This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

Le pratiche utilizzate per ottenere i tessuti di topo sono stati approvati dal corpo per la protezione degli animali (OPBA) dell&#39;Università degli Studi di Trento (Italia), il protocollo n. 04-2015, il decreto di cui al art.31 legislativo n. 26/2014. Tutti i topi sono stati mantenuti al Organismo modello Struttura del Centro per la Biologia Integrata (CIBIO), Università degli Studi di Trento, Italia. Attenzione: Per evitare qualsiasi degradazione dell&#39;RNA dei campioni, preparare tutti i buffer con acqua DEPC trattati per ridurre al minimo la contaminazione RNasi. 1. Preparazione di polisomi da Brains Interi <ol><li> Raccolta di tessuti cerebrali (15 min) <ol><li> Euthanize wild-type ceppo di topi C57BL / 6 con CO 2 asfissia per 5 min 36. Sezionare accuratamente il cervello dal cranio 36, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml e metterlo immediatamente in azoto liquido. Conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparazione del lisato (30 min) <ol><li> Polverizzare l&#39;intero tessuto cerebrale utilizzandoun mortaio e pestello sotto azoto liquido. </li><li> Trasferire circa 25 mg di polvere in una provetta fredda e immediatamente (per evitare lo scongelamento del tessuto polverizzato) aggiungere 0,8 ml di tampone di lisi (vedi Tabella 1) e disturbare la cella pipettando su e giù 25 volte rapidamente. </li><li> Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 1 min a 4 ° C per sedimentare detriti cellulari. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta e mantenere il tubo in ghiaccio per 15 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 5 minuti a 4 ° C a pellet nuclei e mitocondri. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Conservare il supernatante a -80 ° C per un massimo di 6 mesi o utilizzare immediatamente. </li></ol></li><li> Saccarosio preparazione gradiente e centrifugazione (2 ore e 30 min) <ol><li> tubi ultracentrifuga Lavare a lungo con RNase-free acqua (acqua trattata dietilpirocarbonato (DEPC-acqua) o commerciale) di und 3% H 2 O / DEPC H soluzione 2 O 2. </li><li> Mettere i tubi in ghiaccio e aggiungere 5,5 ml di soluzione di saccarosio al 50% freddo nella parte inferiore di ciascun tubo (vedi Tabella 1 per soluzioni di saccarosio). Aggiungere con cautela la caduta di soluzione di saccarosio al 15% a goccia, rimanendo vicino al interfase per preservare un interfase tagliente, finché il tubo sia completamente riempito. Quando il tubo viene riempito completamente, chiuderla con un tappo di gomma per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> In una stanza fredda delicatamente fissare i tubi in orizzontale e tenerlo in questa posizione per 2 ore. Trascorso questo tempo, lentamente raddrizzare i tubi nella posizione verticale e metterli in ghiaccio. I gradienti sono ora pronti per essere utilizzati. In alternativa, preparare il gradiente di saccarosio 15-50% utilizzando un gradiente convenzionale ex. </li><li> In una stanza fredda rimuovere attentamente 1,0 ml dalla sommità del gradiente e sovrapporre la goccia di saccarosio a goccia con il lisato citosolica (cioè, il supernatante ottenuto in step 1.2). </li><li> Abbassare con cautela i tubi nei secchi di rotore oscillante. Centrifugare i gradienti per 100 min a 180.000 xg a 4 ° C usando un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Dopo la centrifugazione, lasciare i tubi in loro secchi per 20 min a 4 ° C per consentire ai gradienti stabilizzano. </li></ol></li><li> frazionamento gradiente di saccarosio (2 ore) <ol><li> Rimuovere con cautela un tubo ultracentrifuga dal rotore ultracentrifuge e montarlo sul dispositivo di raccolta di un gradiente di densità frazionamento del sistema. Raccogliere 1 ml frazioni di monitoraggio l&#39;assorbanza a 260 nm con una VIS ​​rivelatore UV / (vedi figura 1 pannello superiore). Mantenere le frazioni raccolte sul ghiaccio. </li><li> Preparare aliquote di 30-40 ml delle frazioni di interesse, tenerli in ghiaccio prima di riporli a -80 ° C fino all&#39;uso. Non utilizzare aliquote o frazioni di saccarosio che hanno subito più di due cicli di gelo-disgelo (vedi Figura 1 inferiore del pannello). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Preparazione del campione per la microscopia a forza atomica (3 ore) <ol><li> Con del nastro, staccare i fogli di mica. </li><li> Lavare i fogli di mica 3-4 volte con DEPC-acqua e metterlo in una piccola capsula di Petri. Quindi asciugare la superficie con l&#39;aria. </li><li> Coprire la mica con 200 ml di 1 mM Niso 4 e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione di nichel e poi asciugare la superficie con l&#39;aria. Eseguire tutte le fasi future a 4 ° C mettendo la piastra di Petri con la mica su ghiaccio. </li><li> Scongelare una aliquota ottenuta in 1.4.2 su ghiaccio e delicatamente aggiungere tutti della goccia campione goccia sulla mica. Utilizzando una punta 100-200 microlitri, spalmare il campione su tutta la superficie della mica. Incubare il campione in ghiaccio per 3 min. </li><li> Coprire la goccia foglio di mica a goccia con 200 ml freddo Buffer-AFM (vedi Tabella 1) e incubare per 1 ora su ghiaccio. </li><li> Imaging a liquido <ol><li> Rimuovere con attenzione il Buffer-AFM e lavare i fogli di mica 3-4 tempos con 200 ml freddo Buffer-AFM per rimuovere l&#39;eccesso di saccarosio. Poi lavare i fogli di mica 3 volte con tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1), lasciando la superficie di mica ricoperta da alcuni microlitri di soluzione. </li><li> Vai al punto 3 (acquisizione immagine). </li></ol></li><li> Imaging in aria <ol><li> Rimuovere con cautela il Buffer-AFM e lavare la mica 3-4 volte con 200 pl freddo Buffer-AFM per rimuovere l&#39;eccesso di saccarosio. Poi, lavare il mica 3 volte con soluzione di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1) e scaricare l&#39;acqua in eccesso con carta. </li><li> Lasciare asciugare il campione sotto il cofano chimica con la parte superiore della scatola di Petri parzialmente aperta. Dopo 2 ore, chiudere la piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente. Misurare il campione dopo 2-3 ore come sono stabili per anni. </li></ol></li></ol> 3. Acquisizione di immagini (15 min per immagine dopo la stabilizzazione termica) Nota: polisomi immobilizzati su mica possono essere esposte in aria o in liquido, utilizzando la modalità AC. <ol><li> Fissare la mica a supporto del campione con del nastro biadesivo. </li><li> Inserire il supporto del campione nella fase AFM seguendo le indicazioni del produttore. Quando l&#39;imaging in liquido, se possibile, cercare di mantenere il campione ad una temperatura inferiore a 25 ° C per aumentare polysome stabilità nel tempo. </li><li> Selezionare un cantilever adatta per l&#39;imaging CA e montarlo sul supporto punta seguendo le indicazioni del produttore. Qui, l&#39;uso cantilever con forza costante tra 2-20 N / m per l&#39;imaging e l&#39;aria intorno a 0,1 N / m per l&#39;imaging liquido. </li><li> Regolare il punto laser sulla mensola e azzerare i segnali rivelatori quadrante. </li><li> Selezionare una frequenza di pilotaggio opportune e guidare il cantilever con un&#39;ampiezza di 10-20 nm. </li><li> Approccio il campione fino a quando la punta impegna la superficie. </li><li> Selezionare un&#39;area di scansione di 2x2 micron, acquisire almeno 512x512 pixel immagini (larghezza in pixel &lt;4 nm), selezionare una modalità di sottrazione dello sfondo dal vivo e una scala Z di 20-25 nm. </li><li> ispezionare tsi cerca di immagine per la presenza di oggetti rotondi caratterizzati dalla altezza tra 10 e 15 nm quando l&#39;acquisizione in aria e 25 e 30 nm quando nel liquido e la larghezza nell&#39;intervallo 25-30 nm. Regolare i parametri di setpoint e un giudizio fino ad oggetti appuntiti sono visualizzati. Lo sfondo deve apparire relativamente piatta in buoni campioni, con alcuni oggetti di altezza 2-4 nm (vedi Figura 2A e B). </li><li> Se l&#39;immagine sembra buono (come indicato al punto 3.8), acquisire diversi (almeno dieci) scansioni 2x2 micron a diverse aree campione. </li><li> (opzionale). Se necessario, acquisire immagini ad alta risoluzione di polisomi selezionati (vedi Figura 2C). </li><li> Applicare correzioni software (piano sottrazione e line-by-line algoritmi di correzione) per correggere le immagini AFM rimozione inclinazione arbitraria e alla deriva effetti. </li></ol> 4. Analisi dei dati (30 min per immagine) <ol><li> esportare immagini in ImageJ (opzionale: applicare un fattore di scala) Preferentbuona resa utilizzando un formato di compressione senza perdita di dati, ad esempio, il formato TIFF (vedi Figura 3A). </li><li> Utilizzare la macro set di strumenti RiboPick.ijm ImageJ (da copiare nella macro / set di strumenti sottodirectory ImageJ) per contare ribosomi in polisomi (vedi Figura 3B) e calcolare le proprietà statistiche del campione (vedi Figura 3C). <ol><li> Inizia il caricamento di un&#39;immagine utilizzando il &lt;Leggi image&gt; strumento che inizializza il programma. </li><li> Scegli i centri ribosoma con il &lt;selezione Point&gt; standard di ImageJ strumento (shift + click sinistro consente la selezione multipla dei ribosomi). Segnare i ribosomi selezionati con il &lt;Mark ribosomi&gt; strumento. coordinate Ribosoma verranno visualizzati in una finestra di testo personalizzato. </li><li> Aggiungere più ribosomi allo stesso polysome ripetendo la procedura indicata al punto 4.2.2. </li><li> Rimuovere ribosomi erroneamente contrassegnati con l&#39;&lt;Annulla l&#39;ultima scelta&gt; strumento (inizia la rimozione dall&#39;ultimo ribosoma aggiunto al primo212; nel polysome corrente). </li><li> Quando la polysome è completata, utilizzare il &lt;Nuovo polysome&gt; strumento. Come si aggiunge il numero polysome come una sovrapposizione all&#39;immagine, viene aggiornata la finestra di testo. </li><li> Utilizzare il &lt;Salva risultati e vicino&gt; di scrivere il ribosoma un&#39;immagine PNG che riassume ribosomi e polisomi la raccolte di file (le unità predefinite dell&#39;immagine vengono utilizzati) e coordina. L&#39;immagine originale è chiuso senza essere salvato. </li></ol></li></ol>

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<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

Poiché la struttura del DNA è stato dimostrato di essere di fondamentale importanza per descrivere il processo di trascrizione e l&#39;organizzazione della cromatina avanzata nostra comprensione di controllo trascrizionale dell&#39;espressione genica, è essenziale analizzare l&#39;organizzazione e la struttura dei polisomi per migliorare la comprensione veritiera della traduzione e la sua regolazione. Con il protocollo descritto, una densità ottimale di polisomi delicatamente immobilizza...

La sintesi delle proteine ​​è la più processo consumo di energia nelle cellule 1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine ​​sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che 3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono 6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi 14- 16, le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia di polisomi è verificato un interesse limitato. Di conseguenza, l&#39;organizzazione del complesso polisomale ribonucleoproteico nativo e il suo potenziale effetto sulla traduzione sono ancora problemi piuttosto oscuri. Polisomi possono nascondere ancora organizzazioni ordinate e funzionali sconosciuti, potenzialmente mirroring quali nucleosomi e Contro epigeneticols hanno rappresentato per il campo di trascrizione. In effetti, l&#39;indagine di questa ipotesi intrigante richiede ulteriori studi e nuovi approcci tecnici. In questa linea, le tecniche strutturali e microscopia a forza atomica possono proficuamente collaborare per svelare nuovi meccanismi per il controllo dell&#39;espressione genica, in modo simile a quanto realizzato per il nucleosoma 17,18. Dalla scoperta del ribosoma 14-16, la sua struttura è stata ampiamente caratterizzata procarioti 19,20, lievito 21 e più recentemente in umano 22, fornendo la descrizione molecolare dei meccanismi alla base della sintesi proteica. Polisomi sono stati inizialmente rilevati sulla membrana del reticolo endoplasmatico, formando organizzazioni geometriche 2D tipici 14. Come accennato prima, polysome assembly non è stato oggetto di interesse costante come la struttura ribosoma. In passato, polisomi sono stati studiati essenzialmente trtecniche asmissione EM-based. Solo di recente, le tecniche di crio-EM hanno consentito la ricostruzione 3D della polisomi purificati dai sistemi in vitro di traduzione 23-26, lisati cellulari umani 27 o 28 nelle cellule. Queste tecniche offerto informazioni più raffinata sull&#39;organizzazione ribosoma-ribosoma in polisomi 23, 26-28 e una descrizione molecolare preliminare delle superfici di contatto dei ribosomi adiacenti in polisomi germe di grano 24. Così, Cryo-EM tomografia permette la divulgazione delle interazioni ribosoma-ribosoma con dettaglio molecolare, ma è gravata da un ampio post-elaborazione e analisi di ricostruzione che richiedono risorse di calcolo pesanti per la gestione dei dati. Inoltre, per ottenere dettaglio molecolare delle interazioni ribosoma-ribosoma, è necessaria una mappa altamente risolto del ribosoma, e questo tipo di ribosoma riferimento è disponibile solo per poche specie. È importante sottolineare che, Cryo-EM tomografia non è in grado di rilevare l&#39;RNA libero. Therefminerale, nuove tecniche sono necessari per comprendere appieno l&#39;organizzazione della macchina di traduzione. Accanto a Cryo-EM, AFM è stato anche impiegato come uno strumento utile per l&#39;imaging diretto di polisomi negli eucarioti inferiori 29-33 e gli esseri umani 27. Rispetto a EM, AFM non richiede la fissazione del campione o l&#39;etichettatura. Inoltre, le misurazioni possono essere eseguite in condizioni fisiologiche vicino e con la possibilità unica di individuare chiaramente sia ribosomi e filamenti di RNA nudi 27. Imaging singoli polisomi può essere eseguita in tempi relativamente brevi, ottenendo migliaia di immagini a nano risoluzione con poco sforzo di post-trattamento rispetto al vasto e pesante post-elaborazione e ricostruzione delle analisi previste dalla crioconservati microscopia-EM. Di conseguenza, AFM manipolazione e l&#39;analisi dei dati non ha bisogno di posti di lavoro costosi e potenza di calcolo. Come tale, questa tecnica raccoglie informazioni su forme polisomale, caratteristiche morfologiche (ad esempioaltezza, lunghezza e larghezza), densità ribosoma, la presenza di RNA libero e il numero dei ribosomi per polysome 27 con un volume maggiore di crio-EM. In tal modo, AFM rappresenta un approccio potente e complementare alle tecniche EM per ritrarre polisomi 27. Qui vi presentiamo una pipeline completa da purificazione per l&#39;analisi dei dati in cui AFM viene applicata all&#39;immagine e analizzare il mouse polisomi cerebrali. Il protocollo proposto concentra sui problemi di depurazione e sulla deposizione accurata di polisomi su substrati mica che vengono utilizzati per l&#39;imaging AFM. Oltre all&#39;analisi delle particelle convenzionale che può essere facilmente effettuata con il software comune usato dalla comunità AFM, un plugin ImageJ 34, chiamato RiboPick, viene presentato per il conteggio del numero dei ribosomi per polysome 27, 35.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Sucrose gradient preparation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Polyallomer tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Sucrose gradient fractionation</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

Il meccanismo di traslazione, cioè il polysome o polyribosome, è uno dei più grandi e complessi macchinari citoplasmatici nelle cellule. Polisomi, formate dai ribosomi, mRNA, diverse proteine ​​e RNA non codificanti, rappresentano le piattaforme in cui i controlli di traslazione avvengono integrati. Tuttavia, mentre il ribosoma è stato ampiamente studiato, l&#39;organizzazione di polisomi è ancora carente comprensione globale. Così molto sforzo è necessaria per chiarire organizzazione polysome e ogni nuovo meccanismo di controllo traduzionale che potrebbe essere incorporato. microscopia a forza atomica (AFM) è un tipo di scansione di sonda microscopio che permette l&#39;acquisizione di immagini 3D con risoluzione nanometrica. Rispetto alle tecniche di microscopia elettronica (EM), uno dei principali vantaggi di AFM è che può acquisire migliaia di immagini sia in aria ed in soluzione, consentendo il campione da mantenere in condizioni fisiologiche vicino senza alcuna necessità di colorazione e fissaggio proprocedure. Qui, un protocollo dettagliato per la purificazione accurata polisomi da cervello di topo e la loro deposizione su substrati di mica è descritto. Questo protocollo permette l&#39;imaging polysome in aria e liquidi con AFM e loro ricostruzione come oggetti tridimensionali. Complementare alla microscopia crioelettronica (crio-EM), il metodo proposto può essere comodamente utilizzato per analizzare sistematicamente polisomi e studiare la loro organizzazione.

Il saccarosio gradiente polisomale profiling dell&#39;intero cervello di topo È possibile purificare polisomi da un lisato cellulare mediante profilatura polisomale, che separa macromolecole conformemente al loro peso e dimensioni. Con profiling polisomale, lisati citoplasmatici ottenuti da cellule o tessuti coltivati, come in questo esempio, vengono caricati su un gradiente di saccarosio lineare e trattati d...

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Ricerca

Bioingegneria

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Microscopia a forza atomica di Red-Light Fotorecettori Uso della mappatura PeakForce Quantitative nanomeccanico Proprietà

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Ingegneria

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochimica

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Immunologia e infezioni

 Imaging Polysomes Isolated from a Mouse Brain Using Atomic Force Microscopy

Source: Lunelli, L.,&#160;et. al. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy.&#160;J. Vis. Exp.(2016).This video demonstrates the imaging of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Synaptic & Cellular Imaging

Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, polymers, and biological samples. AFM offers over 1000 times more resolution than the optical imaging system. Images generated from AFM are three-dimensional surface profiles, offering an advantage over the flat, two-dimensional images from other imaging techniques.
The AFM Probe
The probe is regarded as the heart of any AFM setup and comprises the cantilever and tip assembly. Probes are the most commonly replaced part on this type of microscope because&#160; the constant interaction with the samples wears down the tip. Therefore, the choice of material for the probe depends on the properties of the sample. Silicon probes, used to analyze hard samples, are stiffer and sharper than silicon nitride probes, which are better suited to scan softer samples. These sharp tips are produced using electrochemical etching or carbon nanotubes for higher accuracy analysis.
Imaging Modes of AFM
In AFM, surface topography is studied using the interaction between the probe tip and the sample surface. There are two main imaging modes &#8212; a static mode, also referred to as the contact mode, and a dynamic mode.
In the static or contact mode, the tip of the probe is in continuous contact with the sample surface. As the tip drags over the surface, repulsive forces between the sample and the tip result in the cantilever bending, which is recorded. The entire specimen surface is scanned back and forth in both x- and y-axes, called raster scanning, while the vertical movement of the cantilever records the z-axis, thus generating a 3D image.
In the dynamic mode, the probe oscillates just above the sample surface, coming close to, but not touching the surface. Attractive and repulsive forces determine the variation in distance between the tip and the sample, affecting the amplitude of cantilever oscillation. This feedback is recorded to construct the surface topography of the sample.

Microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, ...