L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare un metodo ottimizzato per l'isolamento degli epatociti nei topi dopo epatectomia parziale senza la necessità di centrifugazione a gradiente di densità. Di solito vediamo una grande percentuale di epatociti carichi di lipidi durante la rigenerazione precoce. Quegli epatociti steatosici di solito persi con la centrifugazione del gradiente di densità a causa della bassa densità vengono mantenuti con questo protocollo.
Per preparare l'apparecchiatura di perfusione, collegare una cannula IUI calibro 26 all'estremità di uscita del tubo utilizzando un connettore Luer lock. Quindi lavare il tubo e inserire l'estremità di ingresso del tubo nel tubo tampone di perfusione preriscaldato nel bagno d'acqua. Innescalo con tampone di perfusione caldo a una velocità della pompa di tre millilitri al minuto.
Prima di procedere con l'intervento chirurgico, assicurarsi che il topo sia adeguatamente anestetizzato. Quindi pulire l'addome con una soluzione chirurgica di scrub e etanolo al 70%. Quindi tagliare le suture per riaprire l'incisione della linea mediana precedentemente effettuata per l'epatectomia parziale e separare delicatamente i bordi della ferita.
Se l'epatectomia è più vecchia di 24-48 ore, rimuovere la sutura e tagliare la pelle con le forbici o un bisturi. Utilizzare un divaricatore o semplici clip per mantenere l'addome aperto. La cavità addominale deve essere esposta il più possibile per ottimizzare l'accesso e la visualizzazione.
Fissare una sutura in polipropilene 5-0 allo sterno. Tirarlo cranialmente e fissarlo in questa posizione. Spostare l'intestino verso destra utilizzando tamponi di cotone sterili per rivelare la vena porta e la vena cava.
Utilizzare un panno umido per trattenere l'intestino. Posiziona un oggetto pesante di circa due centimetri di altezza come un anello di peso metallico adiacente alle zampe posteriori del topo. Quindi posizionare il tubo con la cannula IUI 26 gauge collegata sull'oggetto e posizionare l'ago con attenzione sopra la vena cava.
Regolare la lunghezza del tubo come richiesto. Trasferire la soluzione madre di collagenasi nel tubo tampone di digestione preriscaldato. Preparare da 10 a 20 millilitri di tampone di digestione per animale.
Accendere la pompa dopo aver regolato la velocità della pompa a tre millilitri al minuto. Scartare i primi due o tre millilitri del tampone di perfusione preriscaldato una volta che il tampone raggiunge l'ago. Per eseguire l'incannulamento della vena cava inferiore, utilizzare un batuffolo di cotone sterile per tirare delicatamente la vena cava caudalmente sotto la puntura in modo che la tensione fornita faciliti l'inserimento della cannula nella vena.
Inserire la cannula IUI di gauge 26 con un angolo poco profondo nella vena cava inferiore sotto il rene mentre il tampone scorre attraverso l'ago. Assicurarsi che la smussatura dell'ago punti verso l'alto. Cerca sangue nella camera flash del catetere quando l'ago entra nel lume.
Far avanzare l'ago di altri due o tre millimetri per assicurarsi che la punta del catetere entri nella vena. Far scorrere il catetere di plastica sopra l'ago e nella vena cava di altri cinque millimetri. Rimuovere l'ago lentamente e con molta attenzione.
Dopo due o tre secondi, cerca macchie bianche che si formano nel fegato o gonfiore della vena porta, che indica che il tampone di perfusione scorre attraverso il fegato ed entra nei lobuli del fegato dalla vena centrale. Attendere che la vena porta si gonfi visibilmente entro uno o due secondi dalle macchie bianche che si formano sulla superficie del fegato. Tagliare la vena porta con le forbici il più distalmente possibile dall'ilo del fegato.
Aumentare la portata da quattro a sette millilitri al minuto a seconda del peso dell'animale, delle dimensioni del fegato e dell'estensione dell'epatectomia iniziale. Bloccare la vena porta con una pinzetta o un morsetto vascolare per sette a 10 secondi. Assicurarsi che non vi sia alcun fluido che stia attraversando.
Eseguire un secondo morsetto dopo circa 30 secondi e assicurarsi che il fegato si gonfi e si rilassi. Continuare a sciacquare l'animale per tre o quattro minuti e osservare il tampone trasparente che fuoriesce dalla vena porta. Bloccare la vena porta per tre o quattro secondi prima che il tampone di digestione raggiunga il fegato.
Assicurarsi che il fegato si rilassi al rilascio del morsetto e che il liquido di perfusione rimanga chiaro. Una volta che il tampone di digestione raggiunge il fegato, bloccare nuovamente la vena porta. Il fegato non dovrebbe rilassarsi dopo il rilascio del bloccaggio.
Digerire per circa quattro minuti ad una portata di cinque millilitri al minuto. Man mano che la digestione progredisce, cerca segni del fegato che inizia a gonfiarsi e piccole sezioni trasparenti sulla superficie del fegato. Osserva che il fegato assume la consistenza di un pezzo di stoffa bagnato e appare quasi fradicio.
Sonda la consistenza toccandola con attenzione con un batuffolo di cotone umido e sterile. Continuare con la perfusione fino a quando non si può osservare una marcata differenza nella consistenza superficiale del fegato. Si osservi che il fegato assume un colore molto chiaro e un aspetto frizzante che indica la capsula di Glisson che si separa dal parenchima.
Interrompere la digestione non appena il fegato ha acquisito queste proprietà. Rimuovere l'ago prima che l'aria entri nel fegato. Afferrare il tessuto connettivo centrale tra i lobi usando una pinza e sollevarlo leggermente verso l'alto usandolo come punto di ancoraggio.
Tagliare tutte le connessioni del fegato ad altri organi e rimuovere la cistifellea. Rimuovere delicatamente il fegato dalla cavità addominale. Fai attenzione perché sarà fragile e fragile in questa fase.
Posizionare il fegato nel tampone di conservazione ghiacciato. Trasferire il fegato in una capsula di Petri di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di Williams'Medium E.Rompere la capsula di Glisson ghiacciata con pinzette a punta fine in alcuni punti lungo la superficie del fegato. Afferrare una parte centrale con due paia di pinzette.
Separarli lentamente, permettendo alla capsula di strappare senza danneggiare gli epatociti e rilasciare le cellule agitando delicatamente la capsula. Filtrare cinque millilitri di polpa di fegato attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Risciacquare il filtro con 10 millilitri di mezzo ghiacciato fresco e filtrare i restanti cinque millilitri di polpa attraverso il filtro cellulare.
Girare l'estratto a 50 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare la maggior parte del surnatante, lasciando un millilitro per risospendere le cellule ruotando delicatamente il tubo. Aggiungere 40 millilitri di Williams'E Medium freddo e ripetere il passaggio tre volte.
Procedere con l'isolamento degli epatociti come descritto nel manoscritto testuale. Dopo il 70% di epatectomia nei topi, la resa finale degli epatociti era di circa 10-15 x 10 al 6 ° con una vitalità finale media del 78%. Mentre dopo un'estesa epatectomia dell'86%, la resa degli epatociti era da quattro a nove x 10 al 6 ° con una vitalità media del 65%.
Dopo epatectomie parziali, gli epatociti mostrano un aumento delle dimensioni delle cellule rispetto ai fegati normali corrispondente ad un aumento del contenuto lipidico. Un aumento del contenuto lipidico è stato osservato negli epatociti murini 24 ore dopo l'epatectomia parziale, visto come un aumento della granularità o direttamente osservato dalla presenza di vescicole lipidiche all'interno di epatociti ingrossati. Durante l'utilizzo del classico metodo di purificazione del gradiente di densità, i grandi epatociti grassi sono stati persi nel surnatante e solo gli epatociti magri più piccoli vengono raccolti nel pellet cellulare.
Con il protocollo migliorato, gli epatociti pieni di lipidi non sono stati persi e tutti gli epatociti sono stati pellettati. Il serraggio ripetitivo facilita il processo di lavaggio. Con ciò, il fegato viene eliminato in modo ottimale dai componenti del sangue rimanenti che potrebbero inibire gli enzimi della digestione.
