena ombelicale.
Alla fine del periodo di raccolta della linea di base, somministrare il trattamento sperimentale nell'arteria uterina. Quindi raccogliere campioni dall'arteria uterina distale e dall'effluente nale ombelicale fetale ogni 10 minuti per un totale di 180 minuti dopo l'infusione. Misurare i contaminanti all'interno dei campioni di fluido.
La perfusione con colorante blu Evans per testare il sistema e visualizzare l'appropriata funzione di barriera fluida e placentare per prevenire il trasferimento di contaminanti nel compartimento fetale rivela che il colorante ha raggiunto e perfuso il tessuto placentare all'interno di questo sistema. Dopo un'indagine più approfondita, è chiaro che il colorante blu Evans non è entrato nella vena ombelicale fetale, come ci si aspetta, poiché la tintura blu Evans è legata all'albumina. In questo esperimento rappresentativo è stato identificato un ridotto trasferimento di fluido nel compartimento fetale entro 10 minuti dall'infusione di polistirolo.
Il trasferimento in polistirolo nel compartimento fetale ha poi raggiunto il picco a 20 minuti e ha continuato per 90 minuti. La cosa più importante da ricordare durante la cannula è andare lentamente. Le pipette e il tessuto sono molto delicati e possono facilmente rompersi o strapparsi.
Pesando l'effluenza, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per indagare la fisiologia placentare e la traslocazione del materiale.
