Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), della Natural Science Foundation della provincia dello Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) e della Scientific Research Foundation del Dipartimento dell'Istruzione della provincia dello Yunnan (2023Y0784).

Questa ricerca ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico per gli Esperimenti Animali dell'Università di Medicina di Kunming (kmmu20220945). Tutti gli esperimenti hanno aderito alle linee guida stabilite per la cura degli animali. Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono state raccolte da topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane e di peso compreso tra 20 e 25 g. Questi topi sono stati acquistati dalla Kunming Medical University di Kunming, in Cina. L'intera procedura sperimentale è stata condotta in condizioni di sterilità rigorosa. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato.
1. Preparazione dei reagenti e degli strumenti
NOTA: Tutte le fasi che coinvolgono le soluzioni devono essere eseguite all'interno di un armadio a rischio biologico di classe II.
<ol><li>Preparare il tampone di lavaggio mescolando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con calcio e magnesio, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (P/S) (vedere Tabella dei materiali). Conservare questo tampone al freddo a 4 °C. È fondamentale prepararlo fresco il giorno dell'utilizzo e degassare il tampone.</li>
	<li>Preparare gli enzimi digestivi combinando 10 mL di PBS (senza calcio e magnesio) con 2 mL di tripsina allo 0,25%, 1 mL di papaina 20 mg/mL e 200 μL di collagenasi I da 1 mg/mL (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Assicurarsi dell'uso di aliquote di volumi appropriati per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Conservare queste aliquote a -20 °C.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura utilizzando il kit di terreno di crescita delle cellule endoteliali disponibile in commercio, che include VEGF-C (100 ng/mL) e 1% P/S (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare il tampone di arresto integrando il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di FBS per arrestare il processo di digestione.</li>
	<li>Prepara strumenti chirurgici sterili: questi strumenti dovrebbero includere forbici, pinzette a punta seghettata e pinzette a punta fine.</li>
</ol>2. Rivestimento del pallone
<ol><li>Rivestire il matraccio T25 con una soluzione di fibronectina 100 μg/mL (vedere Tabella dei materiali) e incubare per una notte a 37 °C. Prima dell'uso, rimuovere la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Lavare il pallone tre volte con PBS, successivamente aspirare il PBS e lasciare asciugare il pallone T25 all'aria.</li>
</ol>3. Dissociazione delle leptomeningi
NOTA: Utilizzare sempre tamponi e soluzioni preraffreddati a 4 °C.
<ol><li>Anestetizzare i topi con un'inalazione eccessiva di isoflurano al 4% e poi sacrificarli mediante rapida decapitazione utilizzando forbici precedentemente pulite con etanolo al 70%.</li>
	<li>Incidere con cura la pelle lungo la linea mediana, partendo dall'apertura nella parte posteriore del cranio ed estendendosi verso la zona frontale.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il cranio, sollevandolo delicatamente con le forbici per evitare di danneggiare le leptomeningi, assicurandosi di ottenere l'intero cervello, comprese le leptomeningi.</li>
	<li>Immergere l'intero cervello in un tampone di lavaggio e sciacquarlo delicatamente per rimuovere il sangue superficiale.</li>
	<li>Trasferisci il cervello in una capsula di Petri sterile senza tritare ed estrai le leptomeningi dalla superficie del cervello usando una pinzetta a punta fine al microscopio.</li>
	<li>Tagliare il tessuto delle leptomeningi in frammenti utilizzando microforbici sterili.</li>
</ol>4. Digestione enzimatica delle leptomeningi
<ol><li>Aggiungere 10 mL della miscela enzimatica (fase 1.2) ai frammenti e incubare a 37 °C per 15 min. Agitare delicatamente per assicurarsi che i frammenti si stacchino dal fondo del tubo. Successivamente, aggiungere 10 ml di tampone di arresto (passaggio 1.4) per arrestare la digestione.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di PBS freddo e passare la miscela attraverso un colino da 70 μm in una provetta sterile da 50 mL per filtrare eventuali grumi.</li>
</ol>5. Espansione cellulare
<ol><li>Piastra 1 x 10 5 cellule per cm 2 in un matraccio T25 rivestito di fibronectina (fase2) con5 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore. Successivamente, rimuovere il terreno per eliminare le cellule non attaccate.</li>
	<li>Sostenere la cultura sostituendo il 50% del terreno ogni due giorni. Ripeti questo processo due o tre volte.</li>
</ol>6. Selezione della cella magnetica
NOTA: Lavorare rapidamente, mantenere la freddezza delle celle e utilizzare soluzioni pre-raffreddate per prevenire l'etichettatura non specifica delle cellule.
<ol><li>Preparazione degli strumenti e dei reagenti: collegare un separatore magnetico a un supporto per separatore magnetico (vedere la tabella dei materiali). Collegare una colonna di selezione al separatore magnetico e posizionare un filtro cellulare da 70 μm sopra la colonna di selezione. Posizionare una provetta da 50 ml sotto la colonna di selezione per raccogliere il flusso.</li>
	<li>Digestione enzimatica: una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, aspirare il terreno e risciacquare le cellule con PBS. Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Arrestare la digestione aggiungendo il tampone di arresto. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Incubazione degli anticorpi: risospendere 1 x 107 cellule totali in 100 μL di PBS e aggiungere 10 μL di anticorpo LYVE-1 (vedere la tabella dei materiali). Mescolare accuratamente e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.<ol><li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Sciacquare le cellule introducendo 1 mL di PBS e centrifugando a 300 x g per 5 min. Rimuovere completamente il surnatante.</li>
	</ol></li>
	<li>Marcatura delle microsfere: risospendere le cellule in 100 μL di PBS e aggiungere 20 μL di Microsfere (vedi Tabella dei materiali). Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.<ol><li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti e travasare il surnatante. Successivamente, detergere le cellule con 1 mL di PBS attraverso centrifugazione a 300 x g per 5 min. Infine, rimuovere completamente il surnatante.</li>
	</ol></li>
	<li>Esclusione magnetica negativa: risospendere le cellule in 4 mL di PBS. Passare le cellule attraverso un colino cellulare da 70 μm per eliminare i grumi. Preparare la colonna di selezione (vedere Tabella dei materiali) sciacquandola con 3 mL di PBS, quindi applicare la sospensione cellulare nella colonna di selezione.<ol><li>Eseguire le fasi di lavaggio con 3 mL di PBS e raccogliere le cellule LYVE-1-negative in una provetta da 50 mL posizionata sotto la colonna di selezione per consentirne il passaggio.</li>
	</ol></li>
	<li>Selezione magnetica positiva: pipettare 6 mL di PBS nella colonna di selezione. Svuotare istantaneamente le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna di selezione per ottenere LLEC positivi a LYVE-1. NOTA: Attendere sempre che il serbatoio della colonna di selezione sia vuoto prima di procedere al passaggio successivo.</li>
</ol>7. Cultura dei LLEC
<ol><li>Centrifugare gli LLEC LYVE-1-positivi a 300 x g per 5 minuti, quindi rimuovere con cautela il surnatante.</li>
	<li>Inserire 1 x 10 5 cellule per cm2 in un matraccio T25 rivestito di fibronectina con5 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Mantieni la cultura sostituendo il 50% del mezzo a giorni alterni. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina ed eseguire il passaggio cellulare. Utilizzare le cellule per esperimenti successivi dopo 2-3 passaggi.</li>
</ol>8. Analisi citofluorimetrica
NOTA: L'analisi citofluorimetrica a flusso è stata condotta seguendo la procedura precedentemente descritta15.
<ol><li>Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Quindi, aggiungi il tampone di arresto per arrestare la digestione.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e aspirare completamente il surnatante. Risospendere 1 x 106 cellule in 100 μL di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di anticorpo LYVE-1. Mescolare accuratamente e incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in una quantità appropriata di tampone PBS per l'analisi utilizzando la citometria a flusso e il software FlowJo (vedere Tabella dei materiali).</li>
</ol>9. Colorazione immunofluorescente
NOTA: La colorazione immunofluorescente è stata condotta seguendo la procedura descritta in precedenza16.
<ol><li>Lavare le celle con PBS tre volte. Fissare le celle con paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il PFA e lavare le celle con PBS tre volte.</li>
	<li>Applicare il tampone a blocchi per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone di blocco dai vetrini coprioggetti.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo LYVE-1 nel tampone di colorazione alle cellule e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere alle cellule un anticorpo secondario appropriato (vedere la tabella dei materiali) nel tampone di colorazione e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.</li>
	<li>Controcolorante con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Le cellule sono ora pronte per la microscopia a immunofluorescenza.</li>
</ol>

Realizzazione di colture LLEC in vitro mediante selezione cellulare magnetica

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells.">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi da rivelare.

Il protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro non è stato precedentemente riportato. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multiprocedurale per la raccolta e la coltura di LLEC da leptomeningi di topo.
Sebbene questo protocollo multiprocedurale sia riproducibile, ci sono diverse considerazioni chiave. Ad esempio, i palloni T25 rivestiti di fibronectina promuovono l'adesione delle LLEC e funzionano eliminando le cellule non aderenti, garantendo ...

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) appena scoperte formano un reticolo di singole cellule all'interno delle leptomeningi, mostrando un modello di distribuzione distinto rispetto alle cellule endoteliali linfatiche periferiche 1,2. Le funzioni cellulari e le implicazioni cliniche associate alle LLEC rimangono in gran parte un territorio inesplorato. Al fine di aprire la strada alla ricerca funzionale sui LLEC, è imperativo stabilire un modello in vitro per il loro studio. Pertanto, questo studio ha ideato un protocollo completo per l'isolamento e la coltura primaria delle LLEC.
I topi sono il modello animale preferito per la loro idoneità alla manipolazione genetica nella ricerca sulle malattie. Studi precedenti hanno isolato con successo cellule endoteliali linfatiche da vari tessuti di topo, tra cui i linfonodi3, il tessuto mesenterico4, il tessuto dermico5, i linfatici di raccolta6 e il tessuto polmonare7. Queste procedure di isolamento si sono basate principalmente su tecniche come il cernimento cellulare attivato magneticamente (MACS) e lo smistamento con citometria a flusso 8,9,10. Inoltre, gli sforzi di ricerca hanno portato alla creazione di linee cellulari aracnoidee di ratto e linee cellulari capillari linfatiche di ratto11,12. Nonostante l'esistenza di tecniche di coltura di espianto per leptomeningi13, esiste un urgente bisogno di un protocollo standardizzato per l'isolamento e la coltura delle LLEC. Di conseguenza, questo studio ha raccolto e coltivato con successo le LLEC dissociando meticolosamente le leptomeningi sotto la guida di un microscopio e promuovendo l'espansione delle LLEC attraverso l'uso del fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C). Il marcatore distintivo per le cellule endoteliali linfatiche è il recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1)14. Questo protocollo a più fasi isola selettivamente gli LLEC positivi a LYVE-1 utilizzando MACS e successivamente ne verifica la purezza attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente.
Le fasi principali di questo protocollo multi-step possono essere riassunte come segue: rivestimento del pallone, dissociazione delle leptomeningi, digestione enzimatica delle leptomeningi, espansione cellulare, selezione magnetica delle cellule e successiva coltura di LLEC. Infine, la purezza delle LLEC isolate è confermata attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente. L'obiettivo generale di questo studio è quello di presentare un protocollo riproducibile e multi-step per l'isolamento di LLEC da leptomeningi di topo e la loro successiva coltura in vitro . Questo protocollo è destinato a facilitare notevolmente le indagini sulle funzioni cellulari e sulle implicazioni cliniche delle LLEC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono una popolazione cellulare intracranica scoperta di recente con una distribuzione unica chiaramente distinta dalle cellule endoteliali linfatiche periferiche. La loro funzione cellulare e le implicazioni cliniche rimangono in gran parte sconosciute. Di conseguenza, la disponibilità di una fornitura di LLEC è essenziale per condurre ricerche funzionali in vitro. Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro.
Questo studio ha raccolto con successo le LLEC utilizzando un protocollo a più fasi, che includeva il rivestimento del pallone con fibronectina, la dissezione delle leptomeningi con l'assistenza di un microscopio, la digestione enzimatica delle leptomeningi per preparare una sospensione a singola cellula, l'induzione dell'espansione delle LLEC con il fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C) e la selezione di cellule positive al recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1) attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo processo ha portato alla creazione di una cultura primaria. La purezza degli LLEC è stata confermata attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'analisi citofluorimetrica, con un livello di purezza superiore al 95%. Questo protocollo in più fasi ha dimostrato riproducibilità e fattibilità, il che faciliterà notevolmente l'esplorazione della funzione cellulare e delle implicazioni cliniche delle LLEC.

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

Autore in primo piano: Svelare le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle cellule endoteliali linfatiche leptomeningee 

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

Questo studio presenta un protocollo riproducibile in più fasi per la raccolta di cellule endoteliali linfatiche (LLEC) dai topi e successivamente la creazione della loro coltura primaria in vitro. Le fasi chiave riguardano la preparazione del matraccio e il rivestimento della fibronectina, la dissociazione delle leptomeningi, l'ottenimento di una sospensione unicellulare attraverso la digestione enzimatica e l'induzione dell'espansione delle LLEC con VEGF-C. Le LLEC LYVE-1-positive vengono quindi isolate selet...

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Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Questo protocollo è progettato per le aree di altri ricercatori interessati solo dove ha stabilito la multi procedura e le aree primarie culturali Il nostro protocollo alla fine ha portato alla creazione della nostra cultura primaria dell'area CS con un livello di purezza superiore al 95% Attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura I nostri risultati hanno aperto la strada a ulteriori indagini sulla funzione simile di LLEC nel virtuale. Al RUC, la nostra recente scoperta della popolazione cellulare intracranica, il significato biologico della RUC Condurremo ulteriori ricerche sulla funzione cellulare e ne esamineremo le implicazioni cliniche.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

871 Views.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Questo protocollo è progettato per le aree di altri ricercatori interessati solo dove ha stabilito la multi procedura e le aree primarie culturali Il nostro protocollo alla fine ha portato alla creazione della nostra cultura primaria dell'area CS con un livello di purezza superiore al 95% Attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura I nostri risultati hanno aperto la strada a ulteriori indagini sulla funzione simile di LLEC nel virtuale. Al RUC, la nostra recen...

Video: Autore in primo piano: Svelare le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle cellule endoteliali linfatiche leptomeningee 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Ricerca

Neuroscienze

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

Dissociazione delle leptomeningi di topo e digestione enzimatica per una coltura efficiente delle cellule leptomeningee

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.