Name: a customizable chamber for measuring cell migration
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
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著者は、このプロジェクトのための資金を提供するためのクレムソン大学のクリエイティブ照会プログラムとNSF CBET1254609を認めます。

1.濃度勾配を作成するためにマイクロチャンネル発生室<ol><li> アクリル成形型部品を切削 <ol><li>所望の幅のアクリルの一部を取得します。典型的には、1/16インチ厚のアクリルシートを使用。より厚いシートは、それらが処理中に破損したり、ワープさせ、必要な機械的強度を持っていないだけでなく、非常に薄いシートをカットすることは困難です。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）内に空洞を生成するためにアクリル片の所望の形状のCADファイルを作成します。個々の実験プロトコルに関連する目的の勾配を達成するために、チャネル幅と長さを調整します。 <ol><li> 0.127センチメートル広いチャネル（0.254センチメートル長い）（ 図1）によって接続された2つの正方形（のx 0.254センチメートル0.254センチメートル）：ここでは、以下の寸法のアクリル作品を使用しています。 </li></ol></li><li>レーザー切断装置にCADファイルをインポートし、マヌーに応じてレーザーカッターでアクリルピースを配置facturerのプロトコル。 注：別の方法として、CAD設計から作品を3D-印刷します。この方法の利点は、代替材料が金型に使用することができることです。しかしながら、分解能および再現性は、レーザー切断に比べて三次元印刷に減少させることができます。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> 図1：マイクロチャンネル商工会議所のコンピュータ支援設計（CAD）表現。この画像は、マイクロチャネルのチャンバを作成するために必要なアクリルインサートのCAD図面を示します。 1 A）CAD図面、1B）インチに寸法とCAD図面の側面図、 図1C）インチに寸法とCAD図面の上面図の上面図<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li&gt;は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を注ぎます <ol><li>計量ボートでは、商業用エラストマー硬化剤（ 例えば 、シルガード194）1重量部で商業エラストマーベース（ 例えば 、シルガード184）10重量部を混合します。一般的に、エラストマー硬化剤の1グラムにエラストマーベースの10グラムを混ぜます。 </li><li> 5分間、マイクロピペットを用いて塩基及び硬化剤を組み合わせることかき混ぜます。 </li><li>真空ベルを設定し、閉じ込められた気泡を除去するために30分間真空中でPDMSと計量ボートを配置します。 </li><li>真空の電源を切り、計量ボートを削除します。小さなペトリ皿にアクリルカットアウトの上にPDMSを注ぎます。 PDMSが完全に挿入をカバーしていることを確認してください。 </li><li> PDMSは、室温で一晩（少なくとも18時間）を硬化させます。 </li></ol></li><li> PDMSからの挿入を削除します <ol><li> PDMSを硬化させた後、慎重にメスでアクリル作品の周りにPDMSを切断することにより、インサートを取り外します。 </li></ol&gt; </li></ol> 2.マイクロチャネルチャンバー内の細胞をプレーティング<ol><li> 細胞をプレーティングするためのチャンバを殺菌します。 注：PDMSは、エチレンオキシドまたは他の技術を用いて滅菌することができるが、迅速なUV処理は、迅速、安価、および細胞培養研究のために十分です。短いUV処理時間はPDMS片の構造又は機械的完全性を損ないませんでした。 <ol><li>標準的な細胞培養キャビネット内に、完全に70％エタノールを用いてチャンバを覆います。 </li><li>蓋をオフにして、層流フード内でペトリ皿を置きます。 </li><li>フードを終了し、UV光をオンにします。 1〜2時間UV光にさらします。 </li><li>層流フードを開き、流れを再確立するために15分を待ちます。 </li><li> 70％エタノールを削除します。 </li><li>滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回チャンバを洗浄します。各洗浄のために1mLのPBSを使用してください。 PBSを削除し、室は蓋をオフにして一晩乾燥させます。 注：別の方法として、代わりに1が利用可能な場合、層流フードを使用しての、滅菌のためにUVチャンバーボックスを使用します。アルミホイルを敷いた段ボール箱の裏面にUV光源を配置することによって、UVボックスを作成します。アルミ箔は、サンプルの均一な照明を可能にするために光を反射します。 </li></ol></li><li> チャンバー内の細胞をプレーティング <ol><li>トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を数えます。 <ol><li> 0.4％トリパンブルーの400μLに100μLの細胞懸濁液を加え、穏やかに混合。静かにカバーガラスの下で両室を充填することにより、血球計数器に、この溶液100μLを適用します。 </li><li>血球計数器上のグリッドに注力して10X対物レンズで顕微鏡を使用してください。血球計数器上の16の正方形の1セット内生非染色細胞をカウントするために手の数取器を使用してください。 </li><li> 16の正方形のすべての4組のセルをカウントします。 16の正方形の4セットからの平均細胞数を取り、5×10 4を掛け。この最後の番号はnumbeです細胞懸濁液中の細胞/ mLのR。 </li></ol></li><li>各チャンバ内の1つのウェルに2,500細胞を追加します。これは〜3万/ cm 2の近コンフルエント細胞密度に変換されます。 </li><li>細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。 </li></ol></li></ol> 3.デキストラン浸しアガロースブロック<ol><li> アガロースブロックを作成します <ol><li> 3Dプリントモールド（2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートル）にアガロース3％を注ぎます。 </li><li>アガロースは、任意の気泡を除去するために30分間、真空チャンバー内に固化することができます。 </li><li>金型からアガロースブロックを削除します。 注：別の方法として、2ミリメートルの厚さで小さなペトリ皿にアガロース3％を注ぎます。メスまたは他の切削工具を使用して、2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートルのブロックをカット。これは、金型システムのように正確ではありませんが、それを行うのは少し楽にすることができます。 </li></ol></li><li>完全submerg走化性因子の所望の濃度の溶液中での電子アガロースブロック。濃度勾配の形成を評価するために、蛍光デキストランで第一室をフラッシュします。デキストランの濃度および分子量は、目的の可溶性因子または薬物のそれと一致する必要があります。 </li><li>アガロースブロック一夜を浸します。 </li></ol>可溶性因子の濃度勾配を評価するために、デキストラン拡散の4タイムラプス<ol><li>マイクロチャネル室の小さな正方形のウェルにデキストラン浸したアガロースブロックを配置します。 </li><li>セルイメージングシステム内のマイクロチャネル室を配置したり、タイムラプス機能を備えた別の蛍光顕微鏡を使用しています。製造元の指示に従ってタイムラプスを開始します。 注：示された結果は、GFPフィルター、50％の光、4月10日のpH、および4倍の倍率で撮影されています。 </li></ol>細胞増殖の5タイムラプス<ol><li>の一端にマイクロチャネルチャンバー内板細胞チャンバー。ここでは、3T3線維芽細胞を使用しています。マイクロチャネルチャンバー内で1つのウェルに2,500細胞を追加します。 2.2.1で説明したように、細胞をカウントします。 <ol><li>細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。 5％CO 2中37℃で播種した細胞とマイクロチャンネル室を保管してください。チャネルを介して細胞遊走を顕微鏡で見ることができます。 </li><li>マーカーを追加または距離セルフロントの動きを定量化するための出発点として機能するために、マーカーとしてチャンバ内の微小欠陥を使用します。 </li></ol></li><li>マイクロチャネルの一方の端部に集中し、成長因子、化学誘引物質、薬物、または他の因子が試験される（ここで、40％FBSを例として使用されている）を含むアガロースゲル（8 mm 3でブロック）を配置することによって勾配を確立しますチャンバー。 </li><li>移動セルフロントのタイムラプス画像を撮影します。ここでは、結果があちこちセルの画像を表示しますNTイメージングシステムを用いて12時間ごとに採取したもの。 </li><li>細胞増殖速度を定量化するために、セルの前面の写真を使用してください。最初のセルのフロント、チャネル壁、及び基準マーカによって定義される多角形のマスクを作成する（roipoly）MATLABの関数polyfitを使用して、増殖速度を計算します。このマスクの寸法は、平均セルフロント速度が算出されたフロントの移動距離をもたらします。他の研究では、同様の方法8を利用しています。 注：同じ距離で可溶性因子の濃度になるように、各フレーム上の細胞増殖前面の縁を比較してください。可溶性因子の濃度勾配は、1次元拡散モデルの近似を用いて計算されます。 </li><li>ファロイジンおよびDAPI染色を用いて細胞の蛍光画像を撮ります。 <ol><li>ファロイジンで染色する前に細胞を固定。 <ol><li> 37℃で温め、4％パラホルムアルデヒド。 </li><li>セルをカバーするのに十分な4％パラホルムアルデヒドを加えます。で細胞を保ちます10分間パラホルムアルデヒド。 </li><li> 15分間、PBSで2回、それぞれの時間をすすぎます。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。 </li></ol></li><li>細胞からPBSを除去し、細胞をカバーするのに十分な透過化溶液（PBS中0.1％トリトンX-100）を追加します。 10分間この溶液を残します。 </li><li>毎回5分間、PBSで2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。 </li><li>細胞からPBSを除去し、20分間溶液（PBS中の1％ウシ血清アルブミン）でブロッキング加えます。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、5分間PBSで各回2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。 </li><li>使用されていない場合、この時点から、アルミニウム箔で光から細胞を保護します。細胞からPBSを削除し、1時間、PBSで希釈したファロイジン488 1:50に追加します。 </li><li>各洗浄のための5分間、PBS中で2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。次に、細胞からPBSを削除します。 </li><li> 15分間、細胞をPBS 1,000：DAPI（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を追加し、1に希釈しました。 </li><li> DAPIを削除し、各洗浄のための5分間PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>最後の洗浄を削除し、セルをカバーするのに十分なPBSを追加します。細胞は、現在、蛍光顕微鏡で画像化することができます。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li><li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis.">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li><li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+study+fibroblast+migration.">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li><li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+Factors,+Matrices,+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells.">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li><li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#181;-Slide+Chemotaxis:+A+new+chamber+for+long-term+chemotaxis+studies.">&#181;-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+Chamber+Assay.">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models.">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li><li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber.">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li><li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette.">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li><li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy.">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations.">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies.">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li><li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device.">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+devices:+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration.">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).</li><li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research.">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li><li>Tang, S. K., Whitesides, G. M., Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. , (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research).">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li><li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains.">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々のマイクロチャネル室は、成長因子及び化学誘引物質に応答した細胞遊走の速度を決定し、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することを含む、目的の多数のために使用することができます。細胞を増殖し、チャンバの一端に化学誘引物質を配置するために我々のマイクロチャネル室を利用することが可能です。細胞は、化学誘引物質に応答して成長し、細胞遊走、細胞移動速度を決定するために分析することができるタイムラプス画像を撮影することによって定量することができます。この方法の代表的な結果は、成長速度は、MATLAB関数polyfitを使用して13.4ミクロン/時間であると決定された、図3に示されています。 我々のマイクロチャネル室の別の使用は、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することです。関心対象の薬剤と同様の分子量の蛍光タグ付けされたデキストランはDRUの拡散をモデル化するために使用することができます興味のあるグラム。サンプルは、勾配を崩壊させるだろう対流の大量として慎重に取り扱わなければならないことに留意することが重要です。この方法の代表的な結果を図4に示します。ボイデンチャンバーアッセイと比較してこのモデルの利点は、それがために平らな表面の付着細胞型に対してより適用可能であることです。一方、細胞が接着する前に、Boydenチャンバー内の小さな管を通って落下する必要があります。ボイデンチャンバーアッセイの別の制限は、エンドポイントアッセイであることです。従って、走化性を目視で観察することができません。これとは対照的に、我々の方法では、走化性は、タイムラプス画像9を通して観察されます。化学誘引物質を含有するマイクロピペットの使用は、細胞遊走を観察する方法が用いられてきました。しかし、この方法の主な欠点は、低いスループット10です。ダンの走化性チャンバーは番目のようなタイムラプスイメージングと組み合わせて使用​​されている別のアッセイでありますE法は、ここで図11、 図12を詳述します。チャンバは、内側と外側のウェルを作成するために、スライドガラスの表面に刻まれた2つの同心円からなり、ブリッジが2つのウェルを分離します。化学誘引物質は、外側のウェル内に配置され、細胞は、外側のウェルに内側のウェルから移行することを許可されています。この移行は、画像解析ソフトウェアを用いて分析されたタイムラプス画像を用いて定量します。ボイデンアッセイと同様に、ダンチャンバーアッセイの限界の一つは、容易にカスタム可溶性因子の濃度勾配を作成するように変更することができないことです。 細胞移動を評価するための別の簡単な技術は、インビトロ 13スクラッチです。それだけで以前に作成したスクラッチに近い細胞移動のタイムラプス画像の細胞単層およびキャプチャでスクラッチを作成する必要があり、この方法は、高速かつ安価です。 HowevER、この方法の主な欠点は、化学的因子の濃度勾配に応答を測定するのに適していないということです。私たちの方法は、化学勾配を作成し、化学的勾配に細胞遊走を相対定量化する可能性を提供しています。走化性因子は、マイクロチャネルチャンバーのウェルの中に存在している間我々の方法は、細胞単層に作成することができるスクラッチなどの傷の方法と組み合わせることができます。これは、創傷治癒の定量化とモデリングを可能にします。我々の装置の別の潜在的な適用は、細胞増殖を阻害する薬剤に対する癌細胞の応答を決定することです。 他のマイクロ流体ベースのシステムはまた、細胞遊走実験14、15のために使用されています。これらの研究は、シリコンウェーハ内のマイクロ流体チャネルを作成するために、シリコンおよび/またはレーザー加工でマスターモールドを作成するためにクリーンルームでリソグラフィ技術を利用します。シリコンwafeRマイクロ加工は、マイクロチャネルのチャンバを製造する安価な材料（PDMS及びアクリル）を利用する手法と比較して高価であることができます。我々のデバイスは、小型の3次元チャネル15を作成することは不可能であった他のPDMSベースのマイクロ流体デバイスの限界を克服します。我々の方法では、我々が正常に小径チャンネルをPDMSベースのデバイスを作成しました。他の研究では、マイクロチャネルの二つの層を有するPDMSベースのマイクロ流体デバイスおよび酸素16の異なる勾配で細胞の遊走を研究するために、酸素の任意の勾配を作成するために、コンピュータ制御されたマルチチャンネルガス混合器を使用しています。我々のデバイスは、マイクロチャネルのチャンバの一端にガス混合室を添加して同様の方法で使用するための可能性があります。 マイクロ流体デバイスは、多くの場合、ソフトリソグラフィ技術を用いて作製されます。これらは、細胞遊走chambeを生成するように構成することができますRS。これらの方法は、コンピュータ支援設計（CAD）を有するチャネルパターンを有するマスクを印刷することを含みます。これらのマスクは、その後、光リソグラフィを介して感光性レジストで被覆されたマスターモールド上に投影されています。マスターモールドが行われた後、PDMSをマスタに注ぎ、マイクロ流体研究17、18、19のために使用することができるPDMS金型を作成するために硬化させます。化学誘引物質または化学反発化合物は、勾配17を作成するために、リザーバのいずれかに高濃度でチャンバー内に配置されています。これらの技術は私たちのセットアップに似ていますが、それらは、システムおよびクリーンルームの使用のためのマスターモールドを作成する高コストのために高価になることができます。学生はクラスベースの設定で学習するために加えて、これらの方法は、困難であり得ます。チャネルを作成するために私たちのセットアップに使用されるインサートは、3D広報を含む種々の方法で作成することができますintingとレーザー切断。したがって、我々のシステムは、3Dプリントは、より手頃な価格で広く利用可能になり、特に、比較的低コストのための金型の多種多様を作成できます。 細胞遊走および増殖を測定するためのマイクロ流体デバイスをベースPDMSは、広範囲の用途に使用されています。例えば、神経科学の研究は、デバイスは、PDMS成分を可能にするために、ミクロンサイズの溝に物理的バリアによって分離された2つの区画を形成するために、組織培養皿またはガラス上に載置されたソフトリソグラフィー技術を用いて製造した、20研究します区画全体で成長するニューロン。タイムラプス画像は、関門を通過するニューロンを示すために取られました。我々のデバイスの製造方法が簡単であり、すべてのレベルの研究者によって使用することができるが、このデバイスを製造するために使用される微細の方法は、複雑です。別の研究ではまた、SIを製造するための簡単な低コストの方法を使用しマイクロチャネルを生成するために、PDMSで印象を作成するために、スコッチテープから作成されたマスターモールドを使用してmilar PDMSマイクロ流体デバイス。この方法で説明した1以上の我々のアプローチの利点は、このプロトコルは、細胞21への媒体流の問題を作成する2 PDMS層の間の接着性を必要とする私たちの方法でチャネルは、1工程で作製されていることです。 結論として、我々のマイクロチャネルチャンバー法はカスタマイズ可能であり、異なる結果を得るために使用することができます。メソッドは、ユーザーのニーズに合うために濃度勾配を作成できます。さらに、我々のデバイスは、その比較的低いコストとあらゆるレベルの研究者のための使いやすさに、既存のデバイスに勝る利点を提供しています。

In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent</td></tr><tr><td>Acrylic Sheets</td><td>US Plastic</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&amp;ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Type I, Low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Instrument used for taking time-lapse images</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&amp;nbsp;</td><td>Model number VLS2.30</td><td>Laser cutter used for cutting plastic</td></tr></tbody></table>

a customizable chamber for measuring cell migration

細胞遊走は免疫応答、成長、および創傷治癒の重要な一部です。細胞遊走は、細胞外マトリックス、および可溶性および非水溶性の化学的因子（ 例えば 、化学誘引物質）との間の相互作用が関与する複雑なプロセスです。このようなボイデンチャンバーアッセイ、分周器のいずれかの側に細胞を計数することにより、作業のような細胞の遊走を測定するための標準的な方法。これらの技術は、使いやすいです。しかし、彼らは、異なるアプリケーションのために少しの幾何学的修正を提供しています。対照的に、マイクロ流体デバイスは、可溶性因子1、2のカスタマイズ可能な濃度勾配を有する細胞遊走を観察するために使用することができます。しかし、マイクロ流体ベースのアッセイを作製するための方法は、学ぶことは困難な場合があります。 ここでは、化学物質の濃度勾配に応答して細胞遊走を測定するための細胞培養チャンバを作成するための容易な方法を記載します。私たちの細胞マイルグレーションチャンバー法は、様々な用途のための細胞移動を研究するために、別の直線濃度勾配を作成することができます。この方法は、使用が比較的容易であり、典型的には学部学生によって行われます。 マイクロチャンネル室はよくペトリ皿に、最終的なマイクロ流路室の形状のアクリルインサートを配置することによって作成されました。この後、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）は、インサートの上に注ぎました。 PDMSを硬化させ、次いで、インサートを除去しました。これは、任意の所望の形状や大きさのウェルの作成を可能にしました。細胞は続いてマイクロチャネルチャンバーに添加することができる、可溶性薬剤は、所望の薬剤にアガロースブロックを浸漬することによってウェルのいずれかに添加することができます。アガロースブロックをウェルのいずれかに添加し、タイムラプス画像は、細胞遊走を定量するために、マイクロチャネル室を撮影することができます。この方法のバリエーションは、このメソッドのHIGを作り、所与の用途のために作ることができますHLYカスタマイズ可能。

図2は、細胞がメッキされているところから、チャネルの反対側の端部に配置されたウシ胎児血清の勾配に応じて、チャネル全体のセルフロントの動きを示しています。細胞フロント48時間（ 図2A）、72時間（ 図2B）、96時間（ 図2C）、および120時間（ 図2D）ポストプレーティングで示されています。セルフロントの移動は、これらのタイムラプス画像で追跡し、移動距離と成長率は、MATLABの関数polyfitによって計算しました。このことから、平均セルフロント速度が13.4ミクロン/時（ 図3）であることが見出されました。 図4は、チャネルの一端にデキストラン浸したアガロースブロックを配置し、デキストランは、12時間のためのチャネルを通って拡散することを可能にすることによって確立された蛍光勾配を示しています。タイムラプス画像は、毎時間で撮影した、との距離を横断蛍光ました<html> 図4に示されており、1次元拡散モデルと比較してチャネルを測定し、プロットしました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig2.jpg" /> 図2：細胞フロントムーブメント。チャネルを通って移動するマイクロチャネルチャンバー内の細胞フロントのタイムラプス画像。セルの前面には、オレンジ色の線でマークし、移動距離は含まれています。示すように、この移動距離は、プレート上のマークからの細胞前部の前面に測定しました。 、1mmのスケールバーは白色で示されています。 A）48時間後メッキ、B）72時間後メッキ、C）96時間後メッキ、D）120時間後のめっき。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> E 3 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：成長率の計算。タイムラプス画像で追跡セルフロントの動き。成長速度が13.4ミクロン/時間の平均セルフロント速度を得るためにMATLABの関数polyfitを（roipoly）を用いて計算しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig4.jpg" /> 図4：デキストランと蛍光グラデーション。蛍光強度は、各行が特定の時間での勾配を表し、チャネルの距離を横断して測定します。 ImageJの蛍光強度を算出しました。これは、分析使用して行うことができます|ものさしツール。まず、分析し、選択強度の下にセット測定を選択します。そして、AVE取得するために、分析の下でメジャーを選択怒りの画素強度。この図に示すように、これは、ミクロン単位での距離に対してプロットすることができます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。

細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K ビュー.  Clemson University. このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。 

ビデオ: A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

発生生物学

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

がん研究

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

医学

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

生物工学

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

生物学

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and epithelial wound healing. Applying a direct current electric field to cultured cells in vitro induces directional cell migration, or galvanotaxis. The 2-dimensional galvanotaxis method we demonstrate here is modified with custom-made poly(vinyl chloride) (PVC) chambers, glass surface, platinum electrodes and the use of a motorized stage on which the cells are imaged. The PVC chambers and platinum electrodes exhibit low cytotoxicity and are affordable and re-useable. The glass surface and the motorized microscope stage improve quality of images and allow possible modifications to the glass surface and treatments to the cells. We filmed the galvanotaxis of two non-tumorigenic, SV40-immortalized prostate cell lines, pRNS-1-1 and PNT2. These two cell lines show similar migration speeds and both migrate toward the cathode, but they do show a different degree of directionality in galvanotaxis. The results obtained via this protocol suggest that the pRNS-1-1 and the PNT2 cell lines may have different intrinsic features that govern their directional migratory responses.

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...