La misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione della profondità nei soggetti umani è molto importante per le malattie legate alla pelle, per la caratterizzazione delle prestazioni del prodotto per la cura della pelle. Questo metodo, insieme alla successiva analisi, sfrutta la chemiometria per estrarre informazioni chimiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di raccogliere il set di dati Raman clinico da operatori di strumenti addestrati che non dispongono di competenze tecniche per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici.
Il set di dati risultante può quindi essere elaborato per identificare gli outlier che devono essere esclusi dalla data precedente all'analisi. Durante l'analisi dei dati, una sfida chiave è la rimozione degli outlier e l'identificazione del numero dei componenti chiave nel set di dati. L'approccio mostra in questo video sfrutta la conoscenza precedente del set di dati clinici e l'approccio chemiometrico per estrarre con successo l'acqua, le proteine e i lipidi con risoluzione della profondità.
A dimostrare la procedura sarà Li Yang, tecnico del nostro laboratorio di C&T. Per iniziare, fare in modo che il soggetto posizionare un sito del corpo della lesione marcato o un sito di controllo a stretto contatto con la finestra di imaging dello strumento Raman confocale in vivo. Assicurati che coprano l'intera finestra per evitare l'impatto della luce della stanza sull'imaging.
Quindi, apri il software e sposta la messa a fuoco fino a quando non viene visto uno spettro simile a quello mostrato qui. Successivamente, spostare la messa a fuoco a 10 micron dalla superficie della pelle. Raccogli i dati per 26 passaggi con una dimensione del passo di due micron nella regione di frequenza mostrata qui, utilizzando un tempo di esposizione di un secondo.
Misurare otto repliche per ogni area, della durata totale fino a 15 minuti. In primo luogo, utilizzare la finestra di comando e MATLAB per modificare l'estensione del file dei dati raccolti da ric a mat. Quindi caricare il file mat sulla piattaforma software MATLAB, come mostrato qui.
Correggere la linea di base del set di dati utilizzando il metodo automatico dei quadrati meno ponderati, andando alla finestra PLS_Workspace e facendo clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati importato, scorrendo fino ad Analizzare, selezionando Altri strumenti e facendo clic su Pre-elaborazione. Nella finestra visualizzata fare clic su Mostra. Scorrere quindi verso il basso la barra degli strumenti Metodi disponibili fino al filtro Linea di base quadrati affittati ponderati automatici e selezionare Aggiungi.
Quindi, fare clic su OK per impostare le opzioni e applicare la pre-elaborazione ai dati. Salvare questo come Spectra_baseline. Tornare quindi alla finestra di comando e sostituire i dati utilizzando il risultato corretto per la linea di base.
Ora, vai all'editor di testo ed esegui il programma come mostrato qui. Questo riassumerà i valori tra 2910 e 2965 centimetri inversi per ottenere i valori di intensità sotto ogni spettro Raman dalla misurazione di 26 passaggi consecutivi e memorizzarli in un file Excel. In MATLAB, andate al workspace e impostate il percorso dei dati in Depth_save, come mostrato.
Quindi, utilizzate il processo qui descritto per interpolare il valore di offset dello strumento da 26 a 260 utilizzando la funzione linspace in MATLAB. Questo processo interpolerà il valore di intensità da 26 a 260 utilizzando il metodo spline, sfruttando i valori di posizione 260 appena generati. Inoltre, utilizzerà i valori di posizione e intensità 260 rispettivamente come input x e y per la funzione polyfit, impostando il valore di grado su 20.
Quindi, utilizzerà i coefficienti di uscita e i 260 valori di posizione estesa come input per il polivale, per ottenere i valori finali di intensità 260. Successivamente, calcolerà l'intensità media e troverà il punto nella curva più vicino all'intensità media. Cambierà anche il valore di profondità in base alla superficie della pelle, nella dimensione nota del passo di due micron.
Ora, esegui il programma. Caricare il set di dati degli spettri Raman dopo la rimozione degli spettri esterni della pelle nel software PLS_Toolbox, sotto la piattaforma MATLAB e fare clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati per scegliere Analizza e quindi PCA. Quindi, fare clic su Scegli pre-elaborazione.
Selezionate Normalizza (Normalize) come approccio di pre-elaborazione. Quindi, non scegliere nessuno per la convalida incrociata. Quindi, compilare il modello utilizzando i tre componenti per l'analisi di decomposizione PCA.
Ora, rimuovere il coperchio nella finestra di raccolta degli strumenti Ramen in vivo e raccogliere gli spettri di luce della stanza nella regione ad alta frequenza utilizzando gli stessi parametri utilizzati per la raccolta dei dati del materiale di riferimento. Identificare il fattore di effetto luce della stanza attraverso il confronto con lo sfondo della luce della stanza. Ora, rivedi i punteggi e rimuovi gli spettri con il valore di punteggio corrispondente significativamente più alto del normale.
Ciò significa rimuovere i valori di punteggio di oltre il 99,8% dell'intero set di dati, che è 0,16 in questo studio. Salvare i dati x-block di calibrazione risultanti. Infine, vai al browser PLS_Workspace e modifica il nuovo file.
Selezionare le etichette di riga e passare a Eliminazione disco rigido esclusa per eliminare definitivamente i dati esclusi prima di salvare di nuovo il file. Inizia correggendo la linea di base degli spettri Raman usando lo stesso appena mostrato. Eseguire quindi l'analisi PCA sul set di dati pre-elaborazione.
Tracciate gli autovalori in scala logaritmica insieme al numero di componenti facendo clic sul pulsante Scegli componente (Choose Component) e selezionate log(eigenvalues) come valore y. Per eseguire analisi della risoluzione delle curve multivariate, utilizzare innanzitutto il pulsante di selezione dei dati per caricare il set di dati nel software MCR_main dati. Scegliete manualmente il numero di componenti e impostate il numero del componente tra tre e otto.
Quindi, nella scheda Stima iniziale, fare clic sul pulsante Pure. Selezionare Quindi Concentrazione e fare clic sul pulsante Fai. Una volta aggiornata la schermata, fare clic sul pulsante OK e quindi su Continua per passare alla pagina successiva.
Fare clic su Continua e in Implementazione applicare fnnls. Selezionare quindi sei dal menu a discesa per il numero di specie con profili di non negatività e fare clic su Continua. Nella pagina successiva scegliere gli stessi parametri e fare clic su Continua.
Per determinare la posizione sulla superficie della pelle, l'area sotto il picco Raman della proteina è stata integrata per ottenere il profilo di profondità del segnale proteico. La superficie della pelle è stata definita come la posizione in cui il valore di intensità dal profilo di profondità interpolato era più vicino all'intensità media. La posizione esatta della superficie della pelle non deve coincidere con un punto dati sperimentale.
Un totale di 30.862 spettri Raman sono stati raccolti con il protocollo di raccolta dati descritto in questo video. Questo set di dati spettrali di grandi dimensioni contiene valori anomali spettrali del 20%. Una corretta identificazione e rimozione degli spettri anomali è importante per ottenere un set di dati adeguato.
Qui, si può vedere il contributo dalle luci della stanza, sovrapposto a uno spettro di riferimento di Roomlight. L'analisi dei componenti principali è stata eseguita sul set di dati Raman confocale pre-elaborazione e l'autovalore, insieme al numero di fattori utilizzati, viene tracciato qui. Una significativa diminuzione dell'autovalore è stata osservata per il fattore nove.
Questa osservazione suggerisce di studiare modelli con il numero di componenti principali che variano da tre a otto fattori per l'inclusione nel modello di risoluzione della curva multivariata. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale avviare un profilo di profondità sopra la superficie della pelle, per determinare con precisione la posizione della superficie della pelle. Questa metodologia consente di esaminare l'impatto dei prodotti per la cura della pelle sui componenti chiave della pelle, tra cui acqua, proteine e lipidi.
