Name: generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Somos gratos à facilidade de incorporação do tecido e da instalação do núcleo microscópio de CMMC. Estamos gratos pelas discussões e suporte técnico fornecido pelos membros do Laboratório de centrossoma e citoesqueleto Biology. Agradecemos Li Ming Gooi pela revisão do manuscrito.

1. Geração de Cérebro Organóides (23 dias) <ol><li> Iniciação de neuroectoderme (5 dias) Nota: Os seguintes pontos devem ser considerados antes do início da diferenciação. O método de reprogramação (lentiviral- etc, à base de microARN Sendai-a vírus, episomal-, OR) para obter iPSCs humanos devem, idealmente, ser o mesmo para todos os pacientes e controlar linhas IPSC. Vários kits de reprogramação e instruções baseadas em protocolos publicados estão disponíveis 15, 16, 17, 18. A qualidade das linhas de IPSC humanos é a chave para realizar uma diferenciação óptima. Monitorar colónia e morfologia das células com um microscópio e validar pluripotência, testando a expressão de marcadores, tais como OCT3 / 4, Nanog, ou TRA-1-60. <ol><li> iPSCs cultura humanos sob condições isentas de alimentação em meio A em um prato revestido com Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz. NOTA: Cresça iPSCs humanos e para manter uma condição de cultura definido e para evitar um passo adicional para a remoção de células de alimentação de rato embrionários (MEFs) antes do início da diferenciação sem soro livre de alimentador. O número de passagem óptima para iPSCs humanos para iniciar gamas de diferenciação a partir da passagem 15 em cima de reprogramação a passagem 70, no total. Quando passaging, separar colónias hiPSC como células agregação utilizando uma solução de separação celular apropriado com baixo esforço mecânico e uma pipeta serológica 2-mL para transferir agregados a um novo prato. Evitar a dissociação de células individuais, como este pode induzir a diferenciação e apoptose na maioria das linhas IPSC. Foi relatado que a longo prazo, a passagem de célula única poderiam aumentar alterações genómicas em iPSCs humano 19, 20. Evitar procedimentos de destacamento das células, as quais requerem um passo de centrifugação para remover a solução de desprendimento, pois isso reduz a viabilidade global de iPSCs. Testetodas as culturas para contaminações microbianas, particularmente micoplasma, em uma base regular, pois isso pode alterar a qualidade das iPSCs e sua capacidade de diferenciação. <ol><li> O revestimento de um tecido 60 milímetros prato de cultura com matriz EHS de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Descongelar uma aliquota de 1 x 10 6 iPSCs humanos. Semear as iPSCs em uma placa de cultura de tecidos de 60 mm revestidas com matriz EHS e contendo 5 mL de meio A (ver a Tabela Materiais). Alterar a forma e diariamente após a passagem de 5 a 7 dias, quando as células atingem ~ 80% de conflucia. NOTA: Passagem das iPSCs descongeladas a 80% de confluência utilizando métodos padrão, tais como o descolamento isenta de enzima de colónias de 21, pelo menos uma vez antes de iniciar a diferenciação. Em breve, remover o meio CIPS, lave as células uma vez com pré-aquecida até 37 Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ° C: Mistura de Nutrientes F12 (DMEM / F12), e incuba-se as iPSCs seguindo o fabricante deinstruções usando o reagente A (ver a tabela de materiais). Não exceda o tempo de incubação recomendado para evitar a dissociação de células individuais. iPSCs humanos deve ser destacado e que flutua na forma de agregados, as células não é tão simples. Eles podem então ser transferidas para novas placas revestidas com matriz de EHS; por exemplo, iPSC agrega a partir de um prato de 60 mm pode ser distribuído a 4 novos pratos de 60 mm. </li><li> Verifique para micoplasma com um kit de detecção de micoplasma de acordo com as instruções do fabricante. Use iPSCs única isentos de micoplasma, como micoplasma pode alterar a capacidade de diferenciação iPSCs. </li></ol></li><li> Dissociar iPSCs (80% confluentes) e preparar uma suspensão de célula única usando o reagente B. <ol><li> Lavam-se as iPSCs uma vez com pré-aquecido (37 ° C) de DMEM / F12. </li><li> Adicionar pré-aquecido reagente B (por exemplo, 1 ml de uma placa de 60 mm) e incuba-se as iPSCs durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Flick 20 vezes com a ponta dos dedos sobre o lado inferior e deo prato para separar as iPSCs. Entrada para o destacamento de células sob o microscópio. </li><li> Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo no prato 5 vezes com uma micropipeta 1 ml. </li><li> Adicionar 3 ml de meio A para diluir 1 mL de reagente B e recolher a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. </li><li> Suavemente girar para baixo as iPSCs (500 xg) durante 4 min temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio B e contar o número de células com um hemocitómetro. NOTA: Lembre-se de utilizar apenas meio B para a ressuspensão. Evitar o uso de meio A, uma vez que contém uma muito alta concentração de bFGF, que pode inibir a diferenciação. </li></ol></li><li> Dilui-se a suspensão de células a 4,5 x 10 5 culas por ml em meio B suplementado com 10 ^ M-rho associado inibidor de proteína cinase (Y-27632). </li><li> Adicionar 100 por po de uma forma não-aderente, de fundo em v, placa de 96 poços. NOTA: Certifique-se as células são igualmente distribuídos no SUSpensão por agitação do tubo de cada vez para retirar porções de 100 uL. É importante que cada cavidade deve conter um número de células equivalente, a fim de obter neuroesferas homogéneas em tamanho e forma (redondos, superfícies definidas). </li><li> Suavemente girar para baixo a placa com as células a 500 xg e a temperatura ambiente durante 3 min e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Mudar a forma diariamente através da remoção de 50 mL e adicionar 50 mL de meio fresco B em cada cavidade para os próximos 5 dias. </li></ol></li></ol> 2. Incorporação de neuroesferas em EHS Matriz (4 dias) <ol><li> Preparar o meio neuroesfera por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 1 100 (v / v) suplemento 2 sem (w / o) A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos não essenciais (MEM), 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / l de insulina, e mM β-mercaptoetanol 0,05. </li><li> Recolher o wit neurospheresha 200 mL micropipeta com uma ponta ~ 2 milímetros previamente cortado com tesoura estéreis. </li><li> Coloque as neuroesferas aproximadamente 5 mm de distância umas das outras no filme de parafina (3 x 3 cm2) numa placa vazia 100 mm e remover cuidadosamente tanto do meio restante quanto possível. </li><li> Adicionar uma gota (7 uL) de matriz para cada EHS único neuroesfera. </li><li> Incubar a matriz EHS gotas com as neuroesferas durante 15 minutos em uma incubadora. </li><li> Lavam-se as neuroesferas cuidadosamente a partir da película de parafina por rubor-los com meio neuroesfera. Para lavar, usar uma micropipeta 1 ml e um novo 100 milímetros placa de Petri contendo 10 ml de meio de neuroesfera. </li><li> Incubar as neuroesferas para os 4 dias seguintes e adicionar 2 mL de meio fresco neuroesfera no dia 2. NOTA: Certifique-se de que as prateleiras na incubadora são planas para que os neurospheres incorporado de matriz EHS não vai se aglutinarem em um lado do prato. </li></ol> 3. Organóides numa suspensão rotativaCultura (14 dias) <ol><li> Prepare cérebro médio organï¿½de por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento de 2 W / o um A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, MEM 0,05 mM, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542, e mM β-mercaptoetanol 0,05. </li><li> Adicionar 100 mL de cérebro organï¿½de meio a cada bal rotativo através dos seus braços laterais e colocá-los em uma incubadora para o pré-aquecimento durante pelo menos 20 min. </li><li> Defina-se um programa de agitação a 25 rpm, de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: Antes de transferir os neurospheres incorporado de matriz EHS em frascos spinner, certifique-se que todos eles estão separados. Se dois ou mais estão ligados através da matriz de EHS, separá-los por corte da matriz de ligação com um bisturi. </li><li> transferir cuidadosamente as neuroesferas incorporado-matriz EHS em frascos de agitação contendo 100 mL de meio nos organï¿½deing uma pipeta serológica 2 mL. Utilizar os braços laterais do balão rotativo para transferir as neuroesferas para o balão. </li><li> Colocar os frascos rotativos numa plataforma de agitação magnética numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2; este é dia 0 da cultura organóides. </li><li> Alterar o meio de uma vez por semana (ou mais frequentemente quando há uma mudança de cor), removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco. NOTA: Quando tirar os frascos spinner fora da incubadora, espere 3-5 minutos para permitir que os Organóides afundar até o fundo do frasco. Remover o meio, colocando a ponta da pipeta de vidro (ligada a uma bomba) sobre a superfície do líquido; Aspirar o meio cuidadosamente através de uma abertura lateral / braço do balão. Estas manipulações deve ser feito sob a capa laminar. </li></ol> 4. Análise do cérebro Organóides <ol><li> Fixação de Organóides <ol><li> Recolher os Organóides no dia 14 de cultura o wi bal rotativoth um corte de 1 mL micropipeta (corte a 5 mm). Coloque todos eles em um prato de 60 mm, e lavá-los uma vez com 5 mL de DMEM morno / F12, durante 3 min. </li><li> Preparar um tubo de 1,5 mL com 500 uL de paraformaldeído a quente 4% (PFA). Cuidado: use pele e proteção para os olhos e trabalhar sob um capuz de segurança ao manusear PFA fixador. </li><li> Colocar cada organï¿½de separadamente em cada tubo e corrigi-los por pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Não corrigir os Organóides por mais de 60 min. Para mover os Organóides, utilizar uma ansa de inoculação ou qualquer outro conceber que é conveniente. </li><li> Remover o PFA e lavar os Organóides fixas duas vezes durante 10 minutos cada um com 1 mL de PBS. </li><li> Armazenar os Organóides em 1 ml de PBS a 4 ° C durante até 7 dias, até à sua utilização. </li></ol></li><li> Incorporar os Organóides para cryosectioning <ol><li> Remover o PBS e adicionar 1 ml de sacarose a 30% em solução de água destilada por cada tubo para desidratar os Organóides antes cryofreezing-los; após a adição sucrosolução si, os Organóides deve ser flutuante na superfície. Armazenar os Organóides durante a noite em solução de sacarose a 4 ° C; no dia seguinte, as Organóides deve ter afundado até o fundo do tubo. NOTA: Organóides pode ser armazenado durante até 3-5 dias a 4 ° C numa solução de sacarose, se necessário. </li><li> Encher um molde de espécime de vinilo com 400 uL de temperatura de corte óptima composto (OCT) e utilizar uma ansa de inoculação a colocar um organóide no centro do molde. Rotular o aro do molde com o nome da amostra. </li><li> Congelar o molde contendo organï¿½de-se a -80 ° C até cryosectioning. </li><li> cryoslides vidro do revestimento com 0,1% de solução de lisina de poli-L-(PLL) em PBS durante 5 min à temperatura ambiente e deixar secar as lâminas durante 3 h. Armazenar os slides a 4 ° C e aquecê-los até temperado ambiente antes do uso. NOTA: PLL-revestimento é um passo importante, uma vez que irá evitar que as fatias de organï¿½de flutuando para longe. Recolha e armazenamento da solução de PLL, a 4 ° C durante até 3meses. Antes de reutilização, filtra-se com uma seringa de 0,22 um e deixe aquecer até à temperatura ambiente. </li><li> Organóides secção cryofrozen em fatias 20-50 um de espessura em um vidro revestido de PLL-cryoslides 22. Deixe as lâminas com as secções secar durante 1 h à temperatura ambiente. Armazenar as secções a -80 ° C até processamento adicional. </li></ol></li></ol> 5. imunofluorescência Coloração de secções organóides NOTA: Para a caracterização geral de Organóides, coloração com a nestina, um marcador de células progenitoras neurais, e TUJ1, um marcador pan-neuronal, é recomendado. Como exemplos adicionais, a coloração imunofluorescente com fosfo-vimentina (p-Vim), os marcadores de células gliais radiais apicais mitóticos, e Arl13b, para cílio, são descritos. Para testar a apoptose, utilizar o ensaio terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP Nick-End Rotulagem (TUNEL). Colocar as lâminas em uma caixa de plástico durante as incubações para protegê-los da poeira, luz,e secar. <ol><li> Descongelar as lâminas durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com 200 ul de PBS-glicina (0,225 g de glicina em PBS) durante 3 minutos para extinguir a autofluorescência induzida PFA. </li><li> Permeabilizar as secções com 200 uL de 0,5% de Triton X100 a 0,1% / tween em solução de PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar duas vezes com 200 uL de solução de PBS-glicina durante 3 min. </li><li> Incubar deles com 200 uL de 0,5% de gelatina de peixe / 0,1% de Triton X100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C para bloquear a ligação não específica de antigénio. NOTA: Se um ensaio de TUNEL for necessário, realizar o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante. Comece com o ensaio TUNEL antes de realizar a imunocoloração, como ele pode interferir com os anticorpos secundários e extinguir fluoróforos quando utilizado posteriormente. </li><li> Dilui-se os anticorpos em solução com as seguintes concentrações de bloqueio: nestina, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpos secundários, 1: 1.000. </li><li> Incubar com 200 uL do primeiro anticorpo primário (por exemplo, nestina) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Dilui-se a primeira (anti-ratinho 488) Anticorpo secundário 1: 1000 em solução de bloqueio e incubar a corrediça em 200 ul durante 1-2 h à temperatura ambiente. De agora em diante, sempre proteger os slides da luz. </li><li> Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Incubar com 200 uL do anticorpo primário ao lado (por exemplo, TUJ1) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Adicionar 200 uL da próxima anticorpo secundário (anti-coelho de 647) durante 1-2 h à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 x 3 min. com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Adicionar 200 uL de 4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a uma conc nM 30entration em PBS durante 15 min à temperatura ambiente para coloração nuclear. </li><li> Lavar 2 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Lavar 1 x 1 min com 200 mL de água destilada e deixar as secções secar durante 10-20 minutos, até que nenhuma gota de água é óbvia visível mais. </li><li> Montar as secções com meio de inclusão. Armazená-los ao abrigo da luz a 4 ° C durante até várias semanas. </li><li> Prosseguir com a análise microscópica para a imagem uma visão geral da zona organóides, ventricular, placa cortical primitiva, e outras áreas de interesse. </li><li> Usar um microscópio confocal com um óleo de 63X filtros objectivos e fluorescentes, escolhido de acordo com os anticorpos secundários etiquetados com corante fluorescente utilizado 1, 10. </li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Wilson, P. G., Stice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+neural+rosettes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).</li><li>Dhara, S. K., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+synthetic+retinoid+derivatives+as+inducers+of+stem+cell+differentiation.">Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation.</a> Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity.">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell stem cell. , (2017).</li><li>Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+Characterization+of+a+MYF5+Reporter+Human+iPS+Cell+Line+Using+CRISPR/Cas9+Mediated+Homologous+Recombination.">Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination.</a> Sci. Rep. 6, 18759 (2016).</li><li>Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genomic+correction+methods+in+human+iPS+cells+using+CRISPR-Cas9+system.">Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 101, 27-35 (2016).</li><li>Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isogenic+Human+iPS+Cell+Line+Precisely+Corrected+by+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas9+System.">Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.</a> Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li><li>D'Avanzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+in+3D+culture:+challenges+and+perspectives.">Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives.</a> Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPH é um distúrbio neurológico humano complexo que não pode ser recapitulado em modelos animais in vivo, ou em cultura de células humanas simples abordagens in vitro. A manifestação clínica da MCPH começa a aparecer durante o primeiro trimestre, quando no início neurogênese começa. Assim, Organóides cerebrais 3D representam um sistema experimental confiável para modelar desenvolvimento MCPH. Além disso, 3D Organóides cérebro humano são uma abordagem ideal uma vez que i) que permita a...

desordens do neurodesenvolvimento, tais como humanos, microcefalia, só pode ser pobremente estudado em modelos animais, devido ao facto de que os cérebros humanos têm uma superfície cortical estendida, uma característica única que difere a partir de animais não-humanos. Este aspecto torna o desenvolvimento do cérebro humano de um processo complexo que não pode ser suficientemente estudado num 2D, no sistema de cultura de células in vitro. Emergentes técnicas de cultura 3D permitem a geração de Organóides de tecido semelhante a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). A diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes numa cultura em suspensão em 3D permite a formação de vários tipos de células de uma maneira atempada e específico de região, dando origem a, um tecido organizado estratificada 1, 2, 3. Graças a laboratórios que foram pioneiros tecnologias de cultura 3D e desmistificadas a complexidade da formação de órgãos, começando a partir de células estaminais,foi desenvolvido um método robusto de gerar Organóides cerebrais para delinear eventos precoces do desenvolvimento do cérebro humano e para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. É digno de nota que nós adaptamos o método original desenvolvido por Lancaster et al. para gerar Organóides cerebrais 1. Este método foi modificado de acordo com as necessidades experimentais. O objectivo de um estudo de Gabriel et al. foi analisar os mecanismos celulares e moleculares da manutenção de células estaminais neurais durante o desenvolvimento do cérebro. A fim de fazer isso, um estudo mecanicista foi realizada através da análise de células progenitoras neurais (NPCs) em Organóides cerebrais 3D derivadas de um paciente microcefalia 4. Este paciente levou uma mutação em CPAP, uma proteína conservada centrosomal necessário para a biogénese centrossoma 5. Uma hipoglicemia amplamente aceitotese é que microcefalia é o resultado de um esgotamento do pool de NPC, e isto pode ser devido tanto a morte celular ou a diferenciação precoce 1, 6, 7, 8, 9. Ao analisar as zonas ventriculares (vzs) de Organóides cerebrais microcefalia, mostrou-se que um número significativo de NPCs sofrem divisão celular assimétrica, ao contrário Organóides cerebrais derivadas de um dador saudável 4. Análises microscópicas e bioquímicas extensas de Organóides cerebrais microcéfalos revelou um papel inesperado para CPAP em cílios oportuna desmontagem 4. Especificamente, CPAP mutado está associada com a desmontagem cílio retardado e a re-entrada do ciclo celular retardada, levando à diferenciação precoce de NPCs 4. Estes resultados sugerem um papel para cílios em microcefalia e thenvolvimento eir durante a neurogênese e tamanho do cérebro de controle 10. A primeira parte deste protocolo é uma descrição de um método de três passos para gerar Organóides cerebrais homogéneas. Como mencionado anteriormente, o protocolo Lancaster original foi adaptado e modificado para se adequar a uma finalidade. Em primeiro lugar, iPSCs humanos são cultivados num estado livre de alimentador definido em Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz. Este passo evita as variações de culturas de culas estaminais pluripotentes dependente de alimentação. Neste protocolo, a indução de diferenciação neuronal para formar epitélio neural começa directamente a partir iPSCs. Por saltando a etapa de formação de corpos embrióides (EB), os rendimentos de diferenciação neuronais de uma maneira mais controlada e orientada. Esta abordagem limita a formação espontânea e não-dirigida de outras camadas de células germinais, tal como mesoderme e endoderme. Ao aplicar este protocolo, neuroesferas contendo rosetas neurais podem ser colhidas no dia 5 para EHS incorporação matriz e cultura de suspensão estacionária. O meio utilizado para o organóide terceiro passo do nosso protocolo é suplementado com dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin é um inibidor de molécula pequena de proteína morfogénica do osso (BMP), e SB431542 inibe a via do TGFp / activina / nodal sinalização. A combinação destes factores poderia promover a diferenciação neuronal de forma mais eficiente do que o ácido retinóico sozinho 11, 12, 13, 14. Em conjunto, estas alterações permitem que a geração reprodutível de Organóides cerebrais, com variações mínimas através Organóides. Importante, este método foi aplicado para gerar robustamente Organóides cerebrais microcéfalos de iPSCs paciente, que transportam mutaes nos genes que afectem centrossomas e dinâmica do ciclo celular. A segunda parte deste protocolo dá instruções para preparar brain Organóides para a análise e interpretação dos defeitos celulares em microcefalia. Isto inclui a fixação, cryosectioning, coloração de imunofluorescência, e análise microscópica confocal. Este protocolo irá fornecer ao leitor uma descrição detalhada dos resultados previstos e com orientação para interpretação.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inoculation loop with needle, disposable (1 &amp;micro;L)</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, store solution at -20 &amp;deg;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>See manufacturer&amp;acute;s instructions; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&amp;acute;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td></tr><tr><td>Reagent B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &quot;enzymatic cell dissociation solution&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Research Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slides should be labeled with a &quot;+&quot; and positively charged</td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplement (100x)</td></tr><tr><td>Supplement 2 w/o Vitamin A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>waterproof sheet</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td></tr></tbody></table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

A geração de Organóides cerebrais requer pelo menos três semanas de cultura contínua (Figura 1A). Para conseguir resultados reproduzíveis, recomendamos que o pesquisador documenta cada passo e, sobretudo, evita quaisquer alterações em relação componentes do meio, pontos de tempo e manipulação de célula. Aqui, damos um resumo de como avaliar se marcos críticos são atingidos a fim de obter Organóides de qualidade suficiente no final do experimento. A forma?...

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.7K visualizações.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

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Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Biologia do Desenvolvimento

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Modificação genética de organoides cerebrais de primatas

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

Autor em destaque: Microinjeção direcionada e eletroporação de organoides cerebrais de primatas para modificação genética  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

Geração de organoides 3D do mesencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

<meta charset="utf8"></head><body>Gerando organoides do cérebro humano com microglia residente usando HPCs derivados de iPSC

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Geração de organoides 3D do mesencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia

Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia