Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
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Questo lavoro è stato supportato da K12 HD068322 (SCM); CA179921 R01 e P51 OD011092 (AVM); e premio 14PRE20320014 da America Heart Association (SB).

Nota: tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite in condizioni di BSL-2.
 1. preparazione di KSHV Stock <ol><li>buffer di preparare TNE: sciogliere 292,24 mg di EDTA in ddH 2 O, portare a 225 mL e regolare a pH 8. Sciogliere mg 605,7 Tris in ddH 2 O portare a 225 mL e regolare a pH 8. EDTA e Tris soluzioni combinate, aggiungere 4,38 g NaCl, regolare il volume finale di 500 mL, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C .</li>
	<li>Cultura il KSHV-positivo, la linea EBV-negativi di cellule di linfoma primario di effusione BCBL-1 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in RPMI completato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e antimicrobici per circa 1 a 1.2 x 10 6 cellule per mL.</li>
	<li>Per indurre la produzione di KSHV, dividere Culture 1:2 con mezzo fresco e aggiungere Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) a una concentrazione finale di 20 ng/mL e incubare le colture per 5 giorni. In alternativa, trattare le cellule con butirrato del sodio (NaB; 0,1 mM) per 3 giorni per indurre la replicazione litica.</li>
	<li>Per raccogliere le particelle virali, prima di centrifugare il surnatante a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule e trasferire i surnatanti in provette di freschi della cultura.</li>
	<li>Per chiarire ulteriormente il supernatante in modo da evitare il trasferimento di detriti cellulari, centrifugare a 2.500 x g per 10 min a 4 ° C. 
	Nota: in alternativa alla centrifugazione ad alta velocità per la chiarifica dei surnatanti, filtrazione attraverso una sterile 0,45 µm filtro possa essere eseguita. Abbiamo osservato un calo significativo nel titolo mediante filtrazione; di conseguenza, eseguiamo regolarmente la seconda fase di centrifugazione invece.</li>
	<li>Successivamente, sovrapposizione di 5 mL di soluzione di saccarosio di 25% nel buffer di TNE con circa 30 mL di surnatante in 6 tubi di ultracentrifuga della cultura chiarificato.</li>
	<li>Centrifuga equilibrato tubi a 75.000 x g per 2 ore a 4 ° C sotto vuoto.</li>
	<li>Decantare il supernatante di coltura e macchia il bordo di ogni tubo per rimuovere quanto più soluzione supernatante e saccarosio come possibile, quindi risospendere il pellet di virus, che potrebbe non essere visibile, in 150 µ l di tampone TNE.</li>
	<li>Virus in piscina tutti risospesa, mescolare bene e congelare 25 aliquote di µ l a -80 ° C .</li>
</ol> 2. Trasduzione della CE con E6 ed E7 Papillomavirus Genes Nota: usiamo ordinariamente matracci di cultura del tessuto standard per la coltivazione EC. primaria Tuttavia, se insoddisfacente crescita della CE si ottengono quindi l'uso di matracci di cultura commerciale dovrebbe essere considerato.
<ol><li>Cultura primaria umana dermico microvascolare o linfatico CE in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 nel mezzo di crescita CE (EGM; contiene sostanza basale di CE [EBM] completato con EGM-2 BulletKit [contenente FBS, idrocortisone, fattore di crescita del fibroblasto umano-B, fattore di crescita vascolare CE, fattore di crescita insulino-simile-1, acido ascorbico, fattore di crescita epiteliale umano, antibiotici ed eparina]) in un matraccio di cultura cellulare T75 a circa 50% confluenza.</li>
	<li>Per trasduzione, cultura PA317 LXSN 16E6E7 cellule 24 , 35 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in DMEM completati con 10% FBS e antimicrobici in un Matraccio di cultura cellulare T150 fino a quando essi sono circa 90% confluenti. Quindi incubare per una notte in 16 mL di terreno.</li>
	<li>Chiarire il mezzo PA317 mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la EGM dalle cellule EC cultura e sovrapposizione con 12 mL di terreno PA317 chiarificato e incubare per 4 h. 
	Nota: Centrifugazione 16 mL di medium condizionato a 300 x g per 5 min risultati in una compatta a pellet che non è disturbato dalla successiva rimozione accurata di 12 mL di surnatante chiarificato. Tuttavia, se il trasferimento delle PA317 LXSN 16E6E7 cellule di colture primarie di CE è una preoccupazione (la linea cellulare di imballaggio rapidamente diventerà troppo grande per CE), filtrazione del surnatante condizionato attraverso un filtro da 0,45 µm prima del trasferimento può eseguire.</li>
	<li>Sostituire 6 mL di terreno PA317 con EGM fresco e incubare per una notte.</li>
	<li>Refeed CE con 12 mL EGM fresco e incubare un ulteriore 48 h.</li>
	<li>Per sub-cultura della CE, rimuovere il mezzo e lavare con 12 mL di PBS senza cationi e aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica commerciale (ad esempio, TrypLE) di e incubare a 37 ° C per 3 min.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare risultante in EGM fresco e dividere in modo uniforme in 3 x T75 boccette con un volume finale di 12 mL EGM per fiaschetta.</li>
	<li>Per selezionare per CE trasformata con E6 ed E7, aggiungere G418 ad una concentrazione finale di 200 µ g/mL per due passaggi, dopo il quale la CE trasdotte può essere placcata per infezione o congelata in azoto liquido.</li>
</ol> 3. Infezione della CE trasdotte con KSHV <ol><li>il giorno prima dell'infezione vendemmia CE a digestione enzimatica utilizzando la soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra. Risospendere le cellule in 1 mL di EGM. Utilizzare 5 µ l di cellule per preparare una diluizione 1/10 in blu di Trypan. Contare celle in tensione utilizzando un emocitometro e seme 2,5 x 10 5 cellule vive in 2 mL di EGM per pozzetto in piastre a pozzetti 6.</li>
	<li>Il giorno di infezione, EGM di rimuovere e lavare le cellule con 3 mL di PBS con calcio e magnesio per pozzetto e quindi aggiungere 2 mL EBM. 
	Nota: È indispensabile utilizzare EBM anziché EGM durante l'infezione, poiché l'eparina in EGM inibiscono la associazione di particelle virali per e successiva infezione di destinazione EC.</li>
	<li>Di infettare le cellule con KSHV, aggiungere brodo di virus di 5 a 20 µ l a ciascun pozzetto e ricciolo piatto per mescolare. Per cellule infettate da mock, aggiungere un volume equivalente di tampone TNE in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Centrifugare le piastre a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente e poi incubare le piastre a 37 ° C per 90 min.</li>
	<li>Se l'obiettivo dello studio è di indagare gli eventi iniziali che richiedono un'infezione virale sincrona, ad esempio, eventi precoci nell'infezione de novo, rimuovere l'inoculo virale a questo punto. Sciacquare e le cellule con 2 mL di refeed EGM fresco. In caso contrario, aggiungere 2 mL EGM e incubare le colture durante la notte.</li>
	<li>Refeed cellule con 2 mL EGM il giorno dopo l'infezione e quindi ogni altro giorno.</li>
	<li>Quando le cellule sono circa 90% confluenti, vendemmia a digestione enzimatica con soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra, quindi le cellule da tre pozzi in un T75, rilevando il numero di passaggio totale e il passaggio della piscina post-infezione.</li>
	<li>Espandere mock - e KSHV-infettato CE 1:3 divisioni per almeno due passaggi ulteriori, momento in cui le cellule possono essere utilizzate in esperimenti o congelate in azoto liquido. 
	Nota: Come con la scissione della CE trasformata con E6 ed E7, culture di manutenzione delle cellule infettate di derisione e KSHV dovrebbero essere diviso prima di raggiungere la confluenza (~ 85-90%).</li></ol>
 4. confermando l'infezione con KSHV dall'immunofluorescenza Nota: rilevamento di KSHV latenza-collegata nucleare antigene (LANA-1/ORF73) fornisce una misura quantitativa affidabile di infezione. Gli anticorpi anti-LANA sono disponibili in commercio.
<ol><li>Il giorno prima della colorazione, piastra due pozzetti ciascuna con mock - o KSHV-infettati CE su una piastra a 24 pozzetti a 1 x 10 5 cellule per bene in 1 mL EGM e incubare per una notte.</li>
	<li>Cellule di lavare due volte con 500 µ l di PBS più calcio e magniseum. Lavare per 30 s su una piattaforma oscillante.</li>
	<li>In un di cappa esternamente-Refriggerato, fissare le cellule con 500 µ l di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 plus siero di capra 0,02% in PBS più cationi).</li>
	<li>Bloccare le cellule con 500 µ l di siero di capra del 2% in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Etichetta un pozzetto di mock - o KSHV-infettati CE con 200 µ l di anticorpo primario diluito 01:100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker. Incubare i rimanenti due pozzi a 200 µ l di tampone di lavaggio solo.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Etichetta tutti i quattro pozzi con 200 µ l di anticorpo secondario diluito 1: 100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Ad ogni pozzetto applicare 20 µ l di montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti e valutare che macchia usando un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	<li>Determinare l'infezione percentuale di cellule infettate da KSHV contando il numero di nuclei di LANA-positivi in almeno 200 cellule. Infezione con ricombinante KSHV-Bac16 può essere monitorato anche tramite osservazione di culture per l'espressione della GFP.</li>
</ol>

Oncogenesi sono un processo multifasico che aggira precauzioni importanti all'interno di un organismo36. Come lesione KS esistano lungo uno spettro di infiammazione cronica al veri sarcomi, delucidazione di alcuni processi patofisiologici mediata da KSHV richiede che alcuni studi condotti in modelli di coltura cellulare che supportano la trasformazione9. Va notato che la perdita di inibizione da contatto e la crescita ancoraggio-dipendente, fenotipi indicativi di trasformaz...

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore di angioproliferative multi-focale che interessano siti cutanei, mucosi e viscerali che si sviluppa più comunemente nella cornice di soppressione immune avanzata1. Sono state descritte quattro forme epidemiologiche: classic, una forma indolent che colpisce in genere persone anziane del patrimonio Mediterraneo e del Medio Oriente; iatrogena, derivando dal trattamento con farmaci immunosoppressori dopo trapianto dell'organo; epidemia, un cancro didefinizione; ed endemiche, una forma di HIV-indipendente comune nei bambini nelle regioni endemiche in Africa. Con l'avvento dei regimi della droga anti-retrovirale combinazione efficace per il trattamento dell'HIV, KS epidemica è molto meno comunemente diagnosticato in paesi in via di sviluppo. Tuttavia, le forme clinicamente aggressive endemiche ed epidemiche rimangono tra i più comunemente cancri diagnosticati in molti paesi africani2,3,4. Pertanto, l'identificazione di farmaci mirati a patogenesi efficaci per il trattamento di KS è una priorità di ricerca.
Istologicamente, KS lesioni sono caratterizzate da neovascolarizzazione abbondante ma anormali, per cui le cellule dell'alberino di origine CE formano reti vascolari discontinuo5. Questi vasi anomali ("fessure vascolari") consentono lo stravaso di eritrociti, che danno lesioni loro colore caratteristico. Inoltre, le lesioni contengono numerosi leucociti che caratterizzano l'infiammazione cronica (cioè, linfociti, macrofagi e plasmacellule). Regressione delle lesioni KS dopo ricostituzione immunitaria è stata descritta, suggerendo che KS ha caratteristiche di una lesione iper-proliferative sia un vero tumore6,7,8,9.
Il herpesvirus KS (KSHV), l'agente causativo di KS, è stato identificato nel 199410. Da allora molti in vitro coltura cellulare sono stati sviluppati modelli per attivare studi di patogenesi, comprese le cellule espiantati da materiale di biopsia del tumore e primaria o CE esprimendo la telomerasi è infettato da KSHV in vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nessuno dei modelli attualmente disponibili completamente ricapitola il microambiente tumorale di KS, ma tutti hanno contribuito conoscenze preziose per la nostra comprensione del pathobiology dell'infezione di KSHV. A differenza del altri noto cancerogeno herpesvirus umano virus di Epstein - Barr (EBV), KSHV non prontamente trasforma le cellule in cultura seguendo de novo infezione19,20,21, 22. Tuttavia, questa limitazione è stata superata da transducing CE primaria umana del mescolato origine microvascolare o linfatico con la E6 ed E7 geni da papillomavirus umano tipo 16 prima dell'infezione con KSHV23,24 . Espressione di questi oncogeni esogeni aumenta notevolmente il potenziale trasforma di KSHV in vitro in parte fornendo ulteriore inibizione del retinoblastoma proteina e p5323,24. Questo metodo di trasduzione CE ha permesso più laboratori di identificare le alterazioni chiave nell'host espressione genica delle cellule che sono indotte dall'infezione di KSHV e che sembrano facilitare KS cella sopravvivenza e proliferazione25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. i protocolli descritti nel presente documento sono semplici e altamente riproducibile e comporterà la generazione di pari età e passaggio CE KSHV-infettati e controlli mock-infettati che possono essere coltivati per lontano più di cellule primarie e saranno consentire per l'indagine sui meccanismi oncogenici impiegato da KSHV. Anche se il protocollo include un metodo per la produzione di tipo selvaggio KSHV dalla linea cellulare linfoma primario di effusione BCBL-1, CE E6/E7-immortalata anche sono altamente suscettibili di infezione con BACmid ricombinante derivato KSHV-BAC1630. Protocolli per la preparazione di BAC16 sono descritti altrove33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore insolito composto di proliferazione delle cellule dell'alberino che è iniziato da infezione delle cellule endoteliali (CE) con KSHV e si sviluppa più spesso nella regolazione di immunosoppressione. Nonostante decenni di ricerca, il trattamento ottimale di KS rimane definito male e gli esiti clinici sono particolarmente sfavorevoli nelle impostazioni di risorse limitate. Le lesioni KS sono guidate da angiogenesi patologica, infiammazione cronica e oncogenesi e vari in vitro modelli di coltura cellulare sono stati sviluppati per studiare questi processi. KS deriva dalle cellule di KSHV-infettati di origine endoteliale, così le cellule CE-stirpe di fornire i più appropriati in vitro surrogati del precursore delle cellule dell'alberino. Tuttavia, perché CE hanno una durata limitata in vitro , e come i meccanismi oncogenici impiegati da KSHV sono meno efficaci di quelli di altri virus cancerogeno, è stato difficile valutare i processi di trasformazione primaria o telomerase-immortalized EC. Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di romanzo cultura basata su CE che prontamente supporta la trasformazione dopo l'infezione con KSHV. Espressione ectopica dei geni E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 consente estesa cultura di pari età e passaggio mock - e KSHV-infettati CE e supporta lo sviluppo di un veramente trasformato (cioè, cancerogeno) fenotipo in colture di cellule infette . Questo modello altamente riproducibile e trattabile di KS ha facilitato la scoperta di diverse vie di segnalazione essenziale ad alto potenziale per la traduzione in contesti clinici.

La morfologia della primaria CE è classicamente descritto come "ciottoli", e questa morfologia non è alterata dall'espressione del papillomavirus E6 ed E7 geni (Figura 1A). Espressione dei geni E6 ed E7 da solo non induce un fenotipo trasformato; così, le cellule sono suscettibili di contattare inibizione e cesseranno dividendo dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. Le cellule saranno tuttavia proliferare e ricrescere alla confluenza su trypsinization e ricro...

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K Views.  University of Minnesota Medical School. Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

Video: An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Identificare i geni disregolazione indotta da sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biologia

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Ex Vivo Modello organotipiche corneale di acuta epiteliali Herpes simplex virus di tipo I Infezione

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Neuroscienze

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Ricerca sul cancro

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

Doppia bioluminescenza Imaging della progressione tumorale e dell'angiogenesi

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...