Gli autori desiderano ringraziare la Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e Genome Alberta, una divisione di Genome Canada, per il sostegno finanziario.

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto per la creazione di una semplice via metabolica (ciclo TCA) può essere adattato per creare una grande varietà di percorsi, biologicamente complessi a lettura ottica per qualsiasi specie. Inoltre, questo protocollo descrive anche come si può replicare o propagare percorsi esistenti creati da altri utenti. Costruire un percorso utilizzando questo strumento richiede ripetute aggiunte passo-passo di reazioni, interazioni, processi di trasporto, e sotto-percorsi, ognuno dei quali sono collegati da elementi di sovrapposizione. Mettendo insieme tutti questi permette di creare colorati, diagrammi pathway visivamente piacevole che forniscono un notevole dettaglio biologica e utile contesto biologico. I passi descritti in questo protocollo sono relativamente semplici, e il tempo necessario per costruire un diagramma percorso dipende dalle dimensioni e dalla complessità del percorso. Con un po &#39;di pratica, la maggior parte delle persone possono rendere un diagramma di percorso di alta qualità composto da circa 15-20 reazioni o processi did diversi componenti cellulari in circa 15 min. Un nuovo utente può richiedere fino a 30-40 minuti per generare un percorso di dimensione e complessità simili. Il tempo necessario per generare un percorso è approssimativamente lineare con il numero di reazioni / processi che devono essere resi. La creazione di un percorso di alta qualità attraverso questo strumento basato sul web dipende dalla qualità e il dettaglio del materiale di origine (percorsi da libri, banche dati on-line, i dati sperimentali, schizzi disegnati a mano) e la meticolosità della via &quot;artista&quot;. Coloro che desiderano generare elevati diagrammi pathway qualità dovrebbero prestare particolare attenzione ai punti 1.11, 1.15 e 1.20 del protocollo, dal momento che queste sezioni descrivono la creazione e la modifica di elementi di reazione (reagenti / prodotti, enzimi, bordi, immagini, scatole di zoom, etichette, e membrane). Le migliori diagrammi pathway in modo intelligente amalgamare informazioni provenienti da altrettante rappresentazioni esistenti del percorso possibile, compresi quelli che si trovano in Books, manifesti, documenti e banche dati on-line. Un&#39;altra chiave per la generazione di percorsi di alta qualità sta controllando attentamente la correttezza delle reazioni prima di creare una reazione (attraverso la sezione 1.11 del protocollo). Prendendo il tempo e lo sforzo per garantire i reagenti, i prodotti, e gli enzimi coinvolti (molti dei quali già esiste nel database di grandi dimensioni di PathWhiz) siano corrette per ogni specie è molto importante. E &#39;anche importante essere consapevoli della localizzazione cellulare delle reazioni e includere componenti cellulari o subcellulari chiave al fine di fornire il contesto biologico corretta. Questo può essere fatto controllando e corroborare la reazione tramite banche dati online come UniProt. Avere tutte le informazioni necessarie a portata di mano, con un ruvido, schizzo a mano del percorso da creare ridurrà di molto gli errori e il tempo complessivo speso per disegno o rendering. Come ci si potrebbe aspettare, percorsi complessi più grandi e più ci vorrà più tempo per il rendering, particlare se gli elementi ei processi desiderati non sono già nel database di PathWhiz. Quando si lavora con percorsi più grandi, di solito è saggio passare dalla modalità Autosave al Manuale modalità di risparmio, al fine di evitare un lungo ritardo tra azioni. Quando si replica un percorso, la quantità di tempo l&#39;utente potrebbe aspettare che il percorso da generare dipende dal numero di elementi nel percorso. La maggior parte dei percorsi possono essere replicati in circa 1-2 minuti. Quando un percorso di moltiplicazione, di successo prestazione del percorso appena propagato dipende da quanto simili le due specie sono, come PathWhiz utilizza BLAST 17 sequenza di ricerche per trovare enzimi omologhi tra le specie. percorsi più grandi saranno più lenti di propagare perché dovrà essere eseguito su un numero maggiore di enzimi BLAST. Il tentativo di diffondere percorsi tra le specie significativamente dissimili (diciamo tra il lievito e gli esseri umani) si tradurrà in percorsi di essere resi con un certo numero di proteine ​​sconosciute. Questi &quot;lontano&quot; ppercorsi ropagated di solito richiedono la modifica manuale aggiuntivo. A causa della natura altamente visiva dei diagrammi pathway e dettaglio che può essere portato ad un percorso, è sempre una buona idea per lavorare su un computer con uno schermo abbastanza grande (&gt; 20 pollici o&gt; 50 cm) e una buona connessione internet (&gt; 5 Mbps). Se si verificano problemi con il rendering o rinfrescante schermo, l&#39;utente può avere a che fare una piccola quantità di risoluzione dei problemi. Se un grande, complesso percorso richiede troppo tempo per aggiornare, l&#39;utente potrebbe essere necessario aggiornare la pagina. Se un percorso non propaga come previsto, l&#39;utente può avere a che fare qualche modifica manuale per garantire che tutti gli elementi vengono visualizzati correttamente. Inoltre, come un esempio più specifico, se non vengono visualizzati elementi di una reazione, l&#39;utente può fare in modo che tutti gli elementi o gli enzimi sono selezionate correttamente ei bordi non sono nascosti. Il link &quot;Help&quot; sulla testata principale può essere utile se si verifica un problema. Un tutorial èdisponibile nella scheda &quot;Tutorial&quot; e un manuale utente è disponibile nella scheda &quot;Guide per l&#39;utente&quot;. Entrambi spiegare molte delle caratteristiche dello strumento in dettaglio. La Guida per l&#39;utente può essere utilizzato per risolvere o spiegare eventuali limitazioni per una particolare caratteristica, come ad esempio quando un utente blocca un percorso e poi vuole di modificarla. Come evidenziato attraverso questo protocollo e attraverso gli esempi forniti nelle figure allegate, questo strumento offre una serie di caratteristiche uniche che non si trovano in nessun (o quasi) gli altri strumenti di disegno percorso (vedi tabella 1). Innanzitutto, è completamente web-based e completamente indipendente dalla piattaforma. In secondo luogo, supporta il rendering e la generazione di facile multicolori, biologicamente complesse, visivamente piacevole, diagrammi pathway pienamente con collegamenti ipertestuali che possono anche essere convertiti in formati leggibili da una macchina (BioPAX, SBGN-ML 18, SBML 19, PWML 14). In terzo luogo, i diagrammi pathway generiTed da questo strumento possono essere sfogliati, cercato, selezionato e facilmente esplorato attraverso un&#39;interfaccia facile da usare database online e la visualizzazione. In quarto luogo, lo strumento web è progettato per supportare i contributi pathway comunità, consentendo di &quot;approvvigionamento folla percorso&quot; che incoraggia la condivisione e la generazione di nuovi percorsi e nuovi elementi pathway. Percorsi generate da questo strumento web può essere utilizzato per una varietà di applicazioni. , percorsi ricche di dettagli completamente collegamenti ipertestuali possono essere facilmente integrati in banche dati specifiche organismo di proteomica, la metabolomica o applicazioni biologia dei sistemi. percorsi accessibili via Internet sono particolarmente utili a fini di istruzione e formazione, come i dettagli disponibili attraverso le immagini basate sul web sono spesso molto maggiore di quello che può essere visualizzato tramite un&#39;immagine statica o attraverso una singola pagina libro di testo o una rivista. Questo strumento basato su web supporta anche la generazione di rappresentazioni pathway che sono più adatti per la stampa e la pubblicazione.Come risultato, molte immagini generate da questo strumento web based stanno comparendo in giornali, poster e presentazioni. percorsi Esportazione in formati di file di scambio dati basati su testo (come BioPAX e SBML) permette di percorsi generati utilizzando questo server Web da utilizzare direttamente in analisi computazionale per la biologia dei sistemi o applicazioni di modellazione metabolici. Propagazione percorsi tra le specie permette deduzioni da effettuare sui processi biologici, in particolare tra quelle specie che sono state molto recentemente sequenziato. Mentre esistono attualmente non tutti i percorsi esistenti in PathWhiz, il suo database percorso pubblico continua a crescere, che porta alla nascita di nuove collezioni pathway folla di origine. Queste raccolte non solo saranno facilmente estendibile a nuove specie, che si spera porterà ad una più profonda comprensione della loro biologia e biochimica unica.

diagrammi percorso biologico sono come modelli per gli scienziati della vita. Sono forse i percorsi più concisi e informativi per raffigurante processi biologici e le connessioni contestuali tra geni, proteine ​​e metaboliti. Questo perché le immagini sono molto più efficiente elaborati e spesso molto più facilmente compresi dagli esseri umani rispetto al testo 1. La qualità, i dettagli, e il contenuto dei diagrammi percorso può variare notevolmente. Queste differenze dipendono spesso dalla destinazione del percorso e la capacità dell&#39;artista percorso. Percorsi creati per scopi educativi, come pannelli murali o libri di testo sono spesso creati da artisti professionisti. Di conseguenza, questi diagrammi pathway sono molto più visivamente piacevole e offrono dettaglio molto più biologico con il massimo dei raffigurazioni di strutture di metaboliti, componenti subcellulari, strutture cellulari, tessuti e organi. Queste rappresentazioni &quot;libro di testo&quot; includono spesso note dettagliate ecommenti. D&#39;altra parte, gli schemi pathway progettati per le applicazioni Internet hanno spesso a sacrificare arte e ricchezza visiva a favore di lettura ottica &quot;cablaggio&quot; Schemi semplificati. Questi diagrammi wireframe sono più facilmente l&#39;immagine-mapped e collegamento ipertestuale. Diagrammi pathway semplificate sono la base a tali banche dati on-line pathway popolari come KEGG 2, MetaCyc 3, Wikipathways 4 e 5 Reactome. L&#39;emergere di banche dati informatiche pathway-compatibile ha portato anche alla comparsa di strumenti di disegno percorso informatici compatibili. In altre parole, non c&#39;è bisogno di essere un artista professionista o di un programmatore professionista per generare diagrammi pathway utilizzabili. Per esempio, gli strumenti di Pathway BioCyc 6 e software PathVisio di Wikipathway 7 consentono agli utenti di generare liberamente e condividere percorsi leggibili dalla macchina in BioPAX 8 aND / o in formato HTML. Inoltre, ci sono una serie di altri pacchetti freeware stand-alone, così come pacchetti commerciali che supportano la generazione di vari percorsi a lettura ottica, wire-frame, come Cytoscape 9, GenMAPP 10, PathCase 11, e VisANT 12. La semplificazione degli schemi internet pathway in gran parte è cresciuta dalle limitazioni storiche si trovano in molti browser web e strumenti di rendering web-based. Tuttavia, significativi progressi nelle tecnologie web sono stati fatti negli ultimi anni. Questo suggerisce che potrebbe essere possibile generare interattivi, diagrammi percorso Internet-compatibili che sono altrettanto colorati, come esteticamente gradevoli e altrettanto biologicamente complete come quelle che si trovano nei libri di testo. Questo lavoro ha portato allo sviluppo di PathWhiz. PathWhiz è stato implementato utilizzando un Ruby on Rails (http://rubyonrails.org, versione 4.2.0) framewor webk incorpora un database MySQL relazionale (https://www.mysql.com, versione 5.1.50) per gestire tutti i dati percorso, comprese le relazioni di entità, riferimenti esterni, le descrizioni, le specifiche di visualizzazione e strutture chimiche. Il client front-end web è controllato da Ruby on Rails in combinazione con Backbone.js (http://backbonejs.org, la versione 1.0.0) come framework web front-end per l&#39;editor. Originariamente sviluppato per la curation dell&#39;umano-solo piccole molecole Pathway Database (SMPDB) 13, 14 PathWhiz da allora è stato esteso per supportare la generazione percorso per molti altri organismi e di funzionare come un immagine Via generale e database di conoscenze. In particolare, questo strumento web permette la creazione di tutta la gamma di vie biochimiche / metaboliche biologiche incluse, interazioni proteina, segnali molecolari, fisiologici, e percorsi droga / malattia. Questo strumento di disegno percorso si differenzia dalla maggior parte degli altristrumenti di generazione di percorso in tre modi principali: 1) Si tratta di un web server piuttosto che un pacchetto software installabile stand-alone; 2) supportare la generazione facile e visualizzazione interattiva di composti chimici, proteine, acidi nucleici, membrane cellulari, strutture subcellulari, tessuti e organi; e 3) che consente agli utenti di prendere in prestito con facilità, costruire o migliorare il lavoro di altri utenti, consentendo in tal modo &quot;crowd-sourced&quot; generazione percorso. Come un server web, che ha diversi vantaggi rispetto, strumenti software specifiche della piattaforma scaricabili. In particolare, è compatibile con qualsiasi piattaforma, sistema operativo e browser moderno. Inoltre, non richiede all&#39;utente di registrarsi per iniziare a creare un percorso (anche se gli utenti possono creare liberamente un &quot;conto privato&quot; al fine di monitorare e controllare l&#39;accessibilità dei percorsi che creano). Forse la caratteristica più interessante di questo strumento è la quantità di dettagli biologici e biochimici che possono essere facilmente aggiunto inogni percorso attraverso una tavolozza di immagini pre-renderizzati e un ampio database di proteine ​​e dati biochimici. Ciò consente sia &quot;non-artisti&quot; e &quot;non programmatori&quot; di creare facilmente percorsi colorati, esteticamente gradevoli e ricche di dettagli che sono web-compatibile e completamente leggibile dalla macchina. Un confronto più dettagliato tra PathWhiz e altri strumenti di disegno percorso è prevista nella tabella 1. Un certo numero di banche dati delle scienze della vita popolare hanno già utilizzato questo strumento di disegno percorso per creare specifiche del database on-line, diagrammi pathway interattivi. Per esempio, il database di Escherichia coli metaboloma (ECMDB) 15 ha recentemente aggiornato la propria biblioteca percorso con più di 1.650 percorsi disegnati utilizzando lo strumento basato sul web. Ogni percorso nel ECMDB viene ora visualizzato come una mappa riccamente colorato pienamente con collegamento ipertestuale di immagini con dettagliate metabolita e struttura delle proteine ​​raffigurazioni, così come una semplificata in bianco e nero KEGG-lSchema di filo di IKE. Questo aggiornamento via larga scala ha portato alla scoperta di molti metaboliti intermedi, che non erano stati precedentemente comprese in altre banche dati metabolici di Escherichia coli. Altri database, come il database metaboloma umano (HMDB) 15, non solo si basano su percorsi PathWhiz di rappresentare e descrivere metabolici e vie di segnalazione, ma anche per rappresentare i cambiamenti metabolici coinvolti in malattie come il cancro. HMDB attualmente comprende 101 vie metaboliche, 376 percorsi di azione di droga, 233 percorsi di malattie associate e 16 percorsi di segnalazione, tutti generati attraverso questo strumento web. Il seguente protocollo descrive in dettaglio come PathWhiz può essere utilizzato per creare, replicare e propagare percorsi biochimici per una varietà di scopi e applicazioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="501">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Computer with colour screen</td>
			<td style="width:63px;">N/A</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:147px;">&#160;&#62;20 inches or &#62;50 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Internet connection&#160;</td>
			<td style="width:63px;">N/A</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td>&#62;5 mbps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Modern web browser&#160;</td>
			<td style="width:63px;">N/A</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td>Google Chrome (v. 31 and above), Internet Explorer (v. 9 and above), Safari (v. 7 and above), Opera (v. 15 and above) and Firefox (v. 23 and above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a web tool for generating high quality machine-readable biological pathways

PathWhiz è un web server integrato per facilitare la creazione di colorate, interattive, diagrammi pathway visivamente piacevole che sono ricchi di informazioni biologiche. I percorsi generati da questa applicazione online sono pienamente compatibili con praticamente tutti i web browser e sistemi operativi per computer a lettura ottica e. Esso utilizza un appositamente sviluppato, l&#39;interfaccia di disegno via web-enabled che permette la selezione e la disposizione delle diverse combinazioni di entità biologiche o biochimici pre-disegnate per descrivere le reazioni, le interazioni, processi di trasporto e gli eventi di legame. Questa palette di entità consiste di composti chimici, proteine, acidi nucleici, membrane cellulari, strutture subcellulari, tessuti e organi. Tutti gli elementi visivi in ​​esso può essere regolato in modo interattivo e personalizzato. Inoltre, poiché questo strumento è un web server, tutti i percorsi e gli elementi pathway sono accessibili al pubblico. Questo tipo di percorso &quot;crowdsourcing&quot; significa che PathWhizgià contiene una grande e in rapida crescente collezione di percorsi precedentemente disegnate ed elementi pathway. Qui si descrive un protocollo per la creazione facile e veloce di nuovi percorsi e l&#39;alterazione dei percorsi esistenti. Per facilitare ulteriormente la modifica percorso e la creazione, lo strumento contiene funzioni di replicazione e propagazione. La funzione di replica consente percorsi esistenti da utilizzare come modelli per creare o modificare nuovi percorsi. La funzione di propagazione permette di prendere un percorso esistente e diffonderla tra le specie diverse automaticamente. Percorsi creati con questo strumento possono essere &quot;ri-stile&quot; in diversi formati (KEGG-like o libro di testo simili), colorato con diversi background, esportati in BioPAX, SBGN-ML, SBML, o formati di scambio dati PWML, e scaricato come PNG o SVG immagini. I percorsi possono essere facilmente incorporati in banche dati on-line, integrato in presentazioni, manifesti o pubblicazioni, o utilizzati esclusivamente per la visualizzazione on-line e l&#39;esplorazione. Questo protocol è stato applicato con successo per generare oltre 2.000 diagrammi percorso, che ora figurano in molte banche dati on-line, tra cui HMDB, drugbank, SMPDB, e ECMDB.

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A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz è uno strumento di disegno percorso in linea completo per la generazione di percorsi biochimici e biologici. Esso utilizza banche dati accessibili al pubblico e facilmente espandibili palette composte da componenti pre-disegnate pathway. Questo protocollo descrive come creare facilmente nuovi percorsi, replicare e modificare i percorsi esistenti, e propagare i percorsi precedentemente disegnate per gli organismi diversi.

Uno strumento web per la generazione di alta qualità Machine-readable vie biologiche

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

a-web-tool-for-generating-high-quality-machine-readable-biological

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Views.  University of Alberta.  PathWhiz è uno strumento di disegno percorso in linea completo per la generazione di percorsi biochimici e biologici. Esso utilizza banche dati accessibili al pubblico e facilmente espandibili palette composte da componenti pre-disegnate pathway. Questo protocollo descrive come creare facilmente nuovi percorsi, replicare e modificare i percorsi esistenti, e propagare i percorsi precedentemente disegnate per gli organismi diversi. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Ricerca

Biologia

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite effective, this classical approach has certain limitations for miniaturization of the imaging platform to make it compatible with the advanced state of the art in microfluidics. In this report, we introduce experimental details of a lensless on-chip imaging concept termed LUCAS (Lensless Ultra-wide field-of-view Cell monitoring Array platform based on Shadow imaging) that does not require any microscope objectives or other bulky optical components to image a heterogeneous cell solution over an ultra-wide field of view that can span as large as ~18 cm2. Moreover, unlike conventional microscopes, LUCAS can image a heterogeneous cell solution of interest over a depth-of-field of ~5 mm without the need for refocusing which corresponds to up to ~9 mL sample volume. This imaging platform records the shadows (i.e., lensless digital holograms) of each cell of interest within its field of view, and automated digital processing of these cell shadows can determine the type, the count and the relative positions of cells within the solution. Because it does not require any bulky optical components or mechanical scanning stages it offers a significantly miniaturized platform that at the same time reduces the cost, which is quite important for especially point of care diagnostic tools. Furthermore, the imaging throughput of this platform is orders of magnitude better than conventional optical microscopes, which could be exceedingly valuable for high-throughput cell-biology experiments.

Lensfree on-chip imaging and characterization of cells is illustrated. This on-chip cell imaging approach provides a compact and cost-effective tool for medical diagnostics and high-throughput cell biology applications, making it especially suitable for resource poor settings.

Senza lenti on-chip Imaging di celle fornisce un nuovo strumento per High-throughput Cell-Biologia e diagnostica medica

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute Quantum la misurazione del rendimento dei campioni di polvere

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

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