Oggi dimostreremo due protocolli che dimostrano come studiare la funzione cellulare NK. Ci sono due aspetti chiave della funzione cellulare NK che è in grado di sradicare le cellule tumorali ed è in grado di migrare verso il micro ambiente tumorale. Questi due protocolli dimostreremo la capacità cellulare NK di sradicare le cellule tumorali ed è anche in grado di migrare verso il micro ambiente tumorale.
Quindi i due protocolli che dimostreremo oggi sono semplici, non richiedono l'uso dell'attività radio e possono essere stabiliti nella maggior parte dei laboratori che hanno la capacità di fare biologia molecolare e lavoro di coltura cellulare. Suresh Bugide e Suresh Chava, che sono due collaboratori post-dottorato nel mio laboratorio, dimostreranno questi due protocolli oggi. Due valutano la citotossicità mediata da cellule NK utilizzando LDH, prima coltivano una linea cellulare per il cancro al fegato umano al 70-80% di confluenza in una piastra di Petri di coltura cellulare di 100 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Il giorno dell'esperimento, lavare la coltura con cinque millilitri di PBS prima di trattare le cellule con un millilitro dello 0,25% di tripside EDTA fino a quando le cellule non si sono staccate dal fondo della piastra. Quando è stata ottenuta una sospensione a singola cella aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare alle cellule e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Lavare il pellet cellulare con cinque millilitri di PBS prima di sospendere di nuovo le cellule a una volta 10 fino alla 5 ° cella per millilitro di concentrazione media di coltura fresca.
Successivamente, sementi 100 microlitri delle cellule tumorali del fegato umano bersaglio per pozzo in triplice copia per condizione di trattamento in una piastra di 96 po 'e aggiungere uno per 10 alla 5 ° cellule NK umane in 100 microlitri di mezzo per ogni bene cellulare bersaglio. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per tre ore. Al termine dell'incubazione, pelletare le cellule per centrifugazione e trasferire 100 microlitri di supernatante da ogni pozzo in singoli pozzi di una nuova piastra di 96 pozza.
Aggiungere 50 microlitri di substrato LDH ad ogni pozzo con miscelazione accurata e incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione con 50 microlitri di soluzione di arresto e misurare immediatamente l'assorbanza su un lettore di piastre a 490 e 680 nanometri. Quindi utilizzare la formula per calcolare la percentuale di citotossicità della cella NK.
Per valutare la citotossicità mediata dalle cellule NK utilizzando la calceina AM dopo aver fatto crescere le cellule della linea cellulare del cancro al fegato umano a una confluenza del 70-80%, come dimostrato, sospendere le cellule in tre millilitri di DMEM senza siero ed etichettare le cellule con 1,5 microlitri di soluzione di calceina AM millimolare per 30 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e lavare le cellule due volte con cinque millilitri di PBS per lavaggio. Sospendere di nuovo le cellule a una volta 10 alla 5 ° cellule per millilitro di concentrazione media di coltura e aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzo di una piastra di 96 pozzetti in triplice copia per condizione di trattamento.
Successivamente, a una volta 10 alla 5 ° cellule NK umane in 100 microlitri di mezzo di coltura per ogni pozzo di cellule bersaglio e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per quattro ore. Dopo la fine dell'incubazione, catturare almeno 10 diversi campi di immagini delle cellule positive della calceina AM per ogni replica di ogni condizione di trattamento su un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento 10 volte superiore. Quindi calcolare la percentuale di citotossicità usando la formula.
Per misurare la migrazione cellulare NK in risposta agli stimoli chemiotattici, raccogliere cellule NK umane da una coltura confluente del 70-80% e sospendere le cellule a una concentrazione media di coltura cellulare NK 2,5 per 10 fino alla 6a cella per millilitro di concentrazione media di coltura cellulare NK priva di siero. Successivamente, aggiungere 600 microlitri di mezzo privo di siero contenenti l'attrattore di chemio cellulare NK di interesse per pozzo e posizionare un inserto di coltura di coltura di 6,5 millimetri di diametro con cinque pori micrometrici in ogni pozzo di mezzo. Quindi aggiungere 100 microlitri di celle NK al compartimento superiore di ogni inserto e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per quattro ore.
Alla fine dell'incubazione trasferire l'intero volume di cellule migrate non aderenti dal fondo di ogni pozzo in singoli tubi FACS a cinque millilitri e aggiungere 50 microlitri di un numero predeterminato di perline di conteggio della citometria di flusso a ciascun tubo. Quindi l'utilizzo di un citometro di flusso valuta ogni campione di cella in base ai protocolli di analisi citometrica a flusso standard e calcola il numero assoluto di celle NK migrate utilizzando la formula. Il knockdown ATF4 riduce significativamente la citotossicità mediata da cellule NK rispetto alle cellule NK che esprimono RNA a forcina corta non specifico.
Dopo la colorazione con calceina AM il numero di cellule tumorali del fegato umano vitali diminuisce dopo la co-coltura con cellule NK umane rispetto alle cellule tumorali del fegato umano coltivate senza cellule NK. Come previsto, l'abbattimento dell'ATF4 tramite RNA a tornante corto riduce l'uccisione mediata da cellule NK di cellule tumorali del fegato umane come evidenziato da un maggior numero di cellule am-positive calceina in queste colture. Inoltre, si osserva una quantità significativamente più elevata di migrazione cellulare NK in risposta al mezzo contenente chemiochine rispetto alle cellule NK esposte al mezzo di controllo senza chemiochina.
Per la citotossicità cellulare NK valutare è importante standardizzare il nostro sforzo e i rapporti target e il tempo di incubazione per ogni linea cellulare tumorale. Una volta identificati e convalidati gli standard in vitro, la valutazione viene integrata con esperimenti sui topi in vivo per valutare ulteriormente il loro ruolo nell'eradicazione delle cellule tumorali.
