This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

Il protocollo che segue descrive le tecniche per lo studio della migrazione delle cellule endoteliali presto. La corretta coltivazione di cellule endoteliali vascolari richiede pre-rivestimento dei fiasche di coltura cellulare con gelatina per garantire la corretta proliferazione e la manutenzione di un fenotipo endoteliale. 1. Pre-rivestimento di cella cultura palloni <ol><li> Sciogliere la gelatina in 0,1 M PBS ad una concentrazione finale di 0,1%. </li><li> Autoclave la soluzione con i parametri per autoclave liquido (per dettagli vedere le istruzioni dell&#39;autoclave specifico). </li><li> Aggiungere volume sufficiente di soluzione di gelatina autoclavato in un pallone di coltura cellulare sterile (ad esempio, almeno 5 ml per un pallone di coltura di cellule T25). </li><li> Trasferire i flaconi in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2 non è necessaria, ma non interferisce) per almeno 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di gelatina rimanente. Utilizzare i palloni preverniciati successivamente (vedi coltura cellulare) o store in condizioni sterili fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Cella coltivazione delle antiche cellule endoteliali Nota: cellule staminali embrionali derivate prime cellule endoteliali (CEE) sono state ottenute da differenziati corpi embrionali murine per separazione delle cellule magnetica attivata della frazione di cellule positive PECAM-1 come descritto in precedenza 10,11. <ol><li> Culture CEE su gelatina rivestite piatti di coltura cellulare in DMEM supplementato con 15% FCS, 50 U / ml di penicillina, 50 U / ml di streptomicina, 200 mM L-glutammina, 100 mM ß-mercaptoetanolo e 1% di aminoacidi non essenziali. Gestire le cellule in condizioni sterili. Coltivare le cellule con 5% di CO 2 a 37 ° C e 95% di umidità fino sub-confluenza (max. 80%). </li><li> Al sub-confluenza, dividere le celle in un rapporto 1: 5. Nota: Il distacco delle cellule endoteliali è un passaggio fondamentale. <ol><li> Raccogliere le cellule con RT accutase. Rimuovere i supporti, risciacquare con PBS e aggiungere 1 ml di accutase per 25 centimetri <sup&gt; 2. </li><li> Incubare la muffola a temperatura ambiente per 2-10 minuti fino a quando le cellule sono distaccato. Disperdere le cellule e trasferirli l&#39;applicazione desiderata. Nota: Una neutralizzazione chimica del accutase non è richiesto come avviene quando le cellule seminate sono memorizzati in incubatrice a 37 ° C. Tuttavia, accutase attività può essere diminuita aggiungendo DMEM contenente FCS. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Chamber Nota: saggi camera di Boyden vengono effettuate utilizzando sistemi di inserti di polietilene tereftalato chiaro opaco con 8 micron dimensione dei pori. <ol><li> Pre-coat gli inserti del filtro (che si adattano all&#39;interno pozzetti di coltura cellulare creando così una camera di Boyden) aggiungendo 500 ml di 0,1% di gelatina disciolti in 0,1 M PBS per almeno 30 min. </li><li> Se le cellule devono essere esposti a sostanze chimiche tossiche, esporre secondo il disegno sperimentale specifico prima raccolta di cellule. Nota: Le cellule sono state esposte a 12,5 mcg clorambucil / ml DMEMper 24 ore. Per quanto riguarda il disegno sperimentale specifico, le istruzioni possono variare. </li><li> Harvest CEE e determinare il numero di cella utilizzando una camera di conteggio delle cellule. Nota: Distributori automatici di conteggio possono essere utilizzati, ma devono essere usati con cautela: conteggio manuale delle cellule è più preciso ed è altamente raccomandato. </li><li> Aggiungere 500 microlitri terreno di coltura cellulare nel vano camera inferiore della camera di Boyden. </li><li> Aggiungere esattamente 10 4 CEE in 500 microlitri terreno di coltura cellulare per inserto filtro nel vano camera superiore. Eliminare le bolle. </li><li> Incubare gli inserti del filtro in incubatrice per esattamente 8 ore. </li><li> Risciacquare una volta con PBS e sostituire il mezzo con 0,5 ml di 4% paraformaldeide in entrambi gli scomparti per 25 minuti per la fissazione delle cellule. Lavare il filtro ampiamente ma almeno 3 volte con 0,1 M PBS. </li><li> Accise le membrane con un bisturi. </li><li> Montare la membrana tra due vetrini di vetro con il mezzo di montaggio contenente DAPI per stainin nucleareg. Prestare attenzione all&#39;orientamento. Assicurarsi che solo le cellule che sono migrati verso il lato vano inferiore della membrana vengono contati. </li><li> Contare le cellule che sono migrati verso il lato vano inferiore della membrana con un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 400X. Non confondere pori della membrana con le cellule migrate (Figura 1A, 1B). Indagare un numero ragionevole di repliche biologiche (almeno 3 repliche biologiche per condizione). </li></ol> 4. Wound Healing Assay <ol><li> A seconda della dotazione disponibile, scegliere con cura i piatti di coltura cellulare o piastre: Quando si utilizza la microscopia DIC, evitare di superficie plastica piatti della cultura basato o pozzetti ma utilizzare dispositivi basati su vetro, invece. Nota: Se si utilizza la microscopia a contrasto di fase, piatti di plastica a base possono essere usati anche. </li><li> Coltivare CEE in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio, 4 centimetri di vetro Petri fondo adatto per l&#39;imaging cellulare dal vivo) Fino all&#39;80% di confluenza. Importante: non coltivare le cellule per completare confluenza. </li><li> Gratta monostrati con sterili 10 consigli microlitri pipetta. Spingere la punta delicatamente senza troppa pressione sulla superficie piatto e spostarlo in linea retta agevolmente da un lato al other.Wash le cellule due volte con 0,1 M PBS per rimuovere le cellule staccate. </li><li> Aggiungere un volume sufficiente di mezzo al piatto di coltura. Se del caso, aggiungere i composti che devono essere esaminati. Nota: 1.5 ml di mezzo contenente 15 ng / ml alfa è stato aggiunto acido linolenico. </li><li> Montare il piatto di coltura al microscopio capace di imaging cellulare dal vivo. Assicurare 5% di CO 2, 37 ° C e atmosfera umidificata. Nota: umidificazione è particolarmente importante per evitare evaporazione media. </li><li> Acquisire time-lapse immagini oltre 24 ore a intervalli di 10 min. Piano per file di grandi dimensioni. Nota: Una risoluzione di 512 x 512 pixel è generalmente sufficiente; tuttavia, si consiglia di utilizzare le immagini di almeno 1.024 x 1,024. </li><li> Misurare la fessura su t = 0 ore e al tempo t = 24 ore utilizzando lo strumento lunghezza del software fornito con il microscopio o utilizzare software open source (per esempio, ImageJ). Nota: In generale software specifico di acquisizione e analisi delle immagini è fornito dal produttore. Pertanto, per i dettagli tecnici relativi all&#39;uso del software, consultare il manuale. </li></ol> Monitoraggio 5. cellulare <ol><li> A seconda della dotazione disponibile, scegliere con cura i piatti di coltura cellulare o piastre: Quando si utilizza la microscopia DIC, evitare di superficie plastica piatti della cultura basato o pozzetti ma utilizzare dispositivi basati su vetro, invece. Nota: Se si utilizza la microscopia a contrasto di fase, piatti di plastica a base possono essere usati anche. </li><li> Seme 5 x 10 4 CEE in DMEM integrato in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio, 24-pozzetti) e coltivare le cellule con 5% di CO 2 a 37 ° C e 95% di umidità per 1-2 giorni. </li><li> Quando le cellule sono cresciuti fino ad un 80% Confluenza, rimuovere i media e la cultura delle cellule con i nuovi media, in presenza dei rispettivi sostanze di prova (ad esempio, 12,5 mcg chlorambucil / ml DMEM). Sempre includere cellule di controllo (trattati con il solvente, ad esempio, etanolo) a 37 ° C per un certo periodo di tempo (24 ore, a seconda del sistema di dosaggio individuale). </li><li> Montare il piatto di coltura al microscopio capace di vivo imaging cellulare (37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità). Acquisire time-lapse immagini oltre 24 ore a intervalli predefiniti. Acquisire immagini a intervalli di 10 min. </li><li> Eseguire il monitoraggio manualmente della CEE con l&#39;uso del plugin ImageJ MTrackJ. Scegli 10 celle a caso dal campo visivo e seguire i loro movimenti con l&#39;aggiunta di un punto dati per ogni punto nel tempo utilizzando il &quot;Aggiungi&quot; il comando di MTrackJ. </li></ol> Nota: MTrackJ è disponibile gratuitamente presso e ImageJ è disponibil [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le a [Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Un manuale dettagliato sul plugin MTrackJ è disponibile a &quot;http://www.imagescience.org&quot;. 6. Imaging cellulare dal vivo / Valutazione del potenziale di membrana mitocondriale <ol><li> Coltivare CEE in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio 4 cm vetro Petri inferiore adatto per l&#39;imaging cellulare dal vivo) fino ad una confluenza di 80%. Importante: Non coltivare le cellule per completare confluenza. </li><li> Se del caso, esporre le celle a sostanze chimiche. Nota: Le cellule sono state esposte a 12,5 ug / ml clorambucile per 24 ore. Per quanto riguarda il disegno sperimentale specifico, le istruzioni possono variare. </li><li> Preparare una soluzione 10 stock mM di tetrametilrodamina (TMRM) in DMSO. Proteggere dalla luce. Nota: La soluzione madre può essere conservata a -20 ° C. </li><li> Diluire la soluzione madre in mezzo di coltura cellulare per una soluzione di lavoro con una concentrazione di 10 mM (1: 1.000) diluizione. Proteggere dalla lucee utilizzare il più presto possibile. Nota: La soluzione di lavoro può essere conservata a temperatura ambiente per un certo tempo (&gt; 1 ora), tuttavia, la preparazione di una soluzione di lavoro fresco è altamente raccomandato. </li><li> Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro per 1 ml di mezzo (soluzione di caricamento) fresco coltura cellulare. </li><li> Caricare le cellule sostituendo il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di carico. Incubare per 15 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 e l&#39;atmosfera umidificata (incubatore). Attenzione: Quasi tutti gli indicatori di fluorescenza vengono esportati dalle cellule nel tempo vivente; quindi evitare di caricare prolungata o analisi ritardato. </li><li> Senza lavaggio, mettere il piatto sotto un microscopio adatto per l&#39;imaging cellulare dal vivo. Importante: gli indicatori di fluorescenza sono molto sensibile alla luce, quindi, evitare l&#39;esposizione alla luce non necessaria. </li><li> Acquisire le immagini senza modificare i parametri di acquisizione per garantire la comparabilità tra le immagini differenti. </li></ol>

<ol>
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Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. 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The authors have nothing to disclose.

Esposizione cutanea a sostanze chimiche tossiche si traduce spesso in grave disturbo guarigione delle ferite. I meccanismi alla base sono in gran parte sconosciuti. La guarigione della ferita è un processo complesso che si compone di diverse fasi (emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento). Migrazione cellulare è coinvolto in ogni fase, tuttavia, è di fondamentale importanza per la formazione del tessuto di granulazione. Qui, nuovi vasi sanguigni si formano mediante angio o vasculogenesi. <p class=...

La migrazione delle cellule è importante in molti processi fisiologici e fisiopatologici, tra cui lo sviluppo, varie malattie, e la guarigione delle ferite dopo lesioni della pelle. Dopo lesioni della pelle, infiammazione rimuove unità tessuti e granulazione danneggiati o necrotiche chiusura preliminare ferita e permette la formazione di una rete di nuovi capillari attraverso vasculogenesi (formazione romanzo) o angiogenesi (germinazione di vescicole esistenti) 1-3. Sia vasculo- e angiogenesi richiedono migrazione delle cellule endoteliali. La crescente rete di vasi sanguigni è essenziale per il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive al proliferare cheratinociti che alla fine subiscono cheratinizzazione, formare un nuovo epitelio e fornire la chiusura della ferita. La migrazione deteriorate delle cellule endoteliali è una causa di fondo di guarigione delle ferite disturbo 4,5. Così, i metodi per valutare la migrazione delle cellule endoteliali primi sono tenuti a esplorare la pathophysiollogia dei disturbi di migrazione delle cellule e di individuare nuove strategie di intervento terapeutico. Esposizione cutanea ad agenti alchilanti (ad esempio, zolfo e mostarde azoto) provoca la guarigione della ferita disturbo 6. Tali composti sono stati utilizzati come agenti di guerra chimica in molti conflitti nel 20 ° secolo e rimangono motivo di forte preoccupazione a causa di scorte esistenti in regioni politicamente instabili e relativamente semplice sintesi. Anche se la senape di zolfo fu sintetizzato nel 1822, la patologia molecolare e clinica di esposizione SM non è compreso nei dettagli e un antidoto per l&#39;esposizione SM è stato identificato. Sono stati condotti numerosi studi per comprendere e modellare difficoltà nella guarigione dopo l&#39;esposizione SM e per testare potenziali composti candidati capaci di riservare tale effetto. Schmidt et al. (2009) testato l&#39;effetto di clorambucile, un composto alchilante con proprietà simili a SM in moumodelli corpo embrioide sé e ha trovato una drammatica, a volte riduzione oltre il 99% in formazione dei vasi 7. Questo effetto negativo è stato più pronunciato in una fase di sviluppo che, in condizioni fisiologiche, è dominato dalla proliferazione e la migrazione delle cellule precursori endoteliali vascolari. Così, queste cellule sono state identificate per essere particolarmente sensibile agli agenti alchilanti. Steinritz et al. (2010) testato scavengers di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), in particolare N-acetilcisteina (NAC) e acido linolenico alfa (ALA) per la loro capacità di ridurre la tossicità SM in modelli di topo embrioide corpo e in particolare, per ripristinare la formazione dei vasi 8. Sono stati osservati effetti protettivi temporanei, che indica che l&#39;eccessiva formazione di ROS è stato in grado di contribuire agli effetti negativi della SM sulla guarigione delle ferite. Questi effetti non sono permanenti e due composti candidati possono non essere in grado di ripristinare la formazione dei vasi e la guarigione della ferita a lungo termine 8. However, quegli esperimenti sono stati condotti in un modello complesso in 3D che ha fatto autorizzazione di indagare su migrazione cellulare. Così, abbiamo successivamente testato NAC e ALA per gli effetti benefici sulla migrazione cellulare di CEE, che hanno un ruolo chiave nel processo di formazione dei vasi 9. Inoltre, è dimostrato che la polarità cellulare è necessaria per la migrazione delle cellule. Disfunzione mitocondriale che porta alla formazione di ROS ha dimostrato di ridurre la polarità delle cellule e può quindi influenzare negativamente la migrazione delle cellule. Pertanto, cellule vive quanto riguarda la funzione mitocondriale è stata eseguita e gli effetti di scavengers ROS sono stati esaminati. Il protocollo che segue descrive i requisiti generali per la coltivazione della CEE, del test camera di Boyden, la guarigione della ferita test tra cui l&#39;analisi di monitoraggio delle cellule e l&#39;uso di TMRM per la valutazione della funzione mitocondriale nei dettagli. Aspetti importanti di protocolli sperimentali per la coltivazione CEE e la migrazione sono evidenziati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

L&#39;esposizione a sostanze chimiche (compresi alchilanti agenti di guerra chimica come mostarde zolfo e di azoto) provoca una pletora di sintomi clinici tra cui il disturbo di guarigione delle ferite. Il processo fisiologico di guarigione della ferita è molto complessa. La formazione di tessuto di granulazione è un passo fondamentale in questo processo con un conseguente chiusura preliminare ferita e fornendo una rete di nuovi vasi sanguigni capillari - sia attraverso vasculogenesi (romanzo di formazione) o angiogenesi (germinazione delle navi esistenti). Sia vasculo- e angiogenesi richiedono funzionale, la migrazione diretta delle cellule endoteliali. Così, l&#39;indagine della migrazione precoce delle cellule endoteliali (CEE) è importante per capire la fisiopatologia della chimica indotta guarigione delle ferite e disturbi potenzialmente individuare nuove strategie di intervento terapeutico. Abbiamo valutato difficoltà nella guarigione dopo alchilanti esposizione agente e testati potenziali composti candidati treatment. Abbiamo usato una serie di tecniche descritte in questo protocollo. Una camera di Boyden modificato per investigare quantitativamente chemochinesi di CEE è descritta. Inoltre, l&#39;uso di guarigione della ferita test in combinazione con analisi pista per valutare qualitativamente migrazione è illustrato. Infine, dimostriamo l&#39;uso del TMRM colorante fluorescente per la ricerca del potenziale di membrana mitocondriale per identificare i sottostanti meccanismi della migrazione cellulare disturbato. Il protocollo che segue descrive le tecniche di base che sono state adattate per la ricerca di CEE.

Esposizione cutanea ad agenti alchilanti provoca eritema, formazione di bolle e ulcere cutanea che è associato con un disturbo guarigione della ferita. La guarigione della ferita richiede vasculogenesi angio e che si basano sulla migrazione delle cellule endoteliali. Migrazione quantitativa può essere valutata mediante l&#39;uso del dosaggio camera di Boyden. Come mostrato nella Figura 1C esposizione CEE al clorambucile agente alchilante determinato una significativa diminuzione migrazione cellulare <...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K Views.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epicardico escrescenza Cultura Assay e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La valutazione della migrazione delle cellule di derivazione epicardico

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...