המחברים מודים תוכנית הודעה Creative של אוניברסיטת קלמסון NSF CBET1254609 למתן המימון לפרויקט זה.

1. הפקת לשכת microchannel ליצור מפל ריכוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך חתיכת עובש אקריליק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג חתיכת אקרילי בעובי הרצוי. משתמשים בדרך כלל 1/16 אינץ &#39;בעובי גליונות אקריליק. גיליונות עבים קשים לחתוך היטב דק מאוד סדינים אין את החוזק המכאני הנדרש, מה שגרם להם לשבור או עיוות תוך כדי התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קובץ CAD עם הצורה הרצויה של היצירה אקריליק לייצר חלל בתוך polydimethylsiloxane (PDMS). התאם את רוחב הערוץ וארך כדי להשיג את השיפוע הרצוי רלוונטי פרוטוקולי ניסוי פרט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, להשתמש פיסת אקריליק של הממדים הבאים: שני ריבועים (0.254 ס&quot;מ x 0.254 ס&quot;מ) המחוברים באמצעות ערוץ רחב 0.127 ס&quot;מ (0.254 ס&quot;מ) (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את קובץ CAD לתוך המכשיר חיתוך לייזר ולמקם היצירה אקריליק חותך לייזר על פי manuהפרוטוקול של facturer. הערה: לחילופין, 3D-להדפיס את היצירה מעיצוב CAD. היתרון של שיטה זו הוא כי חומרים חלופיים יכולים לשמש עבור העובש; עם זאת, החלטת השחזור יכולים להיות ירידה עם הדפסת 3D לעומת חיתוך ליזר. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> איור 1: תכנון בעזרת מחשב (CAD) ייצוג microchannel הקאמרית. תמונה זו מתארת ​​את ציור CAD של הוסף אקריליק הדרושים ליצירת תא microchannel. 1 א) להציג לראש ציור CAD, 1B) הצד לנוכח CAD ציור עם מידות בסנטימטרים, 1C) נוף לראש CAD ציור עם מידות בסנטימטרים <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; יציקת polydimethylsiloxane (PDMS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסירה לשקול, לערבב 10 חלקים לפי משקל של אלסטומר בסיס מסחרי (למשל Sylgard 184) עם חלק 1, לפי משקל, סוכן מסחרי אלסטומר אשפרה (למשל Sylgard 194). בדרך כלל, לערבב 10 גרם של מאגר אלסטומר עד 1 גרם של סוכן אלסטומר אשפרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים לשלב את הבסיס סוכן ריפוי עם micropipette למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת פעמון ואקום ומניחים הסירה לשקול עם PDMS בריק במשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הוואקום ולהסיר את הסירה לשקול. יוצקים את PDMS על גבי מחוץ לחתוך אקריליק בצלחת פטרי קטנה. ודא כי PDMS מכסה לחלוטין את הכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר PDMS כדי לרפא לילה (לפחות 18 שעות) בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הכנס מן PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לרפא את PDMS, להסיר את המכסה על ידי חיתוך PDMS בזהירות סביב חתיכת אקרילי עם אזמל. </li></ol&gt; </li></ol> 2. ציפוי התאים בתא microchannel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיקור לתא עבור תאי ציפוי. הערה: בעוד PDMS ניתן לעקר באמצעות אתילן אוקסיד או טכניקות אחרות, טיפול UV מהיר הוא מהיר, זול, ומספיק מחקרי תרבית תאים. משך טיפול UV הקצר לא לפגוע שלמות מבנה או מכאני של יצירת PDMS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון תרבית תאים סטנדרטי, מכסה לחלוטין את החדר עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי ברדס זרימה למינרית עם המכסים מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סתום את מכסה המנוע ולהדליק את האור האולטרה סגול. לחשוף לאור UV למשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מכסה המנוע זרימה למינרית ולחכות 15 דקות כדי לחדש את זרימת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לתאי פעמיים עם בופר פוספט סטרילית (PBS). השתמש 1 מ&quot;ל של PBS עבור כל שטיפה. הסר PBS ולאפשר תאים לייבוש למשך הלילה עם המכסים מעל. הערה: לחילופין, במקוםשל שימוש במנדף זרימה למינרית, להשתמש בתיבת קאמרית UV לעיקור אם אחד זמין. להפוך את תיבת UV על ידי הצבת מקור אור UV בחלק האחורי של קופסת קרטון מרופדת בנייר אלומיניום. רדיד האלומיניום משקף את האור כדי לאפשר גם תאורה של המדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ציפוי ב קאמרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות trypan כחול ו hemocytometer. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של השעית תא 400 μL של 0.4% Trypan כחולים ומערבבים בעדינות. החל 100 μL של פתרון זה hemocytometer על ידי מילוי שני התאים בעדינות מתחת coverslip הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ עם מטרה 10X להתמקד הרשת על hemocytometer. השתמשתי מונה נקודות יד לספור את התאים בלא הכתם חיים בתוך קבוצה אחת של 16 ריבועים על hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים בכל 4 סטים של 16 ריבועים. קח את ספירת תאי הממוצע מן 4 סטים של 16 ריבועים ולהתרבות על ידי 5x10 4. המספר הסופי זהו number של תאים / מ&quot;ל ​​ההשעיה תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בכל תא. זה מתרגם ל צפיפות התאים ליד ומחוברות של ~ 30,000 / 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין). </li></ol></li></ol> 3. Dextran ספוג בלוקים Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת גוש agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 3% agarose לתוך תבנית מודפס 3D (2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלוק agarose מן התבנית. הערה: לחילופין, יוצקים 3% agarose לתוך צלחת קטנה פטרי בעובי של 2 מ&quot;מ. חותכים בלוק 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ באמצעות אזמל או כלי חיתוך אחרים. זה לא מדויק כמו מערכת העובש אבל זה יכול להיות קצת יותר קל לעשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי submergדואר לחסום agarose בתמיסה של הריכוז הרצוי של גורם chemotactic. כדי להעריך את היווצרות מפל ריכוזים, שטוף את התא הראשון עם dextran ניאון. הריכוז ועל משקל מולקולרי של dextran צריך להתאים לזה של גורם או סמים מסיסים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הלילה לחסום agarose. </li></ol> 4. זמן לשגות של דיפוזיה Dextran להעריך את מפל ריכוזי הפקטור המסיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש agarose ספוג dextran בתוך באר ריבוע קטן של החדר microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא microchannel במערכת הדמיה תא או להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי אחר עם יכולת זמן לשגות. להתחיל את הזמן לשגות פי הוראות היצרן. הערה: התוצאות המוצגות נלקחים עם מסנן GFP, 50% אור, 4/10 pH, והגדלה 4X. </li></ol> 5. זמן לשגות של גדילת התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בתא microchannel בקצה אחד שלתָא. הנה, להשתמש 3T3 פיברובלסטים. להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בבית הבליעה microchannel. ספירת תאים כמתואר 2.2.1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין). שמור על תא microchannel עם תאים מצופה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. נדידת תאי הדרך ניתן לצפות בערוץ עם מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת סמן או להשתמש פגם מיקרוסקופי בתא כסמן כדי לשמש נקודת זינוק לכמת את המרחק המהלכים מול התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור שיפוע ידי הצבת ג&#39;ל agarose (8 מ&quot;מ 3 בלוק) המכיל את גורם הגדילה מרוכז,-attractant הכימותרפיה, סמים, או גורם אחר שנבדק (כאן, 40% FBS נמצא בשימוש כדוגמה) בקצה אחד של microchannel תָא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח זמן לשגות תמונות של חזית התא נעה. הנה, התוצאות מראות תמונות של התא הלוך ושובNT כי נלקחו כל 12 שעות באמצעות מערכת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתמונות של חזית התא לכמת שיעור צמיחת תאים. לחשב את שיעור הצמיחה באמצעות הראשון פונקצית polyfit MATLAB (roipoly) כדי ליצור מסכה מצולעים שהוגדרה על ידי מול התא, קירות הערוץ, ואת סמן הפנייה. ממד המסכה הזאת להניב מרחק הגירה של החזית שממנו המהירות מול התא ממוצעת מחושבת. מחקרים אחרים לא מנוצלים בשיטה דומה 8. הערה: השווה את הקצה מול צמיחת תאים על כל מסגרת לריכוז של הגורם המסיס באותו מרחק. השיפוע גורם ריכוז המסיס מחושב באמצעות קירוב מודל דיפוזיה 1D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות הניאון של תאים באמצעות מכתים Phalloidin ו DAPI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים לפני צביעה עם Phalloidin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> paraformaldehyde 4% חם ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק 4% paraformaldehyde לכסות תאים. שמור את התאים בparaformaldehyde למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS במשך 15 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון מספיק permeabilizing (0.1% Triton X-100 ב PBS) כדי לכסות תאים. השאר פתרון במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון לחסימת (1% אלבומין בסרום שור ב PBS) במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור פתרון חסימה ולשטוף 2 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו, להגן על תאים מפני אור עם רדיד אלומיניום כאשר לא בשימוש. הסר PBS מתאי ולהוסיף Phalloidin 488 בדילול 1:50 ב PBS עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. ואז להסיר PBS מתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) מדולל 1: 1,000 ב PBS לתאים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DAPI ולשטוף תאים פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לשטוף האחרון ולהוסיף מספיק PBS לכסות תאים. תאים יכולים להיות צילמו עכשיו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li>
<li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li>
<li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+study+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li>
<li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li>
<li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21592329">µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%5BTitle%5D)+AND+%22JCB%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li>
<li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li>
<li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li>
<li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li>
<li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412(2011).</li>
<li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Tech%3A+Rev+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li>
<li>Tang, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTang%2C+SK+%22Basic+microfluidic+and+soft+lithographic+techniques.+Optofluidics%3A+Fundamentals%2C+Devices+and+Applications%22">Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications</a>. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li>
<li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תא microchannel שלנו עשוי לשמש מספר רב של מטרות, כולל קביעת שיעור נדידת תאים בתגובה גורמי גדילה chemoattractants ומדידת קצב הדיפוזיה של תרופה ממטריקס פולימר. אפשר לנצל תא microchannel שלנו לגדל תאים ומקום chemoattractant בקצה אחד של החדר. התאים גדלים בתגובה chemoattractant, ואת נדידת תאים ניתן לכמת על ?...

In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent</td></tr><tr><td>Acrylic Sheets</td><td>US Plastic</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&amp;ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Type I, Low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Instrument used for taking time-lapse images</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&amp;nbsp;</td><td>Model number VLS2.30</td><td>Laser cutter used for cutting plastic</td></tr></tbody></table>

a customizable chamber for measuring cell migration

נדידת תאים היא חלק חיוני של מערכת חיסונית, צמיחה, וריפוי פצעים. נדידת תאים היא תהליך מורכב הכרוך אינטראקציות בין תאים, תאי מטריקס, וגורמים כימיים מסיסים ובלתי מסיס (למשל, chemoattractants). שיטות תקן למדידת ההגירה של תאים, כגון assay הקאמרית בוידן, עבודה על ידי ספירת תאים משני צדי מחיצה. טכניקות אלו קלות לשימוש; עם זאת, הם מציעים שינוי גיאומטרי קטן עבור יישומים שונים. לעומת זאת, מכשירי microfluidic יכולים לשמש כדי לצפות נדידת תאים עם מילויי ריכוז להתאמה אישיים של גורמי מסיסי 1, 2. עם זאת, שיטות להכנת מבחנים מבוססים מיקרופלואידיקה יכולות להיות קשות ללמוד. כאן אנו מתארים שיטה קלה ליצירת תאי תרבית תאים למדוד נדידת תאים בתגובה הדרגתית ריכוז כימי. המייל הסלולרי שלנושיטה קאמרית הגירה יכולה ליצור הדרגתי ריכוז ליניארי שונה על מנת ללמוד נדידת תאים עבור מגוון רחב של יישומים. שיטה זו היא יחסית קלה לשימוש והיא מבוצעת בדרך כלל על ידי סטודנטים לתואר ראשון. תא microchannel נוצר על ידי צבת הוסף אקריליק בצורה של חדר microchannel הסופי היטב לתוך צלחת פטרי. אחרי זה, פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) נמזג על גבי להכניס את. את PDMS הורש להקשיח ואז להכניס הוסר. זה אפשר ליצירת בארות בכל צורה או גודל רצוי. תאים עשויים להיות שיצטרפו בעתיד תא microchannel, וסוכני מסיסים ניתן להוסיף אחת הבארות על ידי השריית גוש agarose ב הסוכן הרצוי. בלוק agarose מתווסף באחת הבארות, ואת הזמן לשגות תמונות שניתן לנקוט של חדר microchannel על מנת לכמת נדידת תאים. וריאציות שיטה זו יכולה להיעשות עבור יישום נתון, מה שהופך גדולות בשיטה זוhly להתאמה אישית.

איור 2 מציג את התנועה של חזית התא מעבר לתעלה בתגובת שיפוע של בסרום שור העובר להציב בקצה השני של הערוץ מהמקום שבו התאים מצופים. חזית התא מוצגת 48 שעות (איור 2 א), 72 שעות (איור 2 ב), 96 שעות (איור 2 ג), ו -120 שעות ציפוי פוסט <stron...

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration at JoVE.com

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  Clemson University.  פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס. 

Video: A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Developmental Biology

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Cancer Research

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Medicine

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bioengineering

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and epithelial wound healing. Applying a direct current electric field to cultured cells in vitro induces directional cell migration, or galvanotaxis. The 2-dimensional galvanotaxis method we demonstrate here is modified with custom-made poly(vinyl chloride) (PVC) chambers, glass surface, platinum electrodes and the use of a motorized stage on which the cells are imaged. The PVC chambers and platinum electrodes exhibit low cytotoxicity and are affordable and re-useable. The glass surface and the motorized microscope stage improve quality of images and allow possible modifications to the glass surface and treatments to the cells. We filmed the galvanotaxis of two non-tumorigenic, SV40-immortalized prostate cell lines, pRNS-1-1 and PNT2. These two cell lines show similar migration speeds and both migrate toward the cathode, but they do show a different degree of directionality in galvanotaxis. The results obtained via this protocol suggest that the pRNS-1-1 and the PNT2 cell lines may have different intrinsic features that govern their directional migratory responses.

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...