Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Siamo grati alla struttura del tessuto embedding e la struttura di base del microscopio di CMMC. Siamo grati per le discussioni e il supporto tecnico forniti dai membri del Laboratorio per Centrosome e citoscheletro Biology. Ringraziamo Li Ming Gooi per la correzione delle bozze del manoscritto.

1. Generazione di Brain organoidi (23 giorni) <ol><li> Avvio di neuroectoderma (5 giorni) Nota: I seguenti punti dovrebbero essere considerati prima dell&#39;inizio della differenziazione. Il metodo riprogrammazione (ecc lentiviral-, basata microRNA Sendai-virus-, episomal-, o) per ottenere iPSCs umani dovrebbe essere idealmente la stessa per tutti i pazienti e controllare linee IPSC. Vari kit e le istruzioni sulla base di protocolli pubblicati riprogrammazione sono disponibili 15, 16, 17, 18. La qualità delle linee IPSC umani è la chiave per realizzare una differenziazione ottimale. Monitorare colonia e la morfologia delle cellule con un microscopio e convalidare pluripotency testando l&#39;espressione di marcatori come Oct3 / 4, Nanog, o TRA-1-60. <ol><li> iPSCs cultura umani in condizioni di assenza di alimentazione di mezzo A su un piatto rivestito con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrice. NOTA: Grow iPSCs umane e di mantenere una condizione di cultura definita e per evitare un ulteriore passo per la rimozione di cellule feeder embrionali di topo (MEF) prima dell&#39;inizio della differenziazione senza siero privo di alimentatore. Il numero di passaggio ottimale per iPSCs umani per iniziare intervalli differenziazione dal passaggio 15 sulla riprogrammazione del passaggio 70 in totale. Quando passaging, staccare colonie hiPSC come cellule aggregato utilizzando una soluzione distacco cellulare appropriata con ridotte sollecitazioni meccaniche e una pipetta sierologica 2 mL per trasferire aggregati ad un nuovo piatto. Evitare di dissociazione di singole cellule, in quanto questo potrebbe indurre la differenziazione ed apoptosi nelle maggior parte delle linee IPSC. E &#39;stato riferito che a lungo termine, passaging unicellulare potrebbe aumentare alterazioni genomiche in iPSCs umano 19, 20. Evitare procedure distacco delle cellule, che richiedono una fase di centrifugazione per rimuovere la soluzione distacco, in quanto ciò riduce la vitalità complessiva di iPSCs. Testtutte le culture di contaminazioni microbiche, in particolare micoplasma, su base regolare, poiché questo potrebbe alterare la qualità delle iPSCs e la loro capacità di differenziazione. <ol><li> Cappotto 60 millimetri di tessuto coltura piatto con matrice EHS secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Scongelare un&#39;aliquota di 1 x 10 6 iPSCs umani. Seme i iPSCs in un 60-mm piatto di coltura di tessuto rivestito in matrice EHS e contenente 5 ml di terreno A (vedere la Tabella Materials). Cambiare la media giornaliera e il passaggio dopo 5 a 7 giorni in cui le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza. NOTA: Passaggio le iPSCs scongelati a 80% di confluenza con metodi standard, come il distacco privo di enzimi di colonie 21, almeno una volta prima di iniziare la differenziazione. In breve, rimuovere il terreno COPSI, lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 37 mezzo di Eagle modificato di Dulbecco ° C: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), e incubare i iPSCs seguendo il produttoreistruzioni utilizzando il reagente A (vedere la tabella materiali). Non superare il tempo di incubazione consigliato al fine di evitare la dissociazione di singole cellule. iPSCs umani dovrebbero essere staccati e galleggianti come aggregati, cellule non come singoli. Possono poi essere trasferite in EHS piatti matrici rivestite; per esempio, COPSI aggregati da un piatto di 60 mm può essere distribuito a 4 nuovi piatti 60 mm. </li><li> Verificare la presenza di micoplasma con un kit di rilevamento micoplasma secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare iPSCs solo libero-Mycoplasma, come micoplasma può alterare la capacità di differenziazione dei iPSCs. </li></ol></li><li> Dissociare iPSCs (80% confluenti) e preparare una sospensione singola cella utilizzando reagente B. <ol><li> Lavare le iPSCs una volta con pre-riscaldato (37 ° C) DMEM / F12. </li><li> Aggiungere preriscaldata reagente B (ad esempio, 1 ml in piastre da 60 mm) e incubare le iPSCs per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Flick 20 volte con un dito sulla parte inferiore eil piatto permette il distacco dei iPSCs. Controllare per il distacco delle cellule sotto il microscopio. </li><li> Pipetta la sospensione cellulare su e giù nel piatto 5 volte con una micropipetta 1 mL. </li><li> Aggiungere 3 ml di terreno A diluire 1 ml di reagente B e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> girare con cautela l&#39;iPSCs (500 xg) per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di terreno B e contare il numero di cellule con un emocitometro. NOTA: Essere consapevoli di utilizzare unico mezzo per B risospensione. Evitare l&#39;uso medio A, in quanto contiene una troppo elevata concentrazione di bFGF, che potrebbe inibire la differenziazione. </li></ol></li><li> Diluire la sospensione cellulare di 4,5 x 10 5 cellule per ml in terreno B supplementato con 10 pM rho associata inibitore della proteina chinasi (Y-27632). </li><li> Aggiungere 100 microlitri per pozzetto in un non-aderenti, v-bottom, piastra da 96 pozzetti. NOTA: Assicurarsi che le celle sono equamente distribuiti nel suspensione agitando la provetta ogni volta prima di estrarre porzioni 100 microlitri. È importante che ogni pozzetto deve contenere un numero di cellule equivalente per ottenere neurosfere omogenee in dimensione e forma (tonda, superfici definite). </li><li> Girare delicatamente la piastra con le cellule a 500 xg e temperatura ambiente per 3 min e incubare a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Cambiare la media giornaliera, eliminando 50 microlitri e l&#39;aggiunta di 50 ml di mezzo fresco B in tutti i pozzetti per i prossimi 5 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Incorporare Neurosfere a EHS Matrix (4 giorni) <ol><li> Preparare mezzo neurosfere miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 senza (w / o) La vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM aminoacidi non essenziali (MEM), 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo. </li><li> Raccogliere il neurosfere ingegnoah 200 microlitri micropipetta con una punta ~ 2 millimetri precedentemente tagliato con forbici sterili. </li><li> Posizionare i neurosfere circa 5 mm distanti sulla pellicola paraffina (3 x 3 cm 2) in un piatto vuoto 100 mm e rimuovere con attenzione tanto del mezzo rimanente come possibile. </li><li> Aggiungere una goccia (7 mL) di matrice EHS su ogni singola neurosfere. </li><li> Incubare la matrice EHS gocce con le neurosfere per 15 minuti in un incubatore. </li><li> Lavare le neurosfere con attenzione dal film di paraffina da vampate di calore con il mezzo neurosfere. Per lavare, utilizzare una micropipetta 1 ml e un nuovo 100 millimetri Petri contenenti 10 ml di terreno neurosfere. </li><li> Incubare le neurosfere per i prossimi 4 giorni e aggiungere 2 ml di terreno neurosfere fresco il giorno 2. NOTA: Assicurarsi che gli scaffali in incubatrice sono piatte in modo che i EHS neurosfere matrice-incorporato non ammassarsi su un lato del piatto. </li></ol> 3. organoidi in una sospensione RotaryCultura (14 giorni) <ol><li> Preparare cervello medio organoide miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 w / o vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM MEM, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 pM SB431542, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo. </li><li> Aggiungere 100 ml di cervello organoide mezzo a ciascuna beuta trottola attraverso i suoi bracci laterali e metterli in un incubatore per pre-riscaldamento per almeno 20 min. </li><li> Impostare un programma di agitazione a 25 giri al minuto, secondo le istruzioni del produttore. NOTA: Prima di trasferire le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore, accertarsi che siano tutti separati. Se due o più sono collegati attraverso matrice EHS, separarli tagliando la matrice di collegamento con un bisturi. </li><li> Trasferire accuratamente le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore contenenti 100 ml di terreno organoide noiing una pipetta sierologica 2 ml. Utilizzare i bracci laterali del pallone filatore per trasferire i neurosfere nel pallone. </li><li> Posizionare i contenitori filatore su una piattaforma di agitazione magnetica in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2; questo è il giorno 0 della cultura organoide. </li><li> Modificare la media una volta alla settimana (o più spesso quando c&#39;è un cambiamento di colore), eliminando la metà del mezzo e aggiungendo la stessa quantità di terreno fresco. NOTA: Quando si riprendono i palloni filatore fuori dell&#39;incubatore, attendere 3-5 minuti per consentire le organoidi affondare fino al fondo del pallone. Rimuovere il supporto posizionando la punta di vetro pipetta (collegato ad una pompa) sulla superficie del liquido; aspirare il mezzo attenzione attraverso un&#39;apertura laterale / braccio del pallone. Queste manipolazioni devono essere eseguite sotto il cofano laminare. </li></ol> 4. Analisi di cervello organoidi <ol><li> Fissazione di organoidi <ol><li> Raccogliere le organoidi il giorno 14 del pallone filatore cultura with un taglio 1 micropipetta mL (taglio ~ 5 mm). Mettere tutti in piastre da 60 mm e lavare una volta con 5 ml di caldo DMEM / F12 per 3 min. </li><li> Preparare una provetta da 1,5 ml con 500 ml di caldo 4% paraformaldeide (PFA). Attenzione: Indossare pelle e protezione per gli occhi e il lavoro sotto una cappa di sicurezza durante la manipolazione PFA fissativo. </li><li> Collocare ogni organoide separatamente in ciascun tubo e correggerli per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Non fissare le organoidi per più di 60 min. Per spostare i organoidi, utilizzare un ciclo inoculazione o qualsiasi altro escogitare che è conveniente. </li><li> Rimuovere il PFA e lavare i organoidi fissati due volte per 10 minuti ciascuno con 1 ml di PBS. </li><li> Memorizzare i organoidi in 1 ml di PBS a 4 ° C fino a 7 giorni, fino ad ulteriore utilizzo. </li></ol></li><li> Incorporare le organoidi per criosezionamento <ol><li> Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di 30% di saccarosio in soluzione acqua distillata per provetta a disidratare le organoidi prima di loro cryofreezing; dopo l&#39;aggiunta di Sucrosoluzione se le organoidi dovrebbe essere galleggiante in superficie. Conservare le organoidi durante la notte in soluzione di saccarosio a 4 ° C; il giorno dopo, i organoidi dovrebbero hanno affondato fino al fondo della provetta. NOTA: organoidi possono essere conservati per un massimo di 3-5 giorni a 4 ° C in soluzione di saccarosio, se necessario. </li><li> Riempire uno stampo vinile campione con 400 ml di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e utilizzare un ciclo inoculazione di effettuare un organoide al centro dello stampo. Etichettare il bordo dello stampo con il nome del campione. </li><li> Congelare lo stampo organoide contenente a -80 ° C fino criosezionamento. </li><li> cryoslides vetro cappotto con 0,1% di soluzione di lisina poli-l-(PLL) in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente e lasciate asciugare i vetrini per 3 h. Conservare i campioni a 4 ° C e caldo fino a camera temperato prima dell&#39;uso. NOTA: PLL-rivestimento è un passo importante, poiché impedisce le fette organoide dal galleggiante via. Raccogliere e conservare soluzione PLL a 4 ° C fino a 3mesi. Prima di riutilizzo, filtrare con una siringa 0,22-micron e farlo riscaldare a temperatura ambiente. </li><li> Organoidi sezione cryofrozen in 20-50 fette um di spessore su vetro PLL rivestite cryoslides 22. Lasciate che i vetrini con sezioni asciugare per 1 ora a temperatura ambiente. Conservare le sezioni a -80 ° C fino ad ulteriore trasformazione. </li></ol></li></ol> 5. immunofluorescenza colorazione di sezioni organoide NOTA: Per la caratterizzazione generale della organoidi, colorazione con nestina, un marker progenitore neuronale, e TUJ1, un marker pan-neuronale, è raccomandato. Come esempi aggiuntivi, immunofluorescenza con fosfo-Vimentin (p-Vim), le etichette mitotiche apicali cellule gliali radiali, e Arl13b, per ciglia, sono descritti. Per testare l&#39;apoptosi, utilizzare il test Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL). Porre i vetrini in una scatola di plastica durante le incubazioni per proteggerli da polvere, luce,e l&#39;essiccazione. <ol><li> Scongelare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con 200 microlitri di PBS-glicina (0,225 g di glicina in PBS) per 3 min per estinguere l&#39;autofluorescenza PFA-indotta. </li><li> Permeabilize sezioni con 200 microlitri di 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> lavarli due volte con 200 microlitri di soluzione di PBS-glicina per 3 min. </li><li> incubare con 200 ml di 0,5% gelatina di pesce / 0,1% Triton X100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C per bloccare l&#39;antigene legame aspecifico. NOTA: Se è richiesto un saggio di TUNEL, eseguire il test come da protocollo del produttore. Iniziare con il saggio TUNEL prima di eseguire l&#39;immunocolorazione, come potrebbe interferire con anticorpi secondari e spegnere fluorofori quando utilizzati in seguito. </li><li> Diluire gli anticorpi nel bloccare soluzione alle seguenti concentrazioni: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpi secondari, 1: 1000. </li><li> Incubare con 200 microlitri del primo anticorpo primario (per esempio, nestina) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Diluire il primo (anti-topo 488) anticorpo secondario 1: 1.000 in soluzione bloccante e incubare il vetrino in 200 microlitri per 1-2 ore a temperatura ambiente. D&#39;ora in poi, proteggere sempre le diapositive dalla luce. </li><li> Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Incubare con 200 microlitri della successiva anticorpo primario (per esempio, TUJ1) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Aggiungere 200 microlitri della prossima anticorpo secondario (anti-coniglio 647) per 1-2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 x 3 min. con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Aggiungere 200 ml di 4&#39; , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ad una nM conc 30entration in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente per colorazione nucleare. </li><li> Lavare 2 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Lavare 1 x 1 min con 200 ml di acqua distillata e lasciare che le sezioni asciugare per 10-20 minuti, fino a quando non goccia d&#39;acqua ovvia è più visibile. </li><li> Montare le sezioni con mezzo di inclusione. Conservarli al riparo dalla luce a 4 ° C per un massimo di diverse settimane. </li><li> Procedere con l&#39;analisi microscopica all&#39;immagine una panoramica, zona organoide ventricolare, corticale primitivo, e altre aree di interesse. </li><li> Utilizzare un microscopio confocale con un olio 63X filtri obiettive e fluorescenti, scelti in base alle anticorpi secondari colorante fluorescente-tag utilizzati 1, 10. </li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Wilson, P. G., Stice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+neural+rosettes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).</li><li>Dhara, S. K., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+synthetic+retinoid+derivatives+as+inducers+of+stem+cell+differentiation.">Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation.</a> Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity.">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell stem cell. , (2017).</li><li>Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+Characterization+of+a+MYF5+Reporter+Human+iPS+Cell+Line+Using+CRISPR/Cas9+Mediated+Homologous+Recombination.">Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination.</a> Sci. Rep. 6, 18759 (2016).</li><li>Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genomic+correction+methods+in+human+iPS+cells+using+CRISPR-Cas9+system.">Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 101, 27-35 (2016).</li><li>Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isogenic+Human+iPS+Cell+Line+Precisely+Corrected+by+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas9+System.">Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.</a> Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li><li>D'Avanzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+in+3D+culture:+challenges+and+perspectives.">Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives.</a> Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPH è un disordine dello sviluppo neurologico umana complessa che non può essere ricapitolato in modelli animali in vivo o in cultura semplici cellule umane in vitro si avvicina. La manifestazione clinica della MCPH comincia ad apparire durante il primo trimestre, quando comincia presto neurogenesi. Così, organoidi cerebrali in 3D rappresentano un sistema sperimentale affidabile per modellare lo sviluppo MCPH. Inoltre, 3D organoidi cervello umano sono un approccio ideale in quanto i) che consentono...

disturbi dello sviluppo neurologico umana, come la microcefalia, possono essere studiate solo male in modelli animali a causa del fatto che il cervello umano ha una superficie corticale estesa, una caratteristica unica diversa da animali non umani. Questo aspetto rende lo sviluppo del cervello umano un processo complesso che non può essere studiato sufficientemente in 2D, nel sistema di coltura cellulare in vitro. Emergenti tecniche di coltura 3D consentono la generazione di organoidi tessuto simile da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). La differenziazione in vitro di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione 3D permette la formazione di vari tipi di cellule in un modo tempestivo e regione specifica, dando origine ad un organizzato, tessuto stratificato 1, 2, 3. Grazie a laboratori che pionieri tecnologie di coltura 3D e demistificato la complessità della formazione degli organi, partendo da cellule staminali,abbiamo sviluppato un metodo robusto di generare organoidi cerebrali delineare eventi precoci di sviluppo del cervello umano e modellare microcefalia in vitro 1, 2, 3. È da notare che abbiamo adattato il metodo originale sviluppato da Lancaster et al. generare organoidi cerebrali 1. Questo metodo è stato modificato in base alle nostre esigenze sperimentali. L&#39;obiettivo di uno studio da Gabriel et al. sia per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari della neurale mantenimento delle cellule staminali durante lo sviluppo cerebrale. Per fare questo, uno studio meccanicistico è stato effettuato analizzando le cellule progenitrici neurali (NPC) in organoidi cervello 3D derivate da un paziente microcefalia 4. Questo paziente portava una mutazione in CPAP, una proteina conservata centrosomica richiesto per la biogenesi centrosome 5. Una crisi ipoglicemica ampiamente accettatatesi è che microcefalia è il risultato di una deplezione del pool NPC, e questo potrebbe essere dovuto sia a morte cellulare o alla differenziazione precoce 1, 6, 7, 8, 9. Analizzando le zone ventricolari (VZS) di organoidi cerebrali microcefalia, è stato dimostrato che un numero significativo di NPC subisce divisione cellulare asimmetrica, a differenza organoidi cerebrali derivate da un donatore sano 4. Ampie analisi microscopiche e biochimiche del cervello organoidi microcefalia hanno rivelato un ruolo inaspettato per CPAP in tempo utile lo smontaggio cilia 4. Specificamente, CPAP mutato è associato ritardato smontaggio cilium e ritardata ciclo cellulare rientro, porta alla differenziazione precoce di NPC 4. Questi risultati suggeriscono un ruolo per cilia in microcefalia e THcoinvolgimento EIR durante la neurogenesi e le dimensioni del cervello di controllo 10. La prima parte di questo protocollo è una descrizione di un metodo in tre fasi per generare organoidi cerebrali omogenei. Come accennato prima, il protocollo Lancaster originale è stato adattato e modificato per soddisfare il nostro scopo 1. In primo luogo, iPSCs umani sono coltivate in una condizione priva di alimentazione definita sulla matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Questo passaggio evita le variazioni di colture di cellule staminali pluripotenti alimentatore-dipendente. In questo protocollo, l&#39;induzione della differenziazione neurale per formare epitelio neurale parte direttamente dal iPSCs. Saltando la fase di formazione del corpo embrioide (EB), i neurali procede differenziazione in maniera più controllata e diretta. Questo approccio limita la formazione spontanea e non orientato di altri strati di cellule germinali, come mesoderma e endoderma. Applicando questo protocollo, neurosfere contenenti rosette neurali possono essere raccolte il giorno 5 per EHS matrice incorporamento e coltura in sospensione stazionario. Il mezzo organoide utilizzato per il terzo gradino del nostro protocollo è completato con dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin è un inibitore della piccola molecola di proteina morfogenica ossea (BMP), e inibisce la SB431542 / activin / via di segnalazione nodale TGFp. La combinazione di questi fattori potrebbe promuovere la differenziazione neuronale più efficiente rispetto all&#39;acido retinoico solo 11, 12, 13, 14. Complessivamente, queste modifiche consentono la generazione riproducibile di organoidi cerebrali, con variazioni minime attraverso organoidi. È importante sottolineare che questo metodo è stato applicato per generare robusto organoidi cerebrali microcefalia da iPSCs paziente, che portano le mutazioni nei geni che influiscono centrosomi e dinamiche del ciclo cellulare. La seconda parte di questo protocollo fornisce le istruzioni per preparare brain organoidi per l&#39;analisi e l&#39;interpretazione dei difetti cellulari in microcefalia. Questo include la fissazione, criosezionamento, colorazione di immunofluorescenza e analisi al microscopio confocale. Questo protocollo fornirà al lettore una descrizione dettagliata dei risultati attesi e con la guida per l&#39;interpretazione.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inoculation loop with needle, disposable (1 &amp;micro;L)</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, store solution at -20 &amp;deg;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>See manufacturer&amp;acute;s instructions; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&amp;acute;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td></tr><tr><td>Reagent B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &quot;enzymatic cell dissociation solution&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Research Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slides should be labeled with a &quot;+&quot; and positively charged</td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplement (100x)</td></tr><tr><td>Supplement 2 w/o Vitamin A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>waterproof sheet</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td></tr></tbody></table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

La generazione di organoidi cerebrali richiede almeno tre settimane di coltura continua (Figura 1A). Per ottenere risultati riproducibili, è consigliabile che il ricercatore documenta ogni passo e, soprattutto, evita alcuna modifica per quanto riguarda i componenti di media, punti di tempo, e la manipolazione delle cellule. Qui, diamo una sintesi di come valutare se le tappe critiche sono raggiunti al fine di ottenere organoidi di qualità sufficiente alla fine dell&#39...

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.0K Views.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

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Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

<meta charset="utf8"></head><body>Generazione di organoidi cerebrali umani con microglia residenti utilizzando HPC derivate da iPSC

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

Generazione di organoidi 3D del mesencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental defects whose underlying mechanisms remain to be elucidated. A major roadblock is the lack of effective models recapitulating the early-onset neuronal impairment seen in the patients. Advances in the technology of induced pluripotent stem cells (iPSCs) enable the generation of three-dimensional (3D) brain organoids that can be used to investigate the impact of diseases on the development and organization of the nervous system. Researchers, including these authors, have recently introduced human brain organoids to model mitochondrial disorders. This paper reports a detailed protocol for the robust generation of human iPSC-derived brain organoids and their use in mitochondrial bioenergetic profiling and imaging analyses. These experiments will allow the use of brain organoids to investigate metabolic and developmental dysfunctions and may provide crucial information to dissect the neuronal pathology of mitochondrial diseases.

We describe a detailed protocol for the generation of human induced pluripotent stem cell-derived brain organoids and their use in modeling mitochondrial diseases.

Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Generazione di IPSC-derivati cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

Generazione di organoidi 3D del mesencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

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Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

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