Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del NIH e ACS, tra cui T32CA009135, CA133027, CA070723 e CA022443. Bill Sugden è una società americana di Professor Cancer Research.

1. Ingegneria delle cellule con plasmidi visibili <ol><li> Utilizzare digestione normale restrizione o tecniche di ricombinazione omologa per introdurre un frammento di DNA contenente circa 250 copie della sequenza dell&#39;operatore lattosio (Laco) nel plasmide da visualizzare. Il nostro è stato un plasmide BACmid di circa 170 kbp e conteneva l&#39;intero genoma di Kaposi sarcoma-associated virus Herpes (KSHV) e resistenza codificato igromicina 12. </li><li> Introdurre LACO contenenti DNA plasmidico in cellule di mammifero mediante trasfezione con Lipofectamine 2000. Noi cellule HeLa trasfettate e SLK in 60 piatti mm per 4 ore con 10 pg di DNA plasmidico purificato con 25 pl Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM, e 3,5 ml DMEM. </li><li> Modificare il terreno di coltura per 5 ml DMEM con 10% siero fetale bovino cellule e incubare per 48 hr. </li><li> Piatto le cellule a bassa densità in piatti grandi e le cellule di coltura in terreno contenente una selezione antibiotico per l&#39;introduzione plasmid; abbiamo selezionato cellule in DMEM con 10% di siero fetale bovino con 300 ug / ml di igromicina per 3 settimane. </li><li> Utilizzare pezzi di sterile, tripsina imbevuta di carta da filtro per il trasferimento igromicina resistenti colonie per piastre di coltura di nuove. </li><li> Quando cloni trasfettati sono cresciuti a riempire il piatto, isolare DNA per la digestione di restrizione e Southern blotting per garantire che il polimero del plasmide Laco è omogenea e della dimensione attesa. </li><li> Se il plasmide non è stata ingegnerizzata per esprimere una fusione di LacI, infettare cloni giusti con un retrovirus codificante il repressore lattosio (LacI) fuse ad una proteina fluorescente rossa, come LacI-tdTomato. Usiamo tdTomato piuttosto che le proteine ​​che reagiscono più vicino al verde per ridurre al minimo photoxicity che si verificherebbe da esposizioni multiple tempi lunghi oltre 13. </li><li> Una volta che la proteina di fusione LacI viene introdotto, coltivare le cellule in presenza di 200 mg / ml isopropil-bD-tiogalattoside (IPTG) per bloccare le proteine ​​di fusione di legameDNA. </li><li> Cultura le cellule per almeno 3 giorni per consentire l&#39;espressione del LacI tdTomato-proteina. </li><li> Cloni schermo (lavando via il IPTG e la visualizzazione di cellule come descritto di seguito) per quelli con livelli ottimali di LacI-tdTomato che rivelano segnali distinti, con livelli di fondo minimo di proteine ​​di fusione non legato. </li></ol> 2. Sviluppo del sistema di imaging Il nostro sistema di imaging consiste in un 200M Axiovert Zeiss dotata di un palco motorizzata e Plan-Aochromat 63x/1.4 obiettivo olio. Luce di eccitazione di fluorescenza è fornito dalla &quot;bianco neutro&quot; LED di un sistema Colibri. Emissione viene rilevata da un CascadeII: 1024 EMCCD fotocamera. Questa è una soluzione raffreddata, telecamera posteriore diluito con un registro di guadagno per amplificare i segnali, la corrente di buio è 0,061 elettroni per pixel per secondo, e l&#39;efficienza quantica è maggiore di 0,90. Il sistema è controllato da AxioVision 4,8 software, compreso il modulo SmartExperiments. Per il rilevamento di tdTomautilizzare abbiamo un filtro 75HE Zeiss insieme per la quale l&#39;85% della luce passa può eccitare il fluoro e il 95% della luce emessa passerà il filtro per le emissioni. <ol><li> Assemblare un sistema di imaging con un microscopio invertito e una telecamera EMCCD per rivelazione sensibile di segnali, una sorgente di luce LED per eccitazione specifica e veloce casseforme, una fase braccio motorizzato e fuoco, e software di controllo per l&#39;acquisizione automatica di immagini su intervalli di tempo lunghi con multiple z-stack. Il sistema dovrebbe sedersi su un tavolo aria isolata da vibrazioni. </li><li> Assemblare una fase-top incubatore per mantenere le cellule a 37 ° C, 5-10% di CO 2 in una camera umidificata. Tempo sufficiente per il sistema di arrivare ad una temperatura stabile per minimizzare gli artefatti di movimento durante l&#39;esperimento. </li><li> Utilizzare un collare riscaldato per l&#39;obiettivo di evitare l&#39;obiettivo riflusso calore dal campione. </li></ol> 3. Visualizzazione del DNA con etichetta <ol><li> Cellule portapiatti in 35 mmfondo di vetro piatto ad una densità inferiore al 10% di confluenza, che consentirà coppie di cellule a dividersi in colonie di 8-16 cellule senza sovrapposizioni. Fate questo almeno 24-48 ore prima di imaging in modo che le cellule vitali hanno il tempo di dividersi. </li><li> Uno a tre ore prima dell&#39;inizio imaging, lavare la piastra 3 volte con terreno di coltura che manca di entrambi i farmaci selettivi e IPTG. Questa procedura lava via non vitali delle cellule e permette di Laci proteine ​​di fusione di legare siti Laco nei plasmidi. </li><li> Sostituire il mezzo di coltura con 2 ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino e 25 mM HEPES. </li><li> Sostituire la parte superiore del piatto di coltura con CultFoil allungato in un anello di montaggio per un piatto 35 mm. Questo coperchio inibirà evaporazione del terreno di coltura, che aumenterebbe concentrazione di sale nel tempo e uccidere le cellule. </li><li> Utilizzare contrasto interferenziale differenziale (DIC) imaging per visualizzare le cellule e determinare il piano focale della parte superiore e inferiore delle celle in più campi di vista.In ogni campo, spostarsi in un piano focale circa 1/3 del modo giù dalla parte superiore della cella. Salvare il x, y, z le coordinate nella lista delle posizioni stadio salvati. Nota: I segnali plasmidi possono non essere visibili attraverso gli oculari quando le cellule sono illuminati da LED di lunghezza d&#39;onda appropriata per la proteina di fusione LacI. Segnali deboli possono essere visibili solo con l&#39;uso della fotocamera EMCCD, che consente di integrare il segnale nel tempo e quindi amplifica efficacemente segnali deboli. </li><li> Nel software di controllo microscopio, definire un z-pila di immagini da eseguire in ciascuna posizione fase salvato. Scegli passo di az di 0,35-0,50 micron, che vi permetterà di approssimare campionamento di Nyquist nella dimensione z 14. Includono &quot;extra&quot; fette sopra e sotto i piani in cui si trovano le cellule; queste fette consentono il rilevamento seguendo movimenti delle cellule durante il ciclo cellulare, e sono utilizzati anche in post-elaborazione di acquisizione (deconvoluzione) degli stack di immagini. Tale inserimento saràprovocare una pila di 40-60 immagini, a seconda dello spessore delle celle. </li><li> Nel software di controllo microscopio, definire un esperimento serie storica per raccogliere un&#39;immagine luminosa campo della z-stack ad intervalli di 30 min (per il tracciamento divisioni cellulari e migrazioni su tempi lunghi) e le immagini di fluorescenza a intervalli di 10-60 min (per la visualizzazione dei plasmidi all&#39;interno delle cellule). Non utilizzare immagini DIC durante l&#39;esperimento, in quanto richiede più luce di standard di imaging in campo chiaro, che può esporre le cellule inutilmente fototossicità nel corso di lunghi esperimenti. </li><li> Avviare il software controllato esperimento. Assicurare che il sistema non è disturbato (urtato, esposto alla luce ambiente eccesso, ecc) durante l&#39;esperimento. </li><li> Se necessario, rabboccare l&#39;acqua nel sistema di umidificazione durante l&#39;esperimento. </li></ol> 4. Post-acquisizione Elaborazione di Immagini <ol><li> Rivedere le immagini per ogni punto z-stack e tempo. Ritagliare le aree non necessarie dile immagini per ridurre il tempo di elaborazione del computer nella fase successiva. </li><li> Utilizza un algoritmo di deconvoluzione di ri-assegnare intensità del segnale al pixel di origine in ogni z-stack 15. Mentre questo deconvoluzione può essere basato su una funzione teorica punto di diffusione per il sistema di imaging, è preferibile misurare la funzione di punto di diffusione del sistema di imaging particolare microsfere fluorescenti, e utilizzare questa misura nell&#39;algoritmo deconvoluzione. Abbiamo misurato la funzione di diffusione del punto del nostro sistema di imaging e applicato un algoritmo di verosimiglianza vincolata iterativo massima AxioVision Software (descrizione del software AxioVision, Zeiss). </li><li> Esaminare le immagini per registrare le variazioni di intensità e movimenti di plasmidi durante il ciclo cellulare e il partizionamento dei plasmidi a cellule figlie. </li></ol>

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	<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li><li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi's+sarcoma.">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li><li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence.">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li><li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome:+application+for+genetic+analysis.">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+pixels,+and+gray+levels:+digitizing+image+data.">Points, pixels, and gray levels: digitizing image data.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+enhancement+by+deconvolution.">Image enhancement by deconvolution.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo qui descritto può essere utilizzato per seguire plasmidi in cellule di mammifero in diretta nel corso del tempo che attraversa più generazioni. Limitando l&#39;esposizione alla luce di eccitazione, abbiamo usato queste tecniche per seguire le cellule da coppie di nuova divisi in colonie di 16-32 cellule, che rappresentino almeno 72 ore e 3 divisioni cellulari. Questi esperimenti forniscono informazioni che non possono essere ottenuti da test statici come la PCR quantitativa, cancellando meridionale, e FISH. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomicina solfato </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> 400 pg / ml per SLK; 300 ug / ml per HeLa </td></tr><tr><td> Isopropil-bD-tiogalattoside (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Concentrazione finale di 200 mg / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Con fondo di vetro piatti </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> LED bianco neutro </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro Cube 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Plan-Apochromat 63x/1.4 obiettivo </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD fotocamera </td><td> Fotometrici </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol mini </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 digitale </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI controller digitale 3700 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldatore Obiettivo </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Fase di riscaldamento inserto P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Stage-top Incubatore S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Umidificatore sistema </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy

Pochi plasmidi presenti naturalmente sono mantenuti in cellule di mammifero. Tra questi sono genomi di gamma-herpesvirus, incluse Epstein-Barr (EBV) e sarcoma di Kaposi associato herpesvirus (KSHV), che causano più malignità umane 1-3. Questi due genomi sono replicati in modo licenza, ciascuno utilizzando una singola proteina virale e macchinari replicazione cellulare, e sono passati alle cellule figlie durante la divisione cellulare, nonostante i loro centromeri privi tradizionali 4-8. Molto lavoro è stato fatto per caratterizzare le repliche di questi genomi plasmide utilizzando metodi come assorbente meridionale e ibridazione in situ fluorescente (FISH). Questi metodi sono limitati, però. Quantitativa PCR e Southern blot fornire informazioni circa il numero medio di plasmidi per cellula in una popolazione di cellule. FISH è una cella singola saggio che rivela il numero medio e la distribuzione del plasmide<html> s per cella nella popolazione di cellule, ma è statico, permettendo alcuna informazione circa il genitore o progenie della cellula esaminata. Qui, si descrive un metodo per la visualizzazione plasmidi in cellule vive. Questo metodo è basato sul legame di una proteina fluorescente etichettato lattosio repressore di diversi siti del plasmide di interesse 9. Il DNA di interesse è progettato con circa 250 ripetizioni in tandem dell&#39;operatore lattosio (Laco) sequenza. Laco è specificamente legato dalla proteina repressore lattosio (LacI), che può essere fusa ad una proteina fluorescente. La proteina di fusione può essere espresso dal plasmide ingegnerizzato o introdotto da un vettore retrovirale. In questo modo, le molecole di DNA vengono fluorescently etichettato e quindi diventano visibili tramite microscopia a fluorescenza. La proteina di fusione è bloccato da legare il DNA plasmidico da cellule di coltura in presenza di IPTG finché i plasmidi sono pronti per essere visti. ONTENUTO &quot;&gt; Questo sistema permette i plasmidi da monitorare in cellule viventi per diverse generazioni, rivelando proprietà dei loro sintesi e partizionamento cellule figlie. ideali sono cellule aderenti, facilmente trasfettate, e hanno grandi nuclei. Questa tecnica è stata utilizzata per determinare che 84% di EBV-derivati ​​plasmidi sono sintetizzati ogni generazione e l&#39;88% della partizione di nuova sintesi plasmidi fedelmente alle cellule figlie in cellule HeLa. Coppie di questi plasmidi EBV sono stati visti da essere legati o associati ai cromatidi fratelli dopo la loro sintesi in S- fase fino a quando non sono stati visti per separare i cromatidi fratelli separati in anafase 10. Il metodo è attualmente utilizzato per studiare la replicazione dei genomi KSHV in cellule HeLa e cellule SLK. cellule HeLa sono immortalati cellule epiteliali umane, e le cellule SLK sono immortalati endoteliali umane cellule. Anche se le cellule SLK sono stati originariamente derivato da una lesione KSHV, né la linea di cellule HeLa, né SLK naturalmente harbors genomi KSHV 11. Oltre a studiare la replicazione virale, questa tecnica di visualizzazione può essere usato per studiare gli effetti l&#39;aggiunta, la rimozione o la mutazione dei vari elementi di sequenza del DNA di sintesi, la localizzazione e il partizionamento di altri DNA plasmidico ricombinante.

<html> Proiezioni di massima intensità di Z-stack acquisite in un esperimento rappresentativo sono mostrati nella Figura 3. Tipici segnali plasmide sono presenti in 3-8 fette di z-stack, a seconda che essi rappresentano singoli o gruppi di plasmidi. Nel caso di EBV e KSHV plasmidi derivati, i segnali muovono lentamente all&#39;interno della cella fino alla cella raggiunge mitosi. Le cellule stesse migrano nel corso dell&#39;esperimento. Diventano anche sferica e staccare dal piatto durante la mitosi. Il...

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Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Un metodo di osservazione singole molecole di DNA in cellule vive è descritto. La tecnica si basa sul legame di una proteina fluorescente etichettato repressore lac di siti di legame ingegnerizzati nel DNA di interesse. Questo metodo può essere adattato per seguire molti DNA ricombinanti in cellule vive nel tempo.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  University of Wisconsin - Madison. Un metodo di osservazione singole molecole di DNA in cellule vive è descritto. La tecnica si basa sul legame di una proteina fluorescente etichettato repressore lac di siti di legame ingegnerizzati nel DNA di interesse. Questo metodo può essere adattato per seguire molti DNA ricombinanti in cellule vive nel tempo.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...