Gli autori riconoscono programma creativo inchiesta del Clemson University e NSF CBET1254609 per la fornitura di finanziamenti per questo progetto.

1. Produrre una Camera Microchannel per creare un gradiente di concentrazione <ol><li> Tagliare un pezzo muffa acrilica <ol><li> Ottenere un pezzo di acrilico della larghezza desiderata. Tipicamente utilizzare 1 lastre acriliche / 16 pollici di spessore. fogli più spessi sono difficili da tagliare bene e molto sottili fogli non hanno la resistenza meccanica, provocandone la rottura o ordito durante il processo. </li><li> Creare un file CAD con la forma desiderata del pezzo acrilico per produrre una cavità all&#39;interno del polidimetilsilossano (PDMS). Regolare la larghezza di canale e lunghezza per ottenere la sfumatura desiderato rilevante ai singoli protocolli sperimentali. <ol><li> Qui, utilizzare un pezzo acrilica delle seguenti dimensioni: due quadrati (0,254 cm x 0,254 centimetri) collegati da un canale largo 0,127 cm (lunghezza 0,254 cm) (Figura 1). </li></ol></li><li> Importare file CAD nell&#39;apparecchiatura taglio laser e posizionare il pezzo acrilico in una taglierina laser secondo la manuil protocollo di costruttore. NOTA: In alternativa, 3D-stampa il pezzo dalla progettazione CAD. Il vantaggio di questo metodo è che i materiali alternativi possono essere utilizzati per lo stampo; Tuttavia, la risoluzione e riproducibilità possono essere diminuiti con stampa 3D rispetto a taglio laser. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> Figura 1: Computer-Aided Design (CAD) Rappresentazione della Microchannel Camera. Questa immagine descrive il disegno CAD dell&#39;inserto acrilico necessaria per creare la camera di microcanali. 1 A) Vista superiore di disegno CAD, 1B) Vista laterale del disegno CAD con dimensioni in pollici, 1C) vista dall&#39;alto di disegno CAD con dimensioni in pollici <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="2"><li&gt; Versare il polidimetilsilossano (PDMS) <ol><li> In una barca pesare, miscelare 10 parti in peso di elastomero base commerciale (Sylgard 184) con 1 parte in peso di elastomero commerciale Catalizzatore (es Sylgard 194). In genere, mescolare 10 g di elastomero base a 1 g di elastomero Catalizzatore. </li><li> Mescolare per combinare la base e il catalizzatore con una micropipetta per 5 min. </li><li> Impostare una campana a vuoto e posizionare la barca pesare con PDMS nel vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle d&#39;aria intrappolate. </li><li> Spegnere il vuoto e rimuovere la barca pesare. Versare il PDMS sopra dell&#39;acrilico cut-out in una piccola capsula di Petri. Assicurarsi che i PDMS copre completamente l&#39;inserto. </li><li> Lasciare le PDMS per curare notturno (almeno 18 ore) a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Rimozione dell&#39;inserto PDMS <ol><li> Dopo il trattamento il PDMS, rimuovere l&#39;inserto tagliando attentamente le PDMS attorno al pezzo acrilico con un bisturi. </li></ol&gt; </li></ol> 2. placcatura le cellule in una Camera Microchannel <ol><li> La camera di sterilizzazione per la placcatura cellule. NOTA: Mentre PDMS possono essere sterilizzati con ossido di etilene o di altre tecniche, un trattamento UV rapido è veloce, poco costoso, e sufficiente per gli studi di coltura cellulare. La durata del trattamento UV breve non ha compromesso la struttura meccanica o l&#39;integrità del pezzo PDMS. <ol><li> In un armadio standard di coltura cellulare, coprire completamente la camera con il 70% di etanolo. </li><li> Mettere la piastra di Petri in cappa a flusso laminare con i coperchi off. </li><li> Chiudere il cofano e accendere la luce UV. Esporre alla luce UV per 1-2 ore. </li><li> Aprire la cappa a flusso laminare e attendere 15 minuti per ristabilire il flusso. </li><li> Rimuovere l&#39;etanolo al 70%. </li><li> Lavare le camere due volte con sterile tampone fosfato salino (PBS). Usare 1 ml di PBS per ogni lavaggio. Rimuovere PBS e consentono camere per asciugare tutta la notte con i coperchi off. NOTA: In alternativa, invecedi utilizzare una cappa a flusso laminare, utilizzare una casella di camera UV per la sterilizzazione, se disponibile. Fare una scatola UV collocando una sorgente di luce UV nella parte posteriore di una scatola di cartone rivestito con un foglio di alluminio. Il foglio di alluminio riflette la luce per consentire un&#39;illuminazione uniforme del campione. </li></ol></li><li> Placcatura cellule in Camera <ol><li> Contare le cellule utilizzando Trypan blu e un emocitometro. <ol><li> Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare a 400 ml di 0,4% Trypan blu e mescolare delicatamente. Applicare 100 ml di questa soluzione per l&#39;emocitometro compilando delicatamente entrambe le camere sotto il vetrino di vetro. </li><li> Utilizzare un microscopio con un obiettivo 10X per concentrarsi sulla griglia sul emocitometro. Utilizzare un contatore del riscontro della mano per contare le cellule senza macchia dal vivo all&#39;interno di un set di 16 quadrati sul emocitometro. </li><li> Contare le celle in tutte le 4 serie di 16 quadrati. Prendere il conteggio medio delle cellule dai 4 gruppi di 16 quadrati e moltiplicare per 4 5x10. Questo numero finale è il number di cellule / ml in sospensione cellulare. </li></ol></li><li> Aggiungere 2.500 cellule ad un pozzetto su ciascuna camera. Questo si traduce in una densità quasi confluenti di cellule di ~ 30.000 / cm 2. </li><li> Consentono alle cellule di sedersi nella camera per 60 minuti prima di aggiungere supporti (Modified mezzo di Eagle Dulbecco, il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina). </li></ol></li></ol> 3. Blocchi Agarose Destrano Soaked <ol><li> Creazione di un blocco di agarosio <ol><li> Versare 3% agarosio nello stampo 3D stampata (2 mm x 2 mm x 2 mm). </li><li> Consentire l&#39;agarosio solidificare in una camera a vuoto per 30 minuti per rimuovere eventuali bolle. </li><li> Rimuovere il blocco di agarosio dallo stampo. NOTA: In alternativa, versare il 3% agarosio in piccola scatola di Petri con uno spessore di 2 mm. Tagliare un blocco 2 x 2 mm x 2 mm con un bisturi o altro utensile da taglio. Questo non è preciso come il sistema di stampo ma può essere un po &#39;più facile da fare. </li></ol></li><li> completamente submerge il blocco di agarosio in una soluzione di concentrazione desiderata del fattore chemiotattico. Per valutare la formazione gradiente di concentrazione, lavare la camera di prima con destrano fluorescente. La concentrazione ed il peso molecolare di destrano dovrebbe corrispondere a quella di un fattore solubile o farmaco di interesse. </li><li> Mettere a bagno durante la notte il blocco di agarosio. </li></ol> 4. Time-lapse della diffusione Destrano di valutare la concentrazione Gradient Factor Solubile <ol><li> Posizionare il destrano intriso blocco agarosio in un piccolo pozzo piazza della camera di microcanali. </li><li> Posizionare la camera di microcanali in un sistema di imaging cellulare o utilizzare un altro microscopio a fluorescenza con una capacità di time-lapse. Iniziare il time-lapse in base alle istruzioni del produttore. Nota: i risultati mostrati sono prese con filtro GFP, la luce del 50%, 4/10 pH, e l&#39;ingrandimento 4X. </li></ol> 5. Time-lapse di crescita delle cellule <ol><li> cellule placca nella camera di microcanali a un&#39;estremità dellaCamera. Qui, usare 3T3 fibroblasti. Aggiungere 2.500 cellule ad un pozzetto nella camera microcanali. Contare le celle come descritto al punto 2.2.1. <ol><li> Consentono alle cellule di sedersi nella camera per 60 minuti prima di aggiungere supporti (Modified mezzo di Eagle Dulbecco, il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina). Mantenere la camera di microcanali con cellule piastrate a 37 ° C in 5% CO 2. La migrazione cellulare attraverso il canale può essere visto con un microscopio. </li><li> Aggiungere un marcatore o utilizzare un difetto microscopica nella camera come marcatore per servire come punto di partenza per quantificare la distanza mosse anteriori cellule. </li></ol></li><li> Stabilire una sfumatura inserendo un gel di agarosio (8 mm 3 blocco) contenente il fattore di crescita concentrata, chemio-attrattivo, farmaci o altri fattori in prova (qui, 40% FBS viene utilizzato come esempio) ad una estremità del microcanale Camera. </li><li> Prendere immagini time-lapse del fronte delle cellule in movimento. Qui, i risultati mostrano immagini del cellulare front che sono state scattate ogni 12 h utilizzando un sistema di imaging. </li><li> Utilizzare le immagini del fronte delle cellule di quantificare il tasso di crescita delle cellule. Calcolare il tasso di crescita dapprima utilizzando la funzione polyfit MATLAB (roipoly) per creare una maschera poligonale definito dal fronte cellulare, le pareti del canale, e il marcatore di riferimento. Le dimensioni di questa maschera producono la distanza di migrazione del fronte del quale si calcola la velocità media front cellule. Altri studi hanno utilizzato un metodo simile 8. NOTA: Confrontare il bordo frontale crescita cellulare su ciascun fotogramma alla concentrazione del fattore solubile oggetto alla stessa distanza. Il gradiente di concentrazione fattore solubile è calcolato utilizzando un modello di diffusione 1D approssimazione. </li><li> Prendere immagini fluorescenti delle cellule usando falloidina e colorazione DAPI. <ol><li> Fissare le cellule prima di colorazione con falloidina. <ol><li> Warm 4% paraformaldeide a 37 ° C. </li><li> Aggiungere abbastanza 4% paraformaldeide per coprire cellule. Mantenere le cellule inparaformaldeide per 10 min. </li><li> Sciacquare due volte con PBS per 15 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule. </li></ol></li><li> Rimuovere PBS da cellule e aggiungere la soluzione permeabilizzante sufficiente (0,1% Triton X-100 in PBS) per coprire le cellule. Lasciare soluzione per 10 min. </li><li> Lavare due volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule. </li><li> Rimuovere PBS da cellule e aggiungere una soluzione bloccante (1% di siero albumina bovina in PBS) per 20 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di bloccaggio e lavare 2 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule. </li><li> Da questo punto, proteggere le cellule dalla luce con un foglio di alluminio quando non viene utilizzato. Rimuovere PBS dalle cellule e aggiungere falloidina 488 diluito 1:50 in PBS per 1 ora. </li><li> Lavare 2 volte in PBS per 5 minuti per ogni lavaggio. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule. Quindi rimuovere PBS dalle cellule. </li><li> Aggiungere DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo) diluito 1: 1000 in PBS alle cellule per 15 min. </li><li> Rimuovere DAPI elavare le cellule due volte con PBS per 5 minuti per ogni lavaggio. </li><li> Rimuovere ultimo lavaggio e aggiungere abbastanza PBS per coprire le cellule. Le cellule possono ora essere ripreso con un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La nostra camera di microcanali può essere utilizzato per una moltitudine di scopi, tra cui la determinazione del tasso di migrazione delle cellule in risposta a fattori di crescita e fattori chemiotattici e misurando la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica. È possibile utilizzare la nostra camera di microcanali per crescere le cellule e mettere un chemiotattico ad una estremità della camera. Le cellule crescono in risposta al chemiotattico, e la migrazione delle cellule possono essere quantificate prendendo time-lapse immagini che possono essere analizzate per determinare il tasso di migrazione delle cellule. Risultati rappresentativi di questo metodo sono mostrati in figura 3, in cui il tasso di crescita è stato determinato in 13,4 micron / h utilizzando la funzione polyfit MATLAB. Un altro utilizzo di una camera di microcanale è misurare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica. Un destrano fluorescente targhetta di peso molecolare simile al farmaco di interesse può essere usata per modellare la diffusione del drug di interesse. È importante notare che i campioni devono essere manipolati con attenzione come una grande quantità di convezione interromperà il gradiente. I risultati rappresentativi di questo metodo sono mostrati in Figura 4. Un vantaggio di questo modello rispetto al dosaggio camera di Boyden è che è più applicabile ai tipi di cellule aderenti causa della superficie piana; considerando che, le cellule devono cadere attraverso un piccolo tubo nella camera di Boyden prima di aderire. Un&#39;altra limitazione del dosaggio camera di Boyden è che è un test endpoint; pertanto, chemiotassi non possono essere visivamente osservate. Al contrario, con il nostro metodo, chemiotassi si osserva attraverso le immagini time-lapse 9. L&#39;utilizzo di micropipette contenenti chemiotattici stato anche usato un metodo di osservazione migrazione cellulare. Tuttavia, il principale svantaggio di questo metodo è bassa produttività 10. La camera di chemiotassi Dunn è un altro test che viene utilizzato in combinazione con time-lapse imaging come esimoMetodo e dettagliato qui 11, 12. La camera consiste di due cerchi concentrici incisi sulla faccia del vetrino per creare un pozzo interno ed esterno, e un ponte separa i due pozzetti. Il chemiotattico è collocato nel pozzetto esterno, e le cellule sono autorizzati a migrare dal pozzo interno al pozzetto esterno. Questa migrazione è quantificato utilizzando time-lapse immagini che vengono analizzati utilizzando software di analisi dell&#39;immagine. Simile al dosaggio Boyden, uno dei limiti del saggio camera di Dunn è che non può essere facilmente modificato per creare gradienti di concentrazione fattore solubili personalizzato. Un&#39;altra tecnica semplice per valutare la migrazione delle cellule è un in vitro scratch 13. Questo metodo è veloce e poco costoso in quanto richiede solo la creazione di un graffio nel monostrato cellulare e la cattura di immagini di migrazione delle cellule time-lapse vicino alla zero creato in precedenza. Carner, il principale svantaggio di questo metodo è che non è adatto a misurare le risposte ad un gradiente di concentrazione fattore chimica. Il nostro metodo offre il potenziale per creare un gradiente chimica e quantificare migrazione cellulare rispetto al gradiente chimica. Il metodo può essere combinato con il metodo zero, come un graffio può essere creato nel monostrato cellulare, mentre un fattore chemiotattico è presente in uno dei pozzetti nella camera microcanali. In questo modo per la quantificazione e la modellazione di guarigione delle ferite. Un&#39;altra possibile applicazione del nostro dispositivo è quello di determinare la risposta delle cellule tumorali di agenti che inibiscono la crescita cellulare. Altri sistemi microfluidica a base sono stati utilizzati anche per studi di migrazione cellulare 14, 15. Questi studi utilizzano tecniche litografiche con camere pulite per creare stampi master in silicio e / o lavorazione laser per creare canali microfluidica in wafer di silicio. Silicon wafer micro lavorazione può essere costoso in confronto al nostro metodo che utilizza materiali meno costosi (PDMS e acrilico) per la fabbricazione di una camera di microcanali. Il nostro dispositivo supera la limitazione di altre PDMS basato dispositivi microfluidici in cui non era possibile creare piccoli canali 3D 15. Con il nostro metodo, abbiamo creato con successo dispositivo basato su PDMS con canali di piccolo diametro. Altri studi hanno utilizzato un dispositivo microfluidico PDMS-based con due strati di microcanali e un miscelatore di gas multicanale che viene comandato da calcolatore in modo da creare gradienti arbitrari di ossigeno per studiare la migrazione delle cellule sotto diversi gradienti di ossigeno 16. Esiste la possibilità per il nostro dispositivo da utilizzare in modo simile con l&#39;aggiunta di una camera di miscelazione gas ad una estremità della camera di microcanali. dispositivi microfluidici sono spesso realizzati con tecniche litografiche molli; questi possono essere adattati per creare chambe migrazione cellulareRS. Questi metodi comportano la stampa di una maschera con i modelli di canale con computer-aided design (CAD). Queste maschere vengono proiettate su uno stampo pilota rivestito con un resist fotosensibile tramite litografia ottica. Dopo lo stampo master è fatta, PDMS è versato sul master e lasciato indurire per creare uno stampo PDMS che può essere utilizzato per studi microfluidici 17, 18, 19. Composti chemiotattico o chemorepulsive sono poste nella camera in alta concentrazione in uno dei serbatoi per creare gradienti 17. Mentre queste tecniche sono simili a nostro set up, possono essere costoso a causa del costo elevato della creazione dello stampo master per il sistema e l&#39;utilizzo di camere pulite. Inoltre, questi metodi possono essere difficile per gli studenti di imparare in un ambiente basato classe. Gli inserti utilizzati nel nostro set-up per creare i canali possono essere creati con una varietà di metodi, compreso pr 3Dinting e taglio laser. Così, il sistema consente la creazione di una vasta gamma di stampi per costo relativamente basso particolare la stampa 3D diventa più accessibile e ampiamente disponibili. PDMS basate dispositivi microfluidici per misurare la migrazione cellulare e la crescita sono stati utilizzati per una vasta gamma di applicazioni. Per esempio, in Neuroscience Research studia 20, dispositivi sono stati fabbricati usando tecniche di litografia morbida in cui il componente PDMS è stato posto su un piatto di coltura di tessuti o vetro per formare due comparti che sono stati separati da una barriera fisica con scanalature micron di dimensioni per consentire neuroni di crescere attraverso i compartimenti. time-lapse immagini sono state prese per mostrare i neuroni che attraversano la barriera. Il metodo di micropatterning utilizzato per produrre questo dispositivo è complesso, mentre il metodo di produzione per il nostro dispositivo è semplice e può essere utilizzato da ricercatori a tutti i livelli. Un altro studio ha utilizzato anche un metodo a basso costo facile per produrre un SIdispositivo di microfluidica Milar PDMS utilizzando uno stampo master creato da nastro adesivo in modo da creare l&#39;impressione nei PDMS per la produzione di microcanali. Un vantaggio del nostro approccio sopra quello descritto in questo metodo è che i canali del nostro metodo sono fabbricati in un unico passaggio, mentre questo protocollo richiede adesione tra due strati PDMS che crea problemi con il flusso medio alle cellule 21. In conclusione, il metodo della camera microcanale è personalizzabile e può essere utilizzato per ottenere risultati diversi. Il metodo consente la creazione di un gradiente di concentrazione al fine di soddisfare le esigenze dell&#39;utente. Inoltre, il nostro dispositivo offre un vantaggio rispetto ai dispositivi esistenti, a causa del suo costo relativamente basso e la facilità d&#39;uso per i ricercatori a tutti i livelli.

In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td>poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Sheets</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>44200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes&#160;</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD20s-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Type I, Low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000036</td>
			<td>Cell media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Cell media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AME3300</td>
			<td>Instrument used for taking time-lapse images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versa LASER</td>
			<td>Universal Laser Systems, Inc.&#160;</td>
			<td>Model number VLS2.30</td>
			<td>Laser cutter used for cutting plastic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable chamber for measuring cell migration

La migrazione cellulare è una parte vitale della risposta immunitaria, la crescita e la guarigione delle ferite. La migrazione cellulare è un processo complesso che coinvolge interazioni tra le cellule, la matrice extracellulare, e fattori chimici solubile e non solubile (per esempio, fattori chemiotattici). Metodi standard per misurare la migrazione delle cellule, quali il test camera di Boyden, lavoro contando le cellule su entrambi i lati di un divisore. Queste tecniche sono facili da usare; tuttavia, offrono poche modifiche geometrico per diverse applicazioni. In contrasto, dispositivi microfluidici possono essere usati per osservare la migrazione delle cellule con gradienti di concentrazione personalizzabili di fattori solubili 1, 2. Tuttavia, i metodi per fare test microfluidica a base possono essere difficili da imparare. Qui, descriviamo un metodo semplice per la creazione di camere di coltura cellulare per misurare la migrazione delle cellule in risposta a gradienti di concentrazione chimica. Le nostre mi cellularimetodo della camera grazione può creare diversi gradienti di concentrazione lineare per studiare la migrazione delle cellule per una varietà di applicazioni. Questo metodo è relativamente facile da usare ed è normalmente eseguita da studenti universitari. La camera di microcanali è stato creato inserendo un inserto acrilico nella forma della camera di microcanali finale e in una capsula di Petri. Dopo questo, poli (dimetilsilossano) (PDMS) è stata versata sopra dell&#39;inserto. Il PDMS è stato permesso di indurire e poi l&#39;inserto è stato rimosso. Questo ha permesso la realizzazione di pozzi in qualsiasi forma e dimensione desiderata. Le cellule possono essere aggiunti successivamente alla camera microcanali e agenti solubili possono essere aggiunti uno dei pozzi immergendo un blocco agarosio nell&#39;agente desiderato. Il blocco agarosio viene aggiunto uno dei pozzi, e immagini time-lapse può essere preso della camera di microcanali per quantificare la migrazione cellulare. Modifiche a questo metodo possono essere fatte per una data applicazione, rendendo questo metodo higHLY personalizzabile.

La Figura 2 mostra il movimento del fronte cellulare attraverso il canale in risposta ad un gradiente di siero bovino fetale posto all&#39;estremità opposta del canale da cui sono placcati le cellule. La parte anteriore cella è indicato a 48 ore (Figura 2A), 72 ore (Figura 2B), 96 ore (Figura 2C), e 120 h (Figura 2D) post placcatura. Il movimento del fronte delle cellule è stato rintracciato con queste immagini time-lapse, e il tasso di distanza di migrazione e la crescita sono stati calcolati dalla funzione polyfit MATLAB. Da questo, la velocità media anteriore cella è risultato essere 13,4 micron / h (Figura 3). La Figura 4 mostra il gradiente fluorescente stabilita mettendo un blocco di agarosio imbevuto destrano ad una estremità del canale e permettendo destrano diffondere attraverso il canale per 12 h. Un&#39;immagine time-lapse è stata presa ad ogni ora, e la fluorescenza attraverso la distanza di<html> il canale è stata misurata e tracciata come illustrato nella figura 4 e rispetto ad un modello di diffusione 1D. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig2.jpg" /> Figura 2: Cell Movimento anteriore. immagini Time-lapse del fronte delle cellule nella camera di microcanali muove attraverso il canale. La parte anteriore cella marcata in linee arancioni, e la distanza di migrazione è incluso. Questa distanza di migrazione è stato misurato dalla marcatura sulla piastra frontale della parte anteriore cella come mostrato. Una barra di scala 1 millimetro è mostrato in bianco. A) 48 ore dopo la placcatura, B) 72 ore dopo la placcatura, C) 96 ore dopo la placcatura, D) 120 ore dopo la placcatura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> e 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Tasso di crescita di calcolo. Cella movimento anteriore cingolata con le immagini time-lapse. Tasso di crescita è stato calcolato utilizzando la funzione polyfit MATLAB (roipoly) per produrre velocità media davanti cella di 13,4 micron / h. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig4.jpg" /> Figura 4: gradiente fluorescente con destrano. intensità fluorescente misurata attraverso la distanza del canale in cui ogni riga rappresenta il gradiente in una determinata ora. ImageJ è stato utilizzato per calcolare l&#39;intensità di fluorescenza. Questo può essere fatto utilizzando la Analizza | Misura utensile. In primo luogo, scegliere Set Misure sotto Analizzare e selezionare l&#39;intensità. Quindi, scegliere Misura sotto analizzare al fine di ottenere aveintensità dei pixel rabbia. Questo può essere tracciata in funzione della distanza in micron, come mostrato in questa figura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Dettagli Questo protocollo un metodo personalizzabile per misurare la migrazione delle cellule in risposta a fattori chemiotattici che possono anche essere utilizzati per determinare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica.

Una camera per la migrazione delle cellule di misura personalizzabile

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Views.  Clemson University.  Dettagli Questo protocollo un metodo personalizzabile per misurare la migrazione delle cellule in risposta a fattori chemiotattici che possono anche essere utilizzati per determinare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica. 

Video: A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

We have demonstrated the fabrication of a two-level microfluidic device that can be easily integrated with existing electrophysiology setups. The two-level microfluidic device is fabricated using a two-step standard negative resist lithography process 1. The first level contains microchannels with inlet and outlet ports at each end. The second level contains microscale circular holes located midway of the channel length and centered along with channel width. Passive pumping method is used to pump fluids from the inlet port to the outlet port 2. The microfluidic device is integrated with off-the-shelf perfusion chambers and allows seamless integration with the electrophysiology setup. The fluids introduced at the inlet ports flow through the microchannels towards the outlet ports and also escape through the circular openings located on top of the microchannels into the bath of the perfusion. Thus the bottom surface of the brain slice placed in the perfusion chamber bath and above the microfluidic device can be exposed with different neurotransmitters. The microscale thickness of the microfluidic device and the transparent nature of the materials [glass coverslip and PDMS (polydimethylsiloxane)] used to make the microfluidic device allow microscopy of the brain slice. The microfluidic device allows modulation (both spatial and temporal) of the chemical stimuli introduced to the brain slice microenvironments.

We demonstrate fabrication of a simple microfluidic device that can be integrated with standard electrophysiology setups to expose microscale surfaces of a brain slice in a well controlled manner to different neurotransmitters.

La stimolazione cerebrale Slice Utilizzando una rete Microfluidic e della Camera di perfusione standard

We have demonstrated the fabrication of a two-level microfluidic device that can be easily integrated with existing electrophysiology setups. The ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test per misurare l&#39;attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microiniezione cella singola per l&#39;analisi cellulare comunicazione

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.