Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Il nostro obiettivo è studiare l'attività biochimica di proteine con funzioni sconosciute. Il legame del cofattore non è solo essenziale per l'attività di alcune proteine, ma può anche alterare la loro stabilità termica. Un'applicazione pratica di questo fenomeno consiste nell'utilizzare la variazione di stabilità termica, misurata dalla temperatura di fusione della proteina, per analizzare il legame con il ligando.

Il saggio di spostamento termico è uno strumento versatile per studiare le interazioni proteiche con potenziali cofattori o farmaci e per identificare le condizioni stabilizzanti per la cristallografia. Alcuni dei suoi vantaggi rispetto ad altri metodi di screening sono la sua configurazione relativamente semplice e l'elevata produttività con piastre da 96 o 384 pozzetti. La selenoproteina O, o SelO, è una pseudochinasi conservata evolutivamente che trasferisce l'adenosina monofosfato dall'ATP ai substrati proteici in una modificazione post-traduzionale nota come AMPilazione.

In questo protocollo, utilizziamo la TSA per analizzare il legame dei nucleotidi e dei metalli con SelO.