저자는이 프로젝트에 자금을 제공하는 클렘 슨 대학의 크리 에이 티브 귀하의 프로그램과 NSF CBET1254609을 인정합니다.

1. 농도 구배를 만드는 마이크로 챔버를 생산 <ol><li> 아크릴 몰드 피스를 절단 <ol><li> 원하는 폭의 아크릴의 조각을 얻습니다. 일반적으로 16분의 1 인치 두께의 아크릴 시트를 사용합니다. 두꺼운 시트는 그들을 과정에서 깨지거나 왜곡하는 원인이 필요한 기계적 강도를하지 않아도 잘 매우 얇은 시트를 절단하기가 어렵다. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 내에 공동을 생성하기 위해 아크릴 조각의 소망하는 형상의 CAD 파일을 만든다. 개별 실험 프로토콜에 관련된 원하는 경사를 달성하기 위해 채널 폭과 길이를 조정한다. <ol><li> 두 개의 사각형 (0.254 cm X 0.254 cm)를 0.127 cm 폭 채널에 의해 (0.254 cm 길이)에 연결한다 (그림 1) : 여기에, 다음과 같은 크기의 아크릴 조각을 사용합니다. </li></ol></li><li> 마뉘에 따라 레이저 커터에 아크릴 조각을 레이저 절단 장치로 CAD 파일 가져 오기 및 배치의 facturer의 프로토콜입니다. 참고 : 또는, CAD 디자인에서 조각을 3D는-인쇄 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 다른 재료를 주형에 사용될 수 있다는 것이다; 그러나, 해상도 및 재현성은 레이저 가공에 비해 3D 인쇄로 감소 될 수있다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> 그림 1 : 마이크로 채널 상공 회의소의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 대표. 이 이미지는 마이크로 챔버를 작성하는 데 필요한 아크릴 인서트의 CAD 도면을 도시한다. 1 A) CAD 도면, 1B) 인치 치수 도면 CAD의 측면보기, 1C) 인치 치수 도면 CAD의 상위 뷰의 상위 뷰 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="2"><l난&gt;은 폴리 디메틸 실록산 쏟아져 (PDMS) <ol><li> 무게 보트에서, 상업 엘라스토머 경화제 (예를 들어, 실 가드 194)의 1 중량 부와 상업 엘라스토머 자료의 무게 (예를 들어, 실 가드 184)에 의해 10 부 섞는다. 전형적으로, 엘라스토머 경화제 1g에 엘라스토머 기지 10g을 혼합한다. </li><li> 5 분 동안 마이크로 피펫으로 기재와 경화제를 결합 교반한다. </li><li> 진공 벨을 설정하고 갇혀있는 공기 방울을 제거하는 30 분 동안 진공에 PDMS와 무게 보트를 배치합니다. </li><li> 진공을 끄고 무게 보트를 제거합니다. 작은 페트리 접시에 아크릴 컷 아웃의 상단에있는 PDMS를 따르십시오. PDMS의 완전히 삽입을 다루고 있는지 확인합니다. </li><li> PDMS의 실내 온도 (최소 18 시간) 밤새 치료 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> PDMS에서 삽입물을 제거 <ol><li> PDMS의 경화 후, 조심스럽게 메스와 아크릴 조각 주위에 PDMS를 절단하여 삽입물을 제거합니다. </li></ol&gt; </li></ol> 2. 마이크로 챔버 내의 도금 세포 <ol><li> 세포를 도금 챔버를 살균. 주 : PDMS가 에틸렌 옥사이드 또는 다른 기술을 사용하여 소독 될 수 있지만, 짧은 UV 처리는 세포 배양 연구에 대한 빠르고 저렴하고 충분하다. 짧은 UV 처리 기간은 PDMS 부재의 구조 또는 기계적 완전성을 손상하지 않았다. <ol><li> 표준 세포 배양 캐비닛 완전히 70 % 에탄올로 챔버 커버. </li><li> 뚜껑 오프와 층류 후드에 페트리 접시를 넣어. </li><li> 후드를 종료하고 자외선을 켭니다. 1 ~ 2 시간 동안 자외선에 노출. </li><li> 층류 후드를 열고 흐름을 다시 15 분을 기다립니다. </li><li> 70 % 에탄올을 제거합니다. </li><li> 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 챔버를 씻으십시오. 각각의 세척을 위해 PBS 1 ㎖를 사용합니다. PBS를 제거하고 챔버 뚜껑 떨어져 밤새 건조 할 수 있습니다. 참고 : 또는 대신가능한 경우 층류 후드를 사용하는 살균하는 UV 챔버 박스를 사용한다. 알루미늄 호일 늘어선 골판지 상자의 배면에 UV 광원을 배치하여 UV 상자를 만든다. 알루미늄 포일은 샘플 심지어 조명을 허용하도록 광을 반사한다. </li></ol></li><li> 상공 회의소에 세포를 도금 <ol><li> 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. <ol><li> 0.4 % 트리 판 블루의 400 μL의 세포 현탁액 100 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 부드럽게 유리 커버 슬립 아래에 모두 실을 작성하여 혈구이 용액 100 μL를 적용합니다. </li><li> 혈구의 그리드에 초점을 10 배 목표로 현미경을 사용합니다. 혈구 16 사각형의 한 세트에서 라이브 흠없는 세포를 계산하는 손 집계 카운터를 사용합니다. </li><li> 16 사각형의 4 세트에서 세포를 계산합니다. 16 사각형의 4 세트에서 평균 세포 수를 가지고 5 × 4 곱합니다. 마지막 숫자는 한 접점 인세포 현탁액을 세포 / ㎖ (R). </li></ol></li><li> 각 챔버에 잘 하나에 2,500 셀을 추가합니다. 이것은 ~ 30,000 / cm (2)의 거의 융합 세포 밀도로 변환한다. </li><li> 세포가 미디어를 추가하기 전에 60 분 동안 챔버에 앉아 허용 (둘 베코의 수정 이글의 중간, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). </li></ol></li></ol> 3. 덱스 트란 젖 아가로 오스 블록 <ol><li> 아가로 오스 블록 만들기 <ol><li> 3 차원 인쇄 금형 (2mm X 2mm X 2mm)로 아가로 오스 3 %를 붓는다. </li><li> 30 분 모든 거품을 제거하기 위해 아가로 오스는 진공 챔버 내에서 응고 할 수 있습니다. </li><li> 금형에서 아가로 오스 블록을 제거합니다. 주 : 또는 2mm의 두께의 작은 페트리 접시에 3 % 아가로 오스를 붓는다. 메스 또는 다른 절삭 공구를 사용하여 2mm X 2mm X 2mm 블록을 잘라. 이것은 금형 시스템과 같은 정밀한 아니지만 할 좀 더 쉽게 할 수있다. </li></ol></li><li> 완전히 submerg주 화성 인자의 원하는 농도의 용액 E 아가 블록. 농도 구배의 형성을 평가하기 위해, 형광 덱스 트란과 함께 첫번째 챔버를 세척. 덱스 트란의 농도 및 분자량 수용성 인자 또는 관심의 약물의 일치해야합니다. </li><li> 아가로 오스 블록 하룻밤을 만끽 해보세요. </li></ol> 가용성의 인자 농도 구배를 평가하는 덱스 트란 확산의 4 시간 경과 <ol><li> 마이크로 챔버의 작은 사각형 웰 덱스 트란 젖은 아가로 오스 블록을 배치합니다. </li><li> 세포 이미징 시스템의 마이크로 챔버를 놓거나 저속 기능과 다른 형광 현미경을 사용한다. 제조업체의 지침에 따라 시간 경과를 시작합니다. 참고 : 표시된 결과는 GFP 필터, 50 %의 빛, 4/10의 pH 및 4 배 배율로 촬영하고 있습니다. </li></ol> 세포 성장의 5 시간 경과 <ol><li> 의 일단 마이크로 챔버 플레이트 세포방. 여기 3T3 섬유 아세포를 사용합니다. 마이크로 챔버에 잘 하나에 2,500 셀을 추가합니다. 2.2.1에 설명 된대로 세포를 계산합니다. <ol><li> 세포가 미디어를 추가하기 전에 60 분 동안 챔버에 앉아 허용 (둘 베코의 수정 이글의 중간, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). 5 % CO 2에서 37 ℃에서 도금 셀과 마이크로 챔버를 유지한다. 채널을 통해 세포 이동은 현미경으로 볼 수 있습니다. </li><li> 마커를 추가하거나 거리를 셀 전방 이동을 정량화하기위한 출발점 역할을하기 위해 마커로 챔버 내에서 미세한 결함을 사용합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스 겔 (8mm 3 블록)를 포함하는 배치하여 구배를 마련 농축 성장 인자, 화학 - 유인 제는 약물 또는 다른 인자 테스트되는 마이크로 채널의 한쪽 끝 (여기에서는, 40 % FBS가 예로서 사용되는) 방. </li><li> 이동 셀 앞의 시간 경과 이미지를 가져 가라. 여기서, 결과는 이리저리 셀의 이미지 표시NT 즉, 촬상 시스템을 이용하여 12 시간마다 촬영 하였다. </li><li> 세포 성장을 정량화 셀 앞에 사진을 사용한다. 첫번째 셀 전면 채널 벽 및 기준 마커에 의해 정의되는 다각형 마스크를 만드는 (roipoly)에 MATLAB polyfit의 기능을 이용하여 성장 속도를 계산한다. 이 마스크의 크기는 평균 셀 전면의 속도를 산출하는 전방의 이동 거리를 얻었다. 다른 연구는 유사한 방법 8을 이용했다. 참고 : 동일한 거리 가용성 인자의 농도로 각 프레임에 대한 세포 성장 전면의 가장자리를 비교한다. 가용성 인자의 농도 구배가 1 차원 확산 모델 근사치를 이용하여 계산된다. </li><li> Phalloidin의 및 DAPI 염색을 이용하여 세포의 형광 이미지를 가져 가라. <ol><li> Phalloidin의 염색하기 전에 세포를 수정. <ol><li> 37 ° C에서 따뜻한 4 % 파라 포름 알데히드. </li><li> 세포를 커버하기에 충분한 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. 세포 보관10 분 동안 파라 포름 알데히드. </li><li> 15 분마다 두 번 PBS로 씻어. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. </li></ol></li><li> 세포에서 PBS를 제거하고 세포를 커버하기에 충분한 permeabilizing 솔루션 (PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100)를 추가합니다. 10 분 동안 솔루션을 둡니다. </li><li> 각 5 분 동안 PBS로 두 번 세척 하였다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. </li><li> 세포에서 PBS를 제거하고 20 분 동안 솔루션 (PBS에 1 % 소 혈청 알부민)를 차단 추가합니다. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 5 분마다 PBS로 2 회 세척한다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. </li><li> 사용하지 않을 때이 점에서, 알루미늄 호일로 광으로부터 세포를 보호한다. 세포에서 PBS를 제거하고 1 시간 동안 PBS에 희석 Phalloidin의 488 1:50 추가합니다. </li><li> 각 세척에 대한 5 분 PBS에 2 회 반복한다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. 그런 다음 셀에서 PBS를 제거합니다. </li><li> 15 분 동안 세포를 PBS로 1,000 : DAPI (4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌)를 추가 한 희석. </li><li> 제거 DAPI와각 세척에 대한 5 분 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 마지막 세척을 제거하고 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 추가합니다. 세포는 이제 형광 현미경으로 이미지화 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리 마이크로 챔버는 성장 인자 및 화학 유인 물질에 반응하여 세포의 이동 속도를 결정하고, 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정을 포함 목적의 다수를 위해 사용될 수있다. 이 세포를 성장 챔버의 일단에 화학 유인 물질을 배치하기 위해 마이크로 챔버를 이용할 수있다. 세포는 화학 주성 인자에 반응하여 증가하고, 세포 이동은 세포의 이동 속도를 결정하기 위해 분석 될 수있다 ...

In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent</td></tr><tr><td>Acrylic Sheets</td><td>US Plastic</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&amp;ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Type I, Low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Instrument used for taking time-lapse images</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&amp;nbsp;</td><td>Model number VLS2.30</td><td>Laser cutter used for cutting plastic</td></tr></tbody></table>

a customizable chamber for measuring cell migration

세포 이동은 면역 반응, 성장 및 상처 치유의 중요한 부분이다. 세포 이동은 세포, 세포 외 매트릭스와 수용성 및 비 수용성 화학 인자 (예, 화학 유인 물질) 사이의 상호 작용을 포함하는 복잡한 과정이다. 예 보이든 챔버 분석, 칸막이의 양측에 세포를 카운트함으로써 작업 등의 세포의 이동을 측정하기위한 표준 방법. 이 기술은 사용하기 쉽고; 그러나, 서로 다른 애플리케이션 작은 기하학적 변형을 제공한다. 대조적으로, 마이크로 유체 장치는 가용성 요소들 (1, 2)의 맞춤형 농도 기울기를 가진 세포의 이동을 관찰 할 수있다. 그러나, 미세 유체 기반의 분석을 만들기위한 방법을 배우기 어려울 수 있습니다. 여기서는 화학적 농도 기울기에 응답하여 세포 이동을 측정하기 위해 세포 배양 챔버를 생성하는 편리한 방법을 설명한다. 우리의 세포 마일연계 가능성 챔버 방법은 다양한 애플리케이션에 대해 세포 이동을 연구하기 위해 다양한 선형 농도 구배를 생성 할 수있다. 이 방법을 사용하는 것이 상대적으로 용이하고 일반적으로 학부 학생들에 의해 수행된다. 마이크로 챔버는 잘 페트리 접시에 최종 마이크로 챔버의 모양 아크릴 삽입을 배치하여 만들어졌습니다. 그 후, 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)의 삽입 위에 부었다. PDMS의가 경화시킨 후 삽입물을 제거 하였다. 이것은 어떤 원하는 모양이나 크기 우물의 생성을 허용했다. 이어서, 세포 마이크로 챔버에 첨가 될 수 있고, 가용 화제는 요구 에이전트에 아가 블록 담가 웰 중 하나에 첨가 될 수있다. 아가 블록 웰 중 하나에 첨가하고, 저속 이미지는 세포 이동을 정량화하기 위해 마이크로 챔버로 촬영 될 수있다. 이 방법의 변형이 방법 HIG을, 특정 응용 프로그램에 대해 할 수있다hly 사용자 정의 할 수 있습니다.

도 2는 세포가 도금되는 위치에서 상기 채널의 대향 단부에 배치 된 소 태아 혈청의 구배에 응답하여 상기 채널을 통해 상기 셀 전면의 이동을 나타낸다. 셀 앞에 48 시간 (그림 2A), 72 시간 (그림 2B), 96 시간 (그림 2C), 120 시간 (그림 2D) 후 도금에 표시됩니다. 셀 전면의 이동이 경과 이미지를 추적하고, 이동 거?...

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A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 조회수.  Clemson University.  이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형. 

비디오: A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

연구

발생학

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

암 연구학

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

의학

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

생체공학

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

생물학

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and epithelial wound healing. Applying a direct current electric field to cultured cells in vitro induces directional cell migration, or galvanotaxis. The 2-dimensional galvanotaxis method we demonstrate here is modified with custom-made poly(vinyl chloride) (PVC) chambers, glass surface, platinum electrodes and the use of a motorized stage on which the cells are imaged. The PVC chambers and platinum electrodes exhibit low cytotoxicity and are affordable and re-useable. The glass surface and the motorized microscope stage improve quality of images and allow possible modifications to the glass surface and treatments to the cells. We filmed the galvanotaxis of two non-tumorigenic, SV40-immortalized prostate cell lines, pRNS-1-1 and PNT2. These two cell lines show similar migration speeds and both migrate toward the cathode, but they do show a different degree of directionality in galvanotaxis. The results obtained via this protocol suggest that the pRNS-1-1 and the PNT2 cell lines may have different intrinsic features that govern their directional migratory responses.

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

전립선 세포의 방향 마이그레이션 연구에 맞춤 설계 Galvanotaxis 챔버를 활용

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...