Os autores agradecem a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e Genoma Alberta, uma divisão da Genome Canada, para apoio financeiro.

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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui descrito para a criação de uma via metabólica simples (ciclo do TCA) pode ser adaptado para criar uma grande variedade de vias, biologicamente complexas legíveis por máquina para qualquer espécie. Além disso, este protocolo também descreve como se pode replicar ou propagar vias existentes criadas por outros usuários. Construção de um caminho usando esta ferramenta requer adições repetidas passo-a-passo de reações, interações, processos de transporte, e sub-caminhos, cada um dos quais estão ligados por elementos sobrepostos. Colocando tudo isso junto permite criar diagramas via coloridos, visualmente agradável que fornecem detalhes biológica considerável e contexto biológico útil. Os passos descritos neste protocolo são relativamente simples, eo tempo que leva para construir um diagrama de percurso depende do tamanho e da complexidade da via. Com um pouco de prática, a maioria dos indivíduos pode render um diagrama de caminho de alta qualidade que consiste em cerca de 15-20 reações ou processa umd vários componentes celulares em cerca de 15 min. Um novo usuário pode levar até 30-40 min para gerar um caminho de tamanho e complexidade semelhante. O tempo necessário para gerar um caminho é aproximadamente linear com o número de reacções / processos que precisam ser processados. Criando um caminho de alta qualidade através desta ferramenta baseada na Web depende da qualidade e detalhe do material de origem (vias de livros, bancos de dados on-line, os dados experimentais, esboços desenhados à mão) e a meticulosidade da via &quot;artista&quot;. Aqueles que desejam gerar diagramas via qualidade superior devem prestar especial atenção aos pontos 1.11, 1.15 e 1.20 do protocolo, uma vez que estas seções descrevem a criação e edição de elementos de reação (reagentes / produtos, enzimas, bordas, imagens, caixas de zoom, etiquetas, e membranas). Os melhores diagramas via inteligentemente amalgamar informações de tantas representações existentes da via possível, incluindo aqueles encontrados em books, cartazes, documentos e bases de dados on-line. Outra chave para a geração de caminhos de alta qualidade é verificar cuidadosamente a exactidão das reações antes de criar uma reação (a secção 1.11 do protocolo). Tomando o tempo e esforço para garantir que os reagentes, produtos e enzimas envolvidos (muitas das quais já existem no banco de dados grande de PathWhiz) está correto para cada espécie é muito importante. Também é importante estar ciente da localização celular das reacções e para incluir componentes celulares ou subcelulares chave, a fim de proporcionar o contexto biológica correcta. Isto pode ser feito através da verificação e corroborando a reacção através de bases de dados online, como UniProt. Tendo todas as informações necessárias à mão, juntamente com um esboço, desenhado mão da via a ser criada irá reduzir significativamente os erros e o tempo total gasto em desenho ou renderização. Como seria de esperar, maiores e mais complexos caminhos levará mais tempo para render, particcularmente se os elementos e processos desejados não estiverem no banco de dados do PathWhiz. Quando se trabalha com vias maiores, é geralmente aconselhável para alternar entre o modo de gravação automática com a manual modo de economia, a fim de evitar um longo intervalo de tempo entre as acções. Quando a replicação de uma via, a quantidade de tempo que o utilizador pode esperar para o percurso a ser gerada depende do número de elementos na via. A maioria das vias pode ser replicado em cerca de 1-2 min. Quando uma via de propagação, render bem sucedida da via recém propagadas depende de quão semelhante as duas espécies são, como PathWhiz utiliza BLAST sequência de 17 pesquisa para encontrar enzimas homólogos entre espécies. percursos maiores será mais lento para se propagar porque BLAST terá de ser executado em um maior número de enzimas. A tentativa de propagar vias entre as espécies significativamente diferentes (digamos entre leveduras e humanos) resultará em caminhos que está sendo processado com um número de proteínas desconhecidas. Estes &quot;distante&quot; pvias ropagated normalmente requerem edição manual adicional. Devido à natureza altamente visual de diagramas de percurso e o detalhe que pode ser levado a um caminho, é sempre uma boa idéia para trabalhar em um computador com uma tela razoavelmente grande (&gt; 20 polegadas ou&gt; 50 cm) e uma boa conexão de internet (&gt; 5 Mbps). Se os problemas com a renderização ou refrescante tela são encontrados, o usuário pode ter que fazer uma pequena quantidade de solução de problemas. Se um grande, complexa via leva muito tempo para atualizar, o usuário pode ter que atualizar a página. Se um caminho não se propaga como se espera, o usuário pode ter que fazer alguma edição manual para garantir que todos os elementos são exibidos corretamente. Além disso, como um exemplo mais específico, se os elementos de uma reação não são exibidos, o usuário pode ter a certeza de que todos os elementos ou enzimas são devidamente selecionados e as bordas não estão escondidos. O link &quot;Ajuda&quot; no cabeçalho principal pode ser útil se for encontrado algum problema. Um tutorial édisponíveis sob a aba &quot;Tutorial&quot; e um manual do usuário está disponível na guia &quot;guias do utilizador&quot;. Ambos explicar muitas das características da ferramenta em detalhe. O Manual do Usuário pode ser usado para solucionar ou explicar potenciais limitações para um determinado recurso, tais como quando um usuário bloqueia um caminho e mais tarde pretende editá-lo. Conforme destacado através deste protocolo e através dos exemplos fornecidos nas figuras anexas, esta ferramenta oferece uma série de características únicas não encontradas em nenhum (ou a maioria) outras ferramentas de desenho via (ver Tabela 1). Primeiro, é totalmente baseado na web e completamente independente de plataforma. Em segundo lugar, ele suporta o processamento e geração de facile da biologicamente complexos diagramas coloridos,, visualmente agradável, totalmente hiperlinks via que também podem ser convertidos em formatos de leitura óptica (BioPAX, SBGN-ML 18, SBML 19, PWML 14). Em terceiro lugar, os diagramas de vias génerosted por esta ferramenta pode ser navegado, procurou, selecionados e facilmente explorada através de uma interface fácil de usar banco de dados on-line e visualização. Em quarto lugar, a ferramenta web é projetado para suportar contribuições via comunidade, permitindo &quot;crowd sourcing via&quot; que incentiva a partilha ea geração de novas vias e novos elementos da via. Vias gerados por este instrumento baseado na Internet pode ser usada para uma variedade de aplicações. Ricamente detalhados, caminhos totalmente hiperlinks podem ser facilmente integrados em bancos de dados específicos do organismo para proteômica, metabolômica ou aplicações de biologia de sistemas. percursos acessíveis pela Internet são especialmente úteis para fins de educação e de formação, como os detalhes disponíveis através de imagens baseadas na Web são frequentemente muito maior do que o que pode ser exibido através de uma imagem estática ou através de uma única página livro ou revista. Esta ferramenta baseada na Web também suporta a geração de representações da via que são mais adequados para impressão e publicação.Como resultado, muitas imagens geradas por esta ferramenta baseada na Web estão aparecendo em jornais, cartazes e apresentações de slides. Exportadores vias em formatos de arquivo de troca de dados baseados em texto (como BioPAX e SBML) permite percursos gerados usando esse servidor web para ser usado diretamente na análise computacional para biologia de sistemas ou aplicações de modelagem metabólicas. Propagação vias entre as espécies permite inferências a serem feitas sobre os processos biológicos, especialmente entre aquelas espécies que têm sido muito recentemente sequenciados. Embora nem todas as vias existentes existir atualmente no PathWhiz, seu banco de dados via pública continua a crescer, levando ao surgimento de coleções de vias novas, multidão de origem. Essas coleções não só será prontamente extensível a novas espécies, que esperamos levar a uma compreensão mais profunda da sua biologia única e bioquímica.

diagramas via biológica são como modelos para cientistas da vida. Eles são, talvez, as rotas mais conciso e informativo para descrever processos biológicos e as ligações contextuais entre genes, proteínas e metabolitos. Isso ocorre porque as imagens são muito mais eficientemente processada e frequentemente muito mais facilmente compreendida pelos seres humanos do que de texto 1. A qualidade, detalhe, e o conteúdo de diagramas de vias pode variar consideravelmente. Essas diferenças muitas vezes dependem da finalidade da via e as habilidades do artista percurso. Caminhos criados para fins educacionais, tais como gráficos de parede ou livros são muitas vezes criados por artistas profissionais. Como resultado, estes diagramas via são muito mais agradável visualmente e oferecem detalhes consideravelmente mais biológica com descrições completas de estruturas de metabolito, componentes subcelulares, estruturas de células, tecidos e órgãos. Estas representações &quot;manual&quot; muitas vezes incluem notas detalhadas ecomentários. Por outro lado, os diagramas das vias projetadas para aplicações de internet, muitas vezes tem que sacrificar a arte e riqueza visual em favor de máquinas legível diagramas &quot;fiação&quot; simplificados. Esses diagramas de estrutura de arame são mais facilmente e com hiperlinks mapeados na imagem. Diagramas via simplificados são a base para tais bancos de dados via on-line populares como KEGG 2, metacyc 3, WikiPathways 4 e 5 Reactome. O surgimento de bases de dados da via de computador compatível, também conduziu ao aparecimento de ferramentas de desenho por computador via compatível. Em outras palavras, a pessoa não tem que ser um artista profissional ou um programador profissional para gerar diagramas das vias utilizáveis. Por exemplo, as ferramentas de Caminho de BioCyc 6 e software PathVisio de Wikipathway 7 permitem ao usuário gerar livremente e compartilhar percursos de leitura óptica em BioPAX 8 and / ou formato HTML. Além disso, há uma série de outros pacotes de freeware stand-alone, bem como pacotes comerciais que suportam a geração de várias vias legível por máquina, fio-frame, como Cytoscape 9, GenMAPP 10, PathCase 11 e visant 12. A simplificação dos diagramas via internet em grande parte, cresceu a partir das limitações históricas encontradas em muitos navegadores da web e ferramentas de renderização baseadas na web. No entanto, avanços significativos em tecnologias web têm sido feitos nos últimos anos. Isto sugere que pode ser possível para gerar diagramas interativos, internet compatível via que são tão colorido, tão esteticamente agradáveis ​​e tão biologicamente completos como aqueles encontrados nos livros didáticos. Esse trabalho levou ao desenvolvimento de PathWhiz. PathWhiz foi implementado usando uma Ruby on Rails (http://rubyonrails.org, versão 4.2.0) web framework incorporando um banco de dados MySQL relacional (https://www.mysql.com, versão 5.1.50) para gerir todos os dados da via, incluindo relações entre entidades, referências externas, descrições, especificações de visualização e estruturas químicas. O cliente web front-end é controlada por Ruby on Rails combinados com Backbone.js (http://backbonejs.org, versão 1.0.0) como o framework web front-end para o editor. Originalmente desenvolvido para a curadoria da-somente humano pequena molécula Caminho de Dados (SMPDB) 13, PathWhiz 14 já foi estendido para suportar geração caminho para muitos outros organismos e para funcionar como uma imagem Caminho geral e base de conhecimento. Em particular, esta ferramenta de web permite a criação de toda a gama de vias bioquímicas / biológicos incluindo metabólica, a interacção de proteínas, sinalização molecular, fisiológico, e as vias de droga / doença. Esta ferramenta de desenho via diferente da maioria dos outrosferramentas de geração de caminho de três maneiras principais: 1) é um servidor web, em vez de, um pacote de software instalável stand-alone; 2) que suporta a geração e fácil visualização interactiva de compostos químicos, proteínas, ácidos nucleicos, membranas celulares, estruturas subcelulares, tecidos e órgãos; e 3) que permite aos usuários para emprestar facilmente, construir ou melhorar em cima do trabalho de outros usuários, permitindo assim &quot;crowdsourced&quot; geração via. Como um servidor web, ele tem várias vantagens sobre download, ferramentas de software específicos da plataforma. Em particular, é compatível com qualquer plataforma, sistema operacional e navegador moderno. Além disso, ele não requer que o usuário se registre para começar a criar um caminho (embora os usuários podem criar livremente uma &quot;conta privada&quot;, a fim de acompanhar e controlar a acessibilidade das vias que criam). Talvez o aspecto mais atraente da presente ferramenta é a quantidade de detalhe biológicos e bioquímicos que podem ser facilmente adicionadas emqualquer via através de uma paleta de imagens pré-renderizados e uma extensa base de dados de proteínas e dados bioquímicos. Isso permite que ambos os &quot;não-artistas&quot; e &quot;não-programadores&quot; para criar facilmente vias coloridas, esteticamente agradável e ricamente detalhados que são na web compatível e totalmente legível por máquina. Uma comparação mais pormenorizada entre PathWhiz e outras ferramentas de desenho via é fornecida na Tabela 1. Um número de bancos de dados de ciências da vida popular, já usou essa ferramenta de desenho via para criar específicos de banco de dados, on-line, diagramas via interativos. Por exemplo, o banco de dados Escherichia coli Metaboloma (ECMDB) 15 recentemente atualizou sua biblioteca percurso com mais de 1.650 percursos desenhados com a ferramenta baseada na web. Cada caminho no ECMDB é agora apresentado como um mapa ricamente colorido, totalmente hiperligada imagem com metabolitos e estrutura da proteína descrições detalhadas, assim como uma simplificado preto e branco KEGG-like diagrama fio. Esta actualização via de grande escala levou à descoberta de diversos metabolitos intermediários que não tinha sido previamente incluída em outras bases de dados de Escherichia coli metabólicas. Outras bases de dados, tais como a base de dados Metaboloma Humana (HMDB) 15, não só dependem de vias PathWhiz que mostrem e descrevem processos metabólicos e de sinalização, mas também para descrever as alterações metabólicas envolvidas em doenças tais como o cancro. HMDB inclui atualmente 101 vias metabólicas, 376 vias de luta contra a droga, 233 percursos associados à doença e 16 vias de sinalização, todos gerados através desta ferramenta web. O protocolo que se segue descreve detalhadamente como PathWhiz pode ser usado para criar facilmente, replicar e propagar vias bioquímicas para uma variedade de propósitos e aplicações.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="501">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Computer with colour screen</td>
			<td style="width:63px;">N/A</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:147px;">&#160;&#62;20 inches or &#62;50 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Internet connection&#160;</td>
			<td style="width:63px;">N/A</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td>&#62;5 mbps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Modern web browser&#160;</td>
			<td style="width:63px;">N/A</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td>Google Chrome (v. 31 and above), Internet Explorer (v. 9 and above), Safari (v. 7 and above), Opera (v. 15 and above) and Firefox (v. 23 and above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a web tool for generating high quality machine-readable biological pathways

PathWhiz é um servidor web construído para facilitar a criação de diagramas coloridos e interativos, visualmente agradável via que são ricos em informação biológica. As vias gerados por esta aplicação on-line são legíveis por máquina e totalmente compatível com praticamente todos os navegadores web e sistemas operacionais de computador. Ele usa uma interface de desenho especialmente desenvolvido, web-enabled via que permite a selecção e colocação de diferentes combinações de entidades biológicas e bioquímicas pré-desenhadas para descrever reações, interações, processos de transporte e eventos de ligação. Esta paleta de entidades consiste em compostos químicos, proteínas, ácidos nucleicos, membranas celulares, estruturas subcelulares, tecidos e órgãos. Todos os elementos visuais em que pode ser interativamente ajustada e personalizada. Além disso, porque esta ferramenta é um servidor web, todas as vias e elementos da via são acessíveis ao público. Este tipo de via &quot;crowdsourcing&quot; significa que PathWhizjá contém uma grande e rapidamente crescente coleção de percursos previamente elaborados e elementos da via. Aqui nós descrevemos um protocolo para a criação rápida e fácil de novas vias ea alteração das vias existentes. Para facilitar ainda mais a edição via e criação, a ferramenta contém funções de replicação e propagação. A função de replicação permite vias existentes para serem usados ​​como modelos para criar ou editar novos caminhos. A função de propagação permite tirar uma via existente e automaticamente propagá-la entre espécies diferentes. Pathways criados com esta ferramenta pode ser &quot;re-denominados&quot; em formatos diferentes (KEGG-like ou livro-texto like), colorida com diferentes origens, exportados para BioPAX, SBGN-ML, SBML ou PWML formatos de troca de dados, e baixadas como PNG ou SVG imagens. Os caminhos podem ser facilmente incorporado em bases de dados online, integrados em apresentações, cartazes ou publicações, ou utilizados exclusivamente para visualização on-line e exploração. esta protocol foi aplicado com sucesso para gerar mais de 2.000 diagramas da via, que agora são encontrados em muitos bancos de dados on-line incluindo HMDB, drugbank, SMPDB e ECMDB.

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A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz é uma ferramenta de desenho abrangente, via on-line para gerar caminhos bioquímicos e biológicos. Ele usa bases de dados acessíveis ao público e facilmente paletas expansíveis que consistem em componentes pré-desenhados via. Este protocolo descreve como construir facilmente novos caminhos, replicar e editar percursos existentes, e propagar percursos previamente elaborados a diferentes organismos.

A ferramenta Web para caminhos biológicos que gera alta qualidade de leitura mecânica

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

a-web-tool-for-generating-high-quality-machine-readable-biological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K visualizações.  University of Alberta.  PathWhiz é uma ferramenta de desenho abrangente, via on-line para gerar caminhos bioquímicos e biológicos. Ele usa bases de dados acessíveis ao público e facilmente paletas expansíveis que consistem em componentes pré-desenhados via. Este protocolo descreve como construir facilmente novos caminhos, replicar e editar percursos existentes, e propagar percursos previamente elaborados a diferentes organismos. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite effective, this classical approach has certain limitations for miniaturization of the imaging platform to make it compatible with the advanced state of the art in microfluidics. In this report, we introduce experimental details of a lensless on-chip imaging concept termed LUCAS (Lensless Ultra-wide field-of-view Cell monitoring Array platform based on Shadow imaging) that does not require any microscope objectives or other bulky optical components to image a heterogeneous cell solution over an ultra-wide field of view that can span as large as ~18 cm2. Moreover, unlike conventional microscopes, LUCAS can image a heterogeneous cell solution of interest over a depth-of-field of ~5 mm without the need for refocusing which corresponds to up to ~9 mL sample volume. This imaging platform records the shadows (i.e., lensless digital holograms) of each cell of interest within its field of view, and automated digital processing of these cell shadows can determine the type, the count and the relative positions of cells within the solution. Because it does not require any bulky optical components or mechanical scanning stages it offers a significantly miniaturized platform that at the same time reduces the cost, which is quite important for especially point of care diagnostic tools. Furthermore, the imaging throughput of this platform is orders of magnitude better than conventional optical microscopes, which could be exceedingly valuable for high-throughput cell-biology experiments.

Lensfree on-chip imaging and characterization of cells is illustrated. This on-chip cell imaging approach provides a compact and cost-effective tool for medical diagnostics and high-throughput cell biology applications, making it especially suitable for resource poor settings.

Imagem On-chip sem lente de Células fornece uma nova ferramenta de alta capacidade: Biologia Celular e Diagnóstico Médico

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Medição Rendimento Absoluto Quantum of amostras de pó

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...