Name: selective harvesting of marginating-hepatic leukocytes
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
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The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) a Tel-Aviv. 1. I ratti protocollo <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare la soluzione eparinizzata PBS (30 unità / ml) da utilizzare a temperatura ambiente (RT) con l&#39;aggiunta di 30 unità di conservanti eparina libera per ml di tampone fosfato (PBS) 1x soluzione. Calcolare 35 ml per animale. </li><li> Passare eparinato PBS attraverso le linee di pompe peristaltiche e gli aghi a farfalla per eliminare le bolle d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici - 2 paia di forbici, pinze smussato taglio, 2 emostatiche, pinze e dente-tessuto (autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco)). </li></ol></li><li> Perfusione del fegato e raccolta di MH-leucociti <ol><li> Eutanasia l&#39;animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Per precauzione, posizionare un tubo da 50 ml contenente una isofluranopad -soaked intorno alla testa ratto fino aprendo la sua cavità toracica. </li><li> Aprire le cavità peritoneale e al torace per esporre il fegato e il complesso cardiopolmonare immediatamente al momento della cessazione della respirazione. Evitare di sanguinamento attraverso questo processo. <ol><li> In particolare, avviare l&#39;incisione in corrispondenza del punto della linea mediana addominale inferiore, senza danneggiare gli organi interni, e di progresso per entrambe le parti in diagonale verso le costole, il taglio attraverso di loro a livello del torace cavità superiori. </li></ol></li><li> All&#39;interno di circa un minuto, raccogliere più sangue possibile (~ 6 ml da un animale 250 g) dal ventricolo destro in una siringa. </li><li> Fissare la vena cava caudale con una pinza emostatica il più vicino possibile al cuore, per consentire la raccolta del perfusato. </li><li> Estrarre l&#39;intestino e posto al di fuori l&#39;animale a destra dello sperimentatore, per esporre la vena porta. </li><li> Inserire un catetere 25 G IV, collegata ad una pompa peristaltica, nella vena porta, come caudali possibile,ma rostrale alla vena splenica. </li><li> Inserire un ago G 25 farfalla, collegato ad una siringa da 5 ml, nella vena cava inferiore, caudalmente alla hemostat. </li><li> Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 3 ml / min e raccogliere delicatamente i primi ml di perfusato che sono contaminati con il sangue nella siringa. Continuare fino a quando il colore perfusato è impallidisce rosso (circa 3-5 ml). Si noti che il colore del fegato cambia verso marrone chiaro. </li><li> Senza fermare la pompa peristaltica, sostituire la raccolta siringa da 5 ml con una siringa da 20 ml raccolta e raccogliere almeno 20 ml di perfusato fegato impiegando una maggiore velocità di perfusione (fino a 4 ml / min). Monitorare costantemente il flusso perfusato nella siringa di raccolta, e di evitare il vuoto che è troppo forte (che può ostruire l&#39;ago attraverso crollare le pareti vena cava). </li><li> Termina perfusione quando il colore del fegato si rivolge a marrone chiaro. </li></ol></li><li> I leucociti Estrazione <ol&gt; <li> Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 xg, 24 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS, centrifugare a 400 xg per 10 minuti, e aspirare il surnatante. Sulla base di obiettivi di studio, usare la preparazione come è, o condurre purificazioni supplementari (ad esempio, la separazione in gradiente di densità). <ol><li> In particolare, lo strato 4 ml di perfusato oltre 4 ml di massa separazione in gradiente di densità in un 50 cc tubo di polipropilene centrifuga. Spin le provette a 754 xg, RT, per 30 minuti con la rottura off. </li><li> Ottenere gli strati mononucleari all&#39;interfaccia in gradiente di densità di separazione-surnatante pipettando manuale, lavare in PBS, e inserire in una provetta da 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Il protocollo del mouse <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare la soluzione eparinizzata PBS (30 unità / ml) da utilizzare a temperatura ambiente (RT) con l&#39;aggiunta di 30 unità di conservanti eparina libera per ml di tampone fosfato (PBS) 1x solution. Calcolare 20 ml per animale. </li><li> Passare eparinato PBS attraverso le linee di pompe peristaltiche e gli aghi a farfalla per eliminare le bolle d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici - 2 paia di forbici, pinze smussato taglio, 2 emostatiche, pinze e dente-tessuto (autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco)). </li></ol></li><li> Perfusione del fegato e raccolta di MH-leucociti <ol><li> Eutanasia l&#39;animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Per precauzione, posizionare un tubo da 15 ml contenente un tampone imbevuto isoflurano-intorno alla testa del mouse fino a quando aprendo la sua cavità toracica. </li><li> Fissare le membra del mouse per un letto. </li><li> Aprire le cavità peritoneale e al torace per esporre il fegato e il complesso cardiopolmonare immediatamente al momento della cessazione della respirazione, mantenendo l&#39;aspetto inferiore del diaframma intatto (per creare un pool di scarico cavità toracica). Evitare di sanguinamento attraverso questo processo. <ol><li> In particolare, iniziare l&#39;incisione al minorepunto addominale linea mediana, senza danneggiare gli organi interni, e di progresso per entrambe le parti in diagonale verso le costole, il taglio attraverso di loro a livello del torace cavità superiori. </li></ol></li><li> Ritiro l&#39;intestino e posto al di fuori l&#39;animale a destra dello sperimentatore, per esporre la vena porta. </li><li> Inserire un ago 30 g, collegata ad una pompa peristaltica nella vena rostrale alla vena splenica. </li><li> Tagliare la vena cava inferiore sopra il diaframma per permettere il drenaggio e la raccolta del perfusato dalla cavità toracica. </li><li> Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 3 ml / min e raccogliere delicatamente il primo 3 ml di perfusato che sono contaminati con il sangue dal pool cavità toracica. </li><li> Eliminare questo perfusato. Ripetere tale lavaggio di nuovo, se necessario, utilizzando soluzione fisiologica, e solo allora iniziare a raccogliere perfusato fegato. </li><li> Ri-avviare la perfusione ad una velocità fino a 4 ml / min, e raccogliere 10 ml di perfusato dalla cavità toracica utilizzandouna farfalla collegata ad una siringa. </li><li> Termina perfusione quando il colore del fegato si rivolge a marrone chiaro. </li></ol></li><li> I leucociti Estrazione <ol><li> Centrifugare il perfusato per 10 min a 400 x g. </li><li> Aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS, centrifugare a 400 xg per 10 minuti, e aspirare il surnatante Sulla base di obiettivi di studio, usare la preparazione come è, o condurre ulteriori purificazioni (ad esempio, la separazione in gradiente di densità). <ol><li> In particolare, lo strato ogni 4 ml di perfusato oltre 4 ml di massa separazione in gradiente di densità in un 50 cc tubo di polipropilene centrifuga. Spin le provette a 754 xg, RT, per 30 minuti con la rottura off. </li><li> Ottenere gli strati mononucleari all&#39;interfaccia in gradiente di densità di separazione-surnatante pipettando manuale, lavare in PBS, e inserire in una provetta da 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats:+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells.">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li><li>Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics.">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).</li><li>Wisse, E., van't Noordende, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver.">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li><li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis.">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li><li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+phenotyping,+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver.">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li><li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+(pit+cells)+in+rat+liver+sinusoids.">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li><li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo di perfusione epatica presentato qui permette una raccolta selettiva e lo studio della popolazione unica di marginating leucociti epatici. NK cellule epatiche, anche chiamate cellule pit 3, costituiscono una popolazione di cellule NK distintivo che risiedono nei sinusoidi epatici. Si trovano in ratti, topi e negli esseri umani 17 18,19. Rispetto al isolate cellule NK periferico, cellule pit dimostrato superiore citotossicità contro YAC-1 e CC531s linee cellulari bersaglio 20, hanno mostrato di avere un maggior numero di piccoli granuli citoplasmatici 20, e una più alta espressione di antigeni di superficie, come LFA-1 12 . Inoltre, a differenza delle cellule NK del sangue isolate, le cellule del pozzo possono lisare cellule P815 NK-resistenti. Simili topo cellule epatiche fossa, cellule NK umane hanno una citotossicità più alto rispetto cellule bersaglio K562 NK-sensibili rispetto alle cellule NK 18,19 circolanti, e hanno mostrato di cellule bersaglio NK-resistenti Lyse 18. Overall, come il fegato è specificamente e unicamente coinvolti in varie malattie, l&#39;immunità dovrebbe essere studiato all&#39;interno di questo organo, e le cellule del compartimento MH deve essere distinta da parenchimale, Kupffer e cellule stellate. Come elaborato nell&#39;Introduzione, il nostro approccio è vantaggioso perfusione negli / procedure di degradazione comuni meccaniche di rettifica biologici in modo selettivo che raccolgono leucociti MH, e in meglio preservare l&#39;integrità, l&#39;attività e l&#39;ambiente fisiologico dei leucociti MH. Infatti, la valutazione NK citotossicità, leucociti MH raccolte tramite il nostro approccio mostrato una nettamente superiore citotossicità NK di leucociti raccolti attraverso la procedura di macinazione meccanica, nonostante numero simile di cellule NK. La tecnica di perfusione epatica è utilizzabile solo negli studi sugli animali. differenze Tuttavia, approfondimenti specifici ottenuti da questo approccio per quanto riguarda marcato tra comparti del sistema immunitario possono mettere in discussione l&#39;biologicaAl e significato clinico delle osservazioni basate esclusivamente su leucociti circolanti. Gli studi su animali che misurano indici immunitari in differenti compartimenti immunitarie possono suggerire il grado in cui ciascun indice immunologica nella circolazione riflette o correlato con i suoi livelli nel vano MH. Un&#39;osservazione interessante riferisce ad impiegare questa tecnica nei topi, in cui le cellule NK MH-perfusi dimostrano soltanto significativa attività citotossica contro cellule bersaglio a seguito di un a-priori stimolazione immunitaria dell&#39;animale 21. Pochi aspetti critici della tecnica devono essere indicati. In entrambi i ratti e topi, la cavità toracica deve essere aperto ampiamente subito dopo completa cessazione della respirazione, e con minimo sanguinamento. Nei ratti, è consigliabile quantità massima di sangue cardiaca viene ritirata prima della perfusione. Nei topi, non è consigliabile per il sangue prelevato dal cuore, in quanto riduce la pressione del sangue nella vena porta erende più difficile inserire l&#39;ago attraverso di essa per continuare il processo. Questo inserimento dell&#39;ago dovrebbe essere adiacente ma rostrale alla vena splenica, come si vuole garantire che la distanza tra l&#39;inserimento all&#39;ingresso della vena porta nel fegato è sufficiente per l&#39;ago sia in posizione stabile e permette a tutto il lobi per ottenere perfusi. L&#39;ago deve essere inserito nella vena portale, parallelamente alla sua superficie, in modo che il rischio di rottura della parete del vaso è minimizzato. Nei ratti, mentre l&#39;inserimento di un ago per la vena cava caudale per la raccolta del perfusato, è fondamentale mantenere il punto di ingresso più stretto possibile per evitare una potenziale perdita di perfusato. Nei topi, è importante precocemente tagliare la vena cava all&#39;interno della cavità toracica senza rompersi altri vasi sanguigni o dei polmoni, al fine di evitare la contaminazione del sangue inutili. Il principale vantaggio di utilizzare una pompa peristaltica è un controllo stabile del tasso di perfusione, all&#39;interno e traanimali. È importante mantenere una portata bassa durante l&#39;intero procedimento al fine di evitare la rottura della vena porta. Come la prima porzione di perfusato fegato sono contaminati con il sangue, devono essere eliminate come indicato. Per ottenere la standardizzazione tra gli animali, il criterio per iniziare a raccogliere il perfusato MH si basa sulla transizione di colore dal marrone scuro al marrone chiaro (piuttosto che la raccolta di un volume specifico). Lungo della procedura, possono verificarsi malfunzionamenti diversi, ma la maggior parte sono reversibili. Se l&#39;ago attraverso il quale il PBS è trasfuso nel fegato scivola fuori, si raccomanda di fermare la pompa peristaltica, bagnare la zona intorno del budello (per ottenere una migliore visibilità), re-inserire l&#39;ago in una posizione leggermente più rostrale, e ri-avviare la pompa. La tecnica di perfusione epatica qui descritta permette una raccolta selettiva della popolazione leucocitaria MH in un processo abbastanza semplice. Datoche questa popolazione mostra caratteristiche distintive rispetto ai leucociti di altri comparti del sistema immunitario, e può avere significato biologico e clinico per l&#39;organismo, si consiglia l&#39;uso di questo metodo quando fattibile, come leucociti provenienti da altri compartimenti non possono riflettere il profilo della popolazione MH. Inoltre, come questa tecnica non è fattibile in esseri umani, abbiamo ulteriormente suggeriamo impiegare in animali chiarire specifici biomarker circolanti che correlano con le caratteristiche MH, soprattutto quando si studiano i processi e malattie epatiche legate.

I sinusoidi epatici contengono numerosi sottotipi di leucociti di varie attività immunitarie critici per l&#39;organismo. linfociti Ad esempio, marginating epatica (MH) natural killer (NK), noto anche come celle fossa, sono caratterizzati morfologicamente come grandi granulari (LGLs) e funzionalmente come leucociti con capacità citotossica spontanea, consentendo epatica resistenza contro l&#39;istituzione di sangue- metastasi tumorali a carico. L&#39;obiettivo del metodo qui presentato è quello di consentire la raccolta selettiva dei leucociti MH, al fine di studiare questa popolazione cellulare importante ed unico (e vano immunitario), e per chiarire l&#39;impatto delle varie manipolazioni (ad esempio attivazione immunitaria) su queste cellule specifiche. Nonostante il fallimento di immunità per eliminare un tumore primario in via di sviluppo, prove in pazienti affetti da cancro e modelli animali indicano che il sistema immunitario in grado di controllare le cellule tumorali, micrometastasi e malattia residua throu circolantiGH immunità cellulo-mediata (CMI). Tuttavia, vi è una contraddizione apparente tra questi in capacità vivo e in vitro negli esseri umani e negli animali, che dimostrano che la maggior parte delle cellule tumorali autologhe sono resistenti alla citotossicità dai leucociti splenici 1,2 circolanti o. Questa incoerenza può essere attribuita, almeno in parte, l&#39;esistenza in vivo di una distinta sottopopolazione leucocitaria, cioè i (sinusoidi) leucociti marginating-epatico e la sottopopolazione di cellule NK attivate, ovvero cellule pit 3. Infatti, dati non pubblicati dal nostro laboratorio hanno indicato che nei ratti F344 cellule tumorali singenici (MADB106), che sono stati trovati resistenti alla circolazione e milza leucociti, sono stati lisati dalle cellule NK MH-4. Così, le cellule tumorali che sono presumibilmente &quot;NK-resistente&quot; leucociti circolanti possono essere comandate da cellule MH-NK. Degno di nota, nei topi l&#39;attività maggiore di MH-NK è evidente solo dopo in vivo immunitariostimolazione (ad esempio attraverso l&#39;uso di Poly I: C o CpG-C) 5. Le cellule NK-specific fegato (MH-NK) sono situati all&#39;interno del lume sinusoidali, aderendo alle cellule endoteliali e cellule di Kupffer. Cellule NK-MH sono caratterizzati esclusivamente da granuli densi sferici e vescicole asta animato 6, che contengono la fosfatasi acida come enzimi lisosomiali, e perforina e granzimi come sostanze bioattive 7,8. Rispetto alle cellule NK circolanti, cellule NK-MH presentano un maggior numero e le dimensioni dei granuli e vescicole 9-11. In condizioni infiammatorie, cellule NK-MH hanno dimostrato di esibire espressione maggiore di LFA-1 12, rispetto alle cellule NK circolanti. Questa espressione maggiore potrebbe costituire un meccanismo attraverso il quale le cellule NK-MH sono più citotossica nei confronti di alcune cellule tumorali rispetto alle cellule NK 13,14 circolanti. nterestingly, dopo incubazione in vitro con interleuchina (IL) -2, cellule NK-MH diventano allargata, eil loro numero e le dimensioni dei granuli aumentano, che sono tutti coerenti con un pro fi lo di assassino linfochine attivato cellule 15 (LAK). leucociti MH attivi non possono essere ottenuti esclusivamente attraverso i metodi di raccolta dei leucociti del fegato standard, che si basano sulla macinazione e degradazione biologica del tessuto. Il nostro approccio perfusione descritto ha due importanti vantaggi rispetto agli approcci standard. Innanzitutto, l&#39;approccio perfusione raccoglie selettivamente leucociti MH, prevenire la contaminazione da altri leucociti da altri compartimenti fegato. In secondo luogo, la tecnica di perfusione meglio preserva l&#39;integrità, l&#39;attività e l&#39;ambiente fisiologico dei leucociti MH, a differenza del trattamento tessuti approcci che danneggiano le cellule o alterare la loro morfologia, ea causa di danni ai tessuti, induce il rilascio di vari fattori che marcatamente modulano immunitario attività. Il fegato è un importante organo bersaglio per le metastasi del cancro unaND per varie infezioni 16. Come le cellule MH presentano caratteristiche uniche, è importante studiare questa specifica popolazione in varie condizioni rispetto a queste patologie. Ad esempio, è degno di nota che l&#39;attivazione immunitaria sistemica da vari BRM (ad esempio poli I: C o CpG-C) hanno dimostrato di attivare MH-leucociti più di leucociti 5 circolanti.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4&quot;</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Blunted-edged forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selective harvesting of marginating-hepatic leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Nei ratti F344 abbiamo confrontato la citotossicità delle cellule NK-MH (raccolti dai sinusoidi epatici di perfusione del fegato forzata) alla citotossicità di tutta la popolazione di cellule epatiche dopo macinazione meccanica del tessuto epatico, e la citotossicità dei leucociti circolanti. Tutte le preparazioni cellulari sono stati lavati almeno 3 volte, come di routine in saggi immunologici, e come linee cellulari obiettivo che abbiamo usato il le linee di cellule bersaglio MADB106 singenici allogenico YAC-1 o. Come indicato nelle figure 1 - 4, mentre le cellule MH-NK esposte profonda citotossicità contro il MADB106 e le linee di cellule YAC-1 bersaglio (~ 80% e fino rispettivamente al 100%), sia l&#39;intera popolazione di cellule epatiche (Figura 1) e circolanti leucociti (figure 2 e 3) visualizzati i livelli più bassi di profondamente citotossicità, e quasi nessuna uccisione contro la linea di cellule bersaglio MADB106 singenici. Lo stesso relative bassi livelli di citotossicità erano evidenti quando fegati trasformati meccanicamente anche sottoposti a lavaggio e la densità di separazione gradiente (figura 4), ​​livelli che sono tipici nella letteratura. Così, le cellule NK-MH presentano unicamente elevati livelli di citotossicità in ratti F344. FACS analisi è stata condotta e ha rivelato profonde differenze nella composizione dei seguenti sottopopolazioni di cellule: i monociti (CD161dim), cellule NK (CD161 luminosi), cellule T (CD3), le cellule B (CD45), e le cellule NKT (CD161 e CD3). Le principali differenze nel profilo di maturazione (CD11b / CD27) erano evidenti anche tra i diversi comparti (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig1.jpg" /> Figura 1: un confronto della citotossicità delle cellule NK-MH, per citotossicità di tutto il fegato cellulare Popolazione (YAC-1 Target linea cellulare) delle cellule NK-MH (raccolte dal MH-vano throu.gh l&#39;approccio descritto nel presente documento) esposto profonda attività citotossica contro la linea cellulare di destinazione YAC-1, mentre l&#39;intera popolazione di cellule epatiche, raccolti tramite lavorazione meccanica del fegato, visualizzata livelli minimi (p &lt;0.05). l&#39;asse X rappresenta il rapporto effettore-to-target le cellule. I dati sono presentati come media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53918/53918fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig2.jpg" /> Figura 2: Un confronto della citotossicità delle cellule NK-MH, di citotossicità di circolazione leucociti (YAC-1 Target linea cellulare). cellule NK-MH (raccolte dal MH-vano attraverso l&#39;approccio descritto nel presente documento) hanno mostrato profonda citotossicità contro la linea di cellule bersaglio YAC-1, mentre i leucociti circolanti visualizzati livelli minimi di citotossicità(P &lt;0.05). l&#39;asse X rappresenta il rapporto effettore-to-target le cellule. I dati sono presentati come media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53918/53918fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig3.jpg" /> Figura 3:. Un confronto della citotossicità delle cellule MH-NK, di citotossicità di circolazione Leucociti (MADB106 target linea cellulare) delle cellule MH-NK (raccolte dal MH-vano attraverso l&#39;approccio qui descritto) esposto profonda citotossicità contro il MADB106 singenici indirizzare linea cellulare, mentre leucociti circolanti visualizzati livelli minimi di citotossicità (p &lt;0.05). l&#39;asse X rappresenta il rapporto effettore-to-target le cellule. I dati sono presentati come media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53918/53918fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui t</a>o vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig4.jpg" /> Figura 4: un confronto della citotossicità delle cellule NK-MH, per citotossicità di tutto il fegato linfociti, che è stato lavato e da questa arricchita in gradiente di densità di separazione (YAC-1 linea di cellule bersaglio) cellule MH-NK (raccolte dal MH-. vano attraverso l&#39;approccio qui descritto) espone profonda citotossicità contro la linea cellulare di destinazione YAC-1, mentre l&#39;intero linfociti epatici (seguenti lavorazioni meccaniche, che è stato lavato ed arricchita attraverso la separazione in gradiente di densità), visualizzati significativamente più bassi livelli di citotossicità (fino a 30%) (p &lt;0.05) che sono tipici nella letteratura. l&#39;asse X rappresenta il rapporto effettore-to-target le cellule. I dati sono presentati come media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53918/53918fig4large.jpg" target="_blank">Si prega</a>clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig5.jpg" /> Figura 5:. Un confronto di mononucleate sottopopolazioni cellulari e sottogruppi di cellule NK Dalla circolazione Mononuclear, l&#39;MH-Mononuclear, e l&#39;intero cellule del fegato mononucleate FACS analisi mostra chiare differenze nella composizione dei seguenti sottopopolazioni di cellule: i monociti (CD161dim), le cellule NK (CD161 luminoso), le cellule T (CD3), le cellule B (CD45), e le cellule NKT (CD161 e CD3) nonché le differenze nel profilo di maturazione (CD11b / CD27) tra i diversi comparti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53918/53918fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.7K Views.  Tel-Aviv University. Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

L&#39;isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Biologia dello sviluppo

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

La raccolta selettiva di Marginating-polmonari leucociti

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Biologia

Realizzazione di colture LLEC in vitro mediante selezione cellulare magnetica

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Autore in primo piano: Svelare le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle cellule endoteliali linfatiche leptomeningee 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Neuroscienze

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Medicina

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

L'isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

La raccolta selettiva di Marginating-polmonari leucociti

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Protocollo per l'isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo