CG è sostenuto da sovvenzioni dal Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), a titolo del Settimo programma quadro dell&#39;Unione europea (Marie Curie integrazione carriera n˚8304162) e dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell&#39;ambito di Orizzonte dell&#39;Unione europea 2020 programma di ricerca e innovazione (ERC Starting Grant n˚639300).

1. Ligand coniugazione di biglie magnetiche Nota: coniugazione Ligand viene eseguita utilizzando superparamagnetiche perline tosyl-attivato con un 2,8 micron di diametro (concentrazione della soluzione 10 8 perline / mL, 30 mg perline / ml). Il seguente protocollo si basa su campioni di circa 2 x 10 5 cellule, che corrispondono alle MRC-5 cellule cresciute al 80% di confluenza in una piastra di coltura tissutale 60mm. Regolare il volume di perline e reagenti di conseguenza se si utilizza lastre di dimensioni diverse o cellule in diverse confluenze. Utilizzare una quantità di perline superparamagnetici per avere 2 perle per cella. Pertanto, 4 x 10 5 perline sono necessari per una piastra 60 mm. <ol><li> Accuratamente risospendere le sfere nel flacone originale vortex almeno 30 s. Aliquota 40 ml di perline superparamagnetiche risospesa (corrispondenti a 4 x 10 6 sfere) in 1,5 ml provetta. </li><li> Posizionare il tubo su una Separati magneticasul basamento per separare le perline magnetiche dalla soluzione. Eliminare il surnatante, rimuovere il tubo dal supporto separazione magnetica e risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M Na-fosfato pH 7.4. <ol><li> Ripetere la fase di lavaggio due volte con 1 ml di 0,1 M Na-fosfato pH 7.4. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M Na-fosfato pH 7.4. </li><li> Unire 100 mcg bovina fibronectina (FN) o qualsiasi altro recettore adesione delle cellule ligando al 1 ml 0,1 M Na-fosfato pH 7.4 contenente microsfere e mescolare pipettando. </li><li> Ripetere passaggi precedenti sostituendo FN o qualsiasi altro legante specifico con BSA, poli-D-lisina o apo-transferrina per i controlli negativi. </li><li> Facoltativamente, per l&#39;analisi del gel, prendere una aliquota di 10 ml di soluzione ligando per l&#39;analisi di efficienza reticolazione e mescolare con un volume adeguato di concentrato Laemmli Sample Buffer. </li><li> Incubare perline con la soluzione contenente ligando per 12-24 ore a 37 ° C in un rotore. </li><li> Se aggregati tallone compaiono dopo la reazione si è verificato, ultrasuoni (continua Potenza 39 W) per non più di 10-20 s. </li><li> Isolare le perline con supporto separazione magnetica, aspirare la soluzione rimanente e aggiungere 1 ml di PBS / 0,2% di BSA pH 7,6 soluzione. Incubare per 1 ora a rotore a 37 ° C. </li><li> Lavare perline usando un magnete due volte con 1 ml di PBS / 0.2% BSA pH 7,6. perline risospendere in 1 ml di PBS / 0.2% BSA pH 7,6. </li><li> perline Sonicare se aggregati appaiono per non più di 20-30 s. </li><li> Facoltativamente, rimuovere una aliquota di 10 microlitri di analizzare l&#39;efficienza di accoppiamento da Western Blot (mescolare con un volume adeguato di concentrato soluzione tampone Laemmli). </li><li> Procedere alla cella saggi o perline Conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li><li> Facoltativamente, eseguire un gel SDS-PAGE e macchia con Coomassie blu per analizzare FN reticolazione alle sfere magnetiche. </li></ol> 2 applicazione di forze tensionali sulle Beads Ligand rivestite Bound di Adesione recettori presenti sulla dorsaleSuperficie delle cellule <ol><li> Culture cellule aderenti in 60 millimetri piatto di coltura tissutale nel terreno di coltura appropriato (di solito DMEM 4,5 g / L D-glucosio integrato con FCS 10%) fino a raggiungere l&#39;80% di confluenza. </li><li> Preparare tampone di lisi non denaturante non ionico (20 mM Tris HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 0,1% NP-40) Tubi e rilassarsi microcentrifuga. </li><li> Pellet le perline ligando rivestite da sezione 1.10 e risospendere in 1 ml di PBS / 0.2% BSA pH 7,6. Aggiungere 100 ml della soluzione di perline ligando rivestite di 5 ml di terreno di coltura caldo e vortice. </li><li> Aspirare media in 60 millimetri piatto cultura e aggiungere 5 ml di mezzo di crescita caldo integrato con perline. </li><li> Incubare per 20 minuti in condizioni di coltura cellulare (37 ° C e 5% CO 2) per consentire alle sfere di sedimenti e aderire alle cellule. E &#39;fondamentale non superare 20 minuti da perline possono essere internalizzati dalla fagocitosi. </li><li> Opzionalmente, osservare le perline sotto un microscopio ottico con un 10X o 20X objective e verificare l&#39;adesione tallone leggermente agitando il piatto di discriminare tra perline attaccate e galleggianti. </li><li> Mantenendo il piatto cultura nell&#39;incubatrice, scambiare la normale coperchio piatto per un coperchio con un tondo 38 millimetri magnete al neodimio attaccato sulla faccia superiore. Il magnete è tenuto in posizione da due piccoli magneti al neodimio 13 mm posizionato sulla faccia inferiore del coperchio. Poiché i magneti sono molto potenti, manipolarle con attenzione. </li><li> Incubare le cellule sottoposte a tensione per i punti di tempo desiderati in condizioni di coltura cellulare (37 ° C e 5% CO 2). </li><li> Dopo il trattamento, posizionare piatto su ghiaccio e accuratamente aspirare l&#39;intero supporto dal piatto. </li><li> Aggiungere 300 ml di tampone di lisi cellulare, e incubare per 10 min in ghiaccio. Raccogliere il lisato utilizzando un raschietto cellulare e trasferirli in un pre-raffreddata 1,5 ml provetta. </li><li> Pellet le perline magnetiche utilizzando il supporto separazione magnetica e trasferire il lisato cellulare totale in un pre-raffreddamentocato 1,5 ml provetta. Conservare questa frazione a -20 ° C per ulteriori analisi. </li><li> Lavare le perline 3 volte con 1 ml di tampone di lisi ghiacciata. Aggiungere 50 microlitri di tampone campione Laemmli al pellet tallone, mescolare pipettando e far bollire a 95 ° C per 5 minuti utilizzando un riscaldatore a secco. Questa frazione contiene gli isolati complessi di adesione. Procedere alla analisi biochimiche o conservare a -20 ° C. </li><li> Dal lisato cellulare totale ottenuto dopo la separazione perline (circa 300 ml), rimuovere una aliquota di 50 microlitri per l&#39;analisi Western Blot. NOTA: Le 250 microlitri di sinistra può essere utilizzato per ulteriori studi biochimici, quali studi di interazione proteina-proteina (immunoprecipitazione, saggi GST pull-down) o esperimenti di attività GTPasi (cambiando il tampone di lisi può essere necessario a seconda del GTPase di interesse). </li></ol>

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Il metodo descritto qui costituisce un approccio semplice da applicare tensione ai recettori di adesione cellulare, e consentire loro purificazione successiva. Tuttavia, alcuni passi sono fondamentali per eseguire efficiente purificazione adesione e potenziale di ottimizzazione può essere fatto a seconda delle recettori di adesione mirati. Vi presentiamo i potenziali problemi che si possono riscontrare in basso. Abbiamo usato sfere magnetiche 2,8 micron di diametro, ma perle più grandi possono essere utilizzati come 4,5 micron di diametro. Tuttavia, il diametro tallone dovrebbe essere limitato a 2-5 micron dal fagocitosi potrebbe verificarsi più rapidamente durante 30-60 min di incubazione e perline più grandi hanno più forte adesione in modo che lo spostamento tallone sarebbe limitato sotto il campo magnetico 34, 35. Pertanto, è importante limitare il tempo di incubazione per brevi periodi e utilizzare il formato del branello corretta. Il numero di perline incubato per cella avrà un impatto sulla quantità di fesperienza Orce da una singola cellula. Mentre si vuole stimolare in modo efficace le cellule con la tensione, troppe perle per cellulare può portare alla attivazione di vie di segnalazione irrilevanti. Solitamente incubare una media di due talloni per cellula per perline FN-rivestite, ma questa quantità può essere regolata [da 1 a 5 branelli per cella] a seconda del tipo di cellula e il recettore sulla superficie cellulare. Per quanto riguarda il magnete, il metodo descritto qui utilizzato un magnete per cui la forza risultante su un 2,8 micron è stato misurato (circa 30-40 pN misurando lo spostamento delle sfere magnetiche in glicerolo puro, un liquido newtoniano con viscosità nota 31, sebbene è possibile utilizzare magneti più grandi di applicare maggiore quantità di forza, se necessario. e &#39;importante notare che questi magneti sono molto potenti e manipolare con attenzione. Dopo 12-24 ore di incubazione con ECM ligando (passo 1.7) e dopo 1 h di incubazione (passo 1.9) con PBS / 0.2% BSA pH 7,6 tampone, il mmicrosfere agnetica potrebbero formare aggregati. È quindi importante separare perline quanto possibile rispettare il rapporto di 2 perline per cella. Tuttavia, è ancora accettabile avere un rapporto 5: 1. Perline separazione può essere perseguito mediante miscelazione e pipettaggio o utilizzando sonicazione, anche se per un breve periodo (20-30 s). Varie proteine ​​possono essere coniugati ai talloni, tra integrina ligando (FN, collagene), proteine ​​ricombinanti o anticorpi rivolti recettori della superficie cellulare specifici. L&#39;attacco di perline magnetiche ligando intonacato superficie cellulare dorsale può essere indebolito dalla bassa efficienza di accoppiamento del legante sulle perline. Si consiglia di verificare per il legame ai talloni raccogliendo una aliquota della soluzione legante diluita prima di aggiungere le perline e un&#39;aliquota di perline al termine del processo di accoppiamento ligando. Queste aliquote possono essere elaborate per l&#39;analisi SDS-PAGE e Coomassie blue colorazione. Se nessun cambiamento nellavie di segnalazione o processi mechanosensing attesi sono rilevate, è importante prendere in considerazione diverse possibilità. Un modo per identificare il problema è quello di modulare la durata dell&#39;esperimento con il magnete. E &#39;noto che la velocità di processi cellulari variano a seconda del tipo cellulare utilizzato. Un&#39;altra opzione sarebbe quella di testare molecole di tensione-sensibili noti e controllare le loro modificazioni post traslazionali mediante Western blotting (per esempio paxillina fosforilazione o FAK fosforilazione possono essere analizzati). La quantità di forza può essere anche critico e utilizzando perline di un magnete più spessa (stesso grado N52) o più grandi può essere un&#39;opzione. Inoltre, ligando / recettore efficienza di legame può essere esplorato attraverso l&#39;analisi complessa adesione e cercare recettori di superficie delle cellule (come caderina o integrina). La confluenza delle cellule può anche influenzare la risposta cellulare alla tensione. Come è stato osservato che l&#39;adesione cellulare / cellulare può influenzare il comportamento cellulare e precompressione cystokeletal, è important da notare che la confluenza può influenzare la risposta cellulare alla tensione. Anche se si consiglia 80% di confluenza per l&#39;applicazione di tensione di aderenze integrine base, condizioni diverse possono essere testati per ottimizzare il sistema sperimentale. Anche se questo metodo fornisce un potente strumento per decifrare il adhesome sensibile tensione e le vie di segnalazione associati, aveva anche alcune limitazioni. In primo luogo, dal momento che la preoccupazione principale l&#39;utilizzo di tali sfere magnetiche di piccole dimensioni è il rischio della loro internalizzazione da parte delle cellule, questo metodo non può essere utilizzato per lo studio di segnalazione meccanosensibili risposte cellulari a lungo termine che modificano il destino della cellula, come la differenziazione e la proliferazione. Un&#39;altra limitazione sta nel modo di come le forze sono applicate allo strato di cellule nella piastra di coltura. Infatti, poiché il campo magnetico è sempre superiore alla periferia del magnete, forze potrebbero variare alla superficie della piastra di coltura con un gradiente decrescente di celluleche si estende dalla periferia al centro e potrebbe portare a risposte cellulari eterogenee. La procedura qui descritta costituisce un metodo efficace semplice e costo che permette studiando vie cellulari meccanosensibili nonché indagare la composizione molecolare di complessi di adesione sottoposti a tensione. Altri approcci, come dispositivo che applica ceppo ciclica alle cellule stretching, portano alla applicazione di tensione a tutti i recettori di superficie che interagiscono con la matrice extracellulare. Il metodo qui descritto ha il vantaggio di consentire la stimolazione forza di uno specifico sottoinsieme di recettori di superficie cellulare e una grande varietà di ligandi possono essere utilizzati, come ligandi delle integrine o anticorpi rivolti recettori della superficie cellulare, permettendo lo studio di molti sistemi meccanosensibili distinti. Un altro vantaggio di questo metodo è che porta alla purificazione delle proteine ​​complessi che ha sperimentato tensione e di lavorare su portanti elemeNTS che sono noti per svolgere un ruolo centrale nella meccanotrasduzione 36. Il complesso adesione purificato può anche essere usato per vari approcci biochimici 14, come saggi chinasici investigare attività chinasica in risposta alla tensione, o dosaggio polimerizzazione actina. Inoltre, questo sistema sperimentale può essere accoppiato con pinzette magnetiche per esplorare la risposta meccanica cellulare e correlare questa risposta con le vie di segnalazione individuati. È interessante notare che le nanoparticelle magnetoplasmonic sono state utilizzate di recente per meccanicamente carico Notch ed E-caderina con un controllo preciso nel tempo e nello spazio 37. Questo recente sviluppo può aiutare a esplorare vie di segnalazione meccanosensibili con ingressi spaziali, temporali e meccaniche differenti.

In metazoi, tensione meccanica dirige lo sviluppo dei tessuti e l&#39;omeostasi attraverso la regolazione di una miriade di processi cellulari quali la proliferazione, il differenziamento e la sopravvivenza 1, 2. tensione meccanica può derivare dalla matrice extracellulare o può essere generato da cellule aderenti, quale campione loro ambiente extracellulare attraverso l&#39;apparato contrattile actomyosin che tira sulla matrice extracellulare e sonde sua rigidità attraverso molecole sensibili alla tensione. In risposta alla tensione, proteine ​​di adesione meccanosensibili subiscono cambiamenti conformazionali che si innescano cascate di segnalazione complessi. A loro volta, queste vie di segnalazione orchestrano un mechanoresponse comprende proliferazione, differenziazione e sopravvivenza che regola il comportamento cellulare per l&#39;ambiente extracellulare. Tali processi possono essere risolte in un periodo di tempo breve termine (secondi o minuti) per alimentare rapidamente indietro sul ciclo di mecha<html> notransduction modificando le strutture meccanosensibili. Per esempio, aderenze integrine basato rafforzano in risposta alla tensione attraverso Rho GTPasi mediata citoscheletro rimodellamento 3, 4, 5. In parallelo, altre vie di segnalazione sono attivati nel giro di ore e giorni per controllare programmi genetici che alla fine influenzano il destino della cellula 6. Considerando che, molti studi hanno messo in evidenza l&#39;effetto della matrice di rigidezza sul determinismo cellulare e lo sviluppo della malattia 1 2, i precisi meccanismi molecolari della meccanotrasduzione adesione mediata rimangono ancora sfuggente. Diversi approcci sono stati sviluppati per studiare gli effetti delle forze di cellule generate o forze esterne sul comportamento delle cellule, compresi i sistemi di flusso, di trasferimento di fluorescenza di energia di risonanza (FRET) sensori -tensione 7,lass = &quot;xref&quot;&gt; 8, substrati compliant 9, pinzette magnetico, pinzette ottiche 10 e a forza atomica microscopia (AFM) 11. Qui vi presentiamo un protocollo utilizzando perline superparamagnetici per caratterizzare le vie meccanotrasduzione in risposta alle forze tensionali applicati ai recettori di adesione specifici. perline superparamagnetiche sono particelle che magnetizzare reversibilmente quando posto in un campo magnetico. Dopo rivestita con un ligando per un recettore specifico, queste perle forniscono un potente strumento per studiare gli effetti di applicazione della forza extracellulare. Questo metodo è stato convalidato da diversi studi 3, 5, 12 - 17 e presenta il vantaggio di facilitare ampiamente analisi biochimiche su cellule aderenti. Utilizzando sfere magnetiche rivestite di collagene simili seguiti da analisi biochimica, primi lavori ha registrato un aumentoproteina tirosina fosforilazione e dell&#39;attivazione RhoA in risposta alla tensione 5, 18, 19. Il metodo descritto qui di seguito è stato utilizzato anche con fibronectina (FN) perline Rivestiti di caratterizzare le vie di segnalazione a valle dalla tensione applicata al integrine 3. In questo studio, Guilluy et al. ha dimostrato che la tensione attiva RhoA attraverso il reclutamento dei due fattori di scambio guanina nucleotide (GEFs), larg e GEF-H1, a complessi di adesione integrine. Dato che, altri studi hanno dimostrato che GEF-H1 è reclutato a complessi di adesione in risposta alla tensione cellule generate utilizzando metodi differenti 20, 21, dimostrando la robustezza della metodologia descritta QUI. Come risultato, attivato RhoA stato mostrato per promuovere l&#39;adesione rinforzo, attraverso il rimodellamento del citoscheletro. Questo sistema è stato utilizzato anche per esplorare tensione applicata to recettori di adesione cellulare / cellula. Applicazione di forze su biglie magnetiche rivestite con il dominio extracellulare di E-caderina induceva un aumento delle assunzioni vinculin analogamente a integrine associato complessi di adesione 12. Collins e colleghi hanno osservato che l&#39;applicazione della tensione di PECAM-1 promuove integrina e l&#39;attivazione RhoA 13. Un altro approccio sperimentale utilizzando biglie magnetiche è lo studio della tensione applicata nuclei isolati. Utilizzando perle rivestite con anticorpi contro le proteine dell&#39;involucro nucleare nesprin-1, complessi dell&#39;involucro nucleare sono stati purificati per dimostrare che essi sono regolati in modo dinamico in risposta alle tensioni meccaniche 22. Questi risultati supportano la potenza del metodo nello studio dei percorsi meccanotrasduzione. Inoltre, mentre i sistemi di flusso o forza di trazione stimolare processi cellulari generale, sfere magnetiche si rivolgono specificamente un recettore di adesione cellulare utilizzando uno ligandi del recettore 13, 15. Un altro vantaggio di questo metodo è l&#39;isolamento di complessi di adesione mediante una procedura di purificazione di affinità ligando semplice. È ben noto che l&#39;aggiunta di perline ligando intonacato cellule lega recettori di adesione e induce il reclutamento di diverse proteine di adesione 23. Ulteriore applicazione di forze di sfere magnetiche rivestite ligando trasforma questi complessi di adesione in piattaforme macromolecolari che media diverse vie di segnalazione di tensione dipendente dal 4, 24. lisi cellulare seguita da concentrazione tallone utilizzando un magnete consente l&#39;isolamento delle piattaforme di adesione. Altri metodi utilizzati per purificare complessi di adesione sono già stati utilizzati in cellule aderenti. Essi combinano reticolazione chimica per conservare interazioni proteina-proteinaed una fase di lisi cellulare mediante detergente e flusso di taglio o sonicazione 20, 21, 25, 26, 27, 28. Il passo finale è la raccolta delle membrane plasmatiche ventrali risultanti contenenti i complessi di adesione. A differenza di questi metodi, perline magnetiche consentono un maggiore livello di purificazione di complessi di adesione cellulare orientando selettivamente una specifica famiglia di recettori di adesione. Perline magnetiche sono già stati utilizzati per depurare complessi di adesione in cellule non aderenti collegati a microsfere ligando rivestite 29, 30. Il metodo descritto qui di seguito imita situazioni biologiche in cui si applica una forza per un breve periodo prolungato (secondi ad alcuni minuti). Esso fornisce pertanto un potente strumento per studiare sia la composizione molecolare di complessi di adesione purificati ele vie a valle meccanosensibili di segnalazione. Qui vi presentiamo un protocollo sperimentale dettagliata per l&#39;utilizzo di sfere magnetiche per applicare forze tensionali di proteine ​​di superficie l&#39;adesione. Un magnete al neodimio permanente è posto sulla parte superiore della superficie coltura piatto. La faccia polare del magnete è posto ad un&#39;altezza di 6 mm in modo che la forza una singola 2,8 micron branello magnetico è costante (circa 30-40 pN) 31. La durata della stimolazione tensione viene determinato dall&#39;operatore a seconda della molecola di interesse e la sua scala di attivazione. Le cellule sono poi lisate, complessi di adesione sono purificati dalla separazione perline usando un magnete e analisi biochimiche vengono elaborate. Questo protocollo comprende la preparazione di perle superparamagnetici ligando-rivestito, e applicazione di tensione attraverso magnete seguita da analisi biochimiche. Inoltre, forniamo un campione rappresentativo di dati che dimostrino che la tensione applicata al adh integrina-basedesions induce adesione rimodellamento e altera la proteina fosforilazione della tirosina.

<table><tbody><tr><td>Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>grade N52 dimension: 1 1/2&quot; dia. x 1/2&quot; thick</td></tr><tr><td>Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>grade N42 dimension: 1/2&quot; dia. x 1/4&quot; thick Black Plastic Coated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>superparamagnetic beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronectin from bovine plasma</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Bovine Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60*15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

Meccanosensibili complessi di adesione cellulare, consentono alle cellule di percepire le proprietà meccaniche del loro ambiente. Recenti studi hanno identificato due molecole di forza-sensing in siti di adesione, e fattori di trascrizione della forza-dipendente che regolano l&#39;espressione genica specifica per lignaggio e guidano uscite fenotipici. Tuttavia, le reti di segnalazione di conversione della tensione meccanica in percorsi biochimici sono rimasti sfuggente. Per esplorare le vie di segnalazione impegnate su tensione meccanica applicata al recettore sulla superficie cellulare, microsfere superparamagnetiche possono essere utilizzati. Qui vi presentiamo un protocollo per l&#39;utilizzo di sfere magnetiche per applicare forze di proteine ​​di adesione della superficie cellulare. Usando questo approccio, è possibile indagare non solo forza-dipendente percorsi citoplasmatica segnalazione di vari approcci biochimici, ma anche l&#39;adesione rimodellamento isolamento magnetico di complessi di adesione attaccate alle perline rivestite ligando. Questo protocollo include la preparazione di ligando-coATED perline superparamagnetiche, e l&#39;applicazione di definiscono forze di trazione seguita da analisi biochimiche. Inoltre, forniamo un campione rappresentativo di dati che dimostrino che la tensione applicata ad adesione integrina-based innesca adesione rimodellamento e altera la proteina fosforilazione della tirosina.

Lo schema della tecnica è illustrata in Figura 1a. Dopo coniugazione ligando, sfere magnetiche vengono incubate con le cellule per 20 minuti, e quindi un magnete permanente è utilizzato per applicare forze di trazione di circa 30-40 pN per vario tempo. La figura 1b mostra 2,8 micron sfere magnetiche FN-rivestiti legati ai recettori di adesione cellulare MRC5. Le fasi di lavaggio di perline superparamagnetiche dopo la lisi cellulare sono cruciali e determinano il grado di purificazione. Si raccomanda un minimo di tre lavaggi. Immunoblot GADPH con lunghe esposizioni può essere utile per verificare la purezza di complessi di adesione (Figura 2a). perline FN-rivestiti sono stati usati per studiare i processi meccanotrasduzione che avvengono nel tempo a complessi di adesione in risposta alla tensione. Dopo separazione magnetica della frazione complesso aderenza, il lisato e la frazione complesso adesione sono stati analizzati medianteWestern Blot. Come previsto, abbiamo osservato talin, vinculin e paxillin, ma non GAPDH nella frazione complessi adesione anche in assenza di stimolazione meccanica (Figura 2b). In linea con le precedenti relazioni 32, 33, la tensione innescata vinculin assunzioni a complessi di adesione. Mentre la tensione non ha influenzato il reclutamento paxillina a complessi di adesione, sua fosforilazione in tirosina 31 è stato migliorato in risposta alla tensione meccanica sia nel lisato cellulare totale e nella frazione complesso adesione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig1.jpg" /> Figura 1. Descrizione del metodo. (A) Rappresentazione schematica della tecnica. Le cellule vengono dapprima coltivate in terreno di coltura fino a raggiungere la confluenza desiderata. Poi, perline superparamagnetiche sono aggiunti per 15-20 minuti. forze tensionali circa 30-40 pN sonopoi applicato usando il magnete calibrata per diverso tempo. (B) fibronectina rivestite perline superparamagnetici si legano ai recettori di adesione cellulare. Le cellule vengono esposte per contrasto di fase in luce trasmessa al microscopio 15 minuti dopo aver aggiunto le perline superparamagnetiche (freccia bianca) in mezzo. (Top immagine: Barra di scala = 25 micron, immagine in basso: Scala bar = 100 micron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55330/55330fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig2.jpg" /> Figura 2. tensione meccanica induce l&#39;adesione di maturazione. (A) Purificazione di complessi di adesione. GAPDH immunoblotting è impiegato come controllo di caricamento per lisato cellulare totale e per verificare la purezza di complessi di adesione. La membrana di nitrocellulosa è stato ripreso con una lunga esposizione per dimostrare °e assenza di segnale in adesione frazione complessa. (B) La tensione induce l&#39;adesione di maturazione. Controllo delle sollecitazioni (GAPDH) e candidati (vinculina, Talin e paxillin) noti per essere reclutati o fosforilata in complessi di adesione in risposta alla tensione meccanica sono immunoblotted. Questo esperimento è stato effettuato su MRC5 cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55330/55330fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

analyzing-cell-surface-adhesion-remodeling-response-to-mechanical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR.  aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione. 

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Ricerca

Bioingegneria

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Pinzette magnetiche in formato micropiastra

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Pinzette magnetiche in formato micropiastra

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Biochimica

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Studio di meccanotrasduzione in vivo utilizzando biglie magnetiche nel cuore del pesce zebra

Manipulating Mechanical Forces in the Developing Zebrafish Heart Using Magnetic Beads

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction and physical stimuli generated by the beating heart. Intracardiac hemodynamics, driven by blood flow, emerge as fundamental information shaping the development of the embryonic heart. Here, we describe an effective method to manipulate mechanical forces in vivo by grafting a 30 &#181;m to 60 &#181;m diameter magnetic bead in the cardiac lumen. The insertion of the bead is conducted through microsurgery in anesthetized larvae without perturbing heart function and enables artificial alteration of the boundary conditions, thereby modifying flow forces in the system. As a result, the presence of the bead amplifies the mechanical forces experienced by endocardial cells and can directly trigger mechanical stimulus-dependent calcium influx. This approach facilitates the investigation of mechanotransduction pathways that govern heart development and can provide insights into the role of mechanical forces in cardiac valve morphogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Comprendere le forze meccaniche coinvolte nella formazione del cuore del pesce zebra

This protocol outlines a method for grafting a magnetic bead into the developing zebrafish heart through microsurgery, enabling the manipulation of mechanical forces in vivo and triggering mechanical stimulus-dependent calcium influx in endocardial cells.

Manipolazione delle forze meccaniche nel cuore del pesce zebra in via di sviluppo utilizzando perle magnetiche

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