Questo protocollo mira a utilizzare organoidi cerebrali per studiare le malattie mitocondriali. È stato sviluppato per generare organoidi cerebrali riproducibili nella valutazione delle loro proprietà mitocondriali. Questo metodo non richiede costosi bioreattori e lunghe procedure di incorporamento.
Pertanto, è facile da implementare e aggiornare. Questo protocollo consente di generare organoidi cerebrali riproducibili e di testarne le proprietà mitocondriali. Ciò può portare all'identificazione di bersagli interventistici per le malattie dei mitocondri non curabili.
Per iniziare, coltivare iPSC umani in condizioni prive di alimentatore in mezzo iPSC su piastre rivestite a sei pozzetti e tenerle in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Passare le iPSC all'80% di confluenza utilizzando il mezzo di distacco privo di enzimi in rapporti che vanno da uno per quattro a uno per 12. Per aumentare la sopravvivenza cellulare, aggiungere 10 protein chinasi micromolari rho-associate o inibitore ROCK dopo ogni scissione.
Dissociare l'80% delle iPSC al giorno zero. Preparare il mezzo di differenziazione corticale uno o CDM1 e preriscaldarlo a temperatura ambiente prima di aggiungerlo alle cellule. Lavare i pozzetti contenenti gli iPSC con PBS per rimuovere cellule morte e detriti.
Aggiungere 500 microlitri di reagente A preriscaldato a ciascun pozzetto e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Controllare al microscopio per garantire il distacco cellulare. Aggiungere un millilitro di mezzo iPSC per diluire il reagente A per neutralizzarne l'attività.
Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per dissociare le celle tubando su e giù e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Centrifugare delicatamente le iPSC a 125 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare accuratamente il surnatante per evitare di disturbare il pellet cellulare. Risospesciare il pellet con un millilitro di CDM1 per ottenere una sospensione a cella singola e contare il numero di cella.
Preparare il terreno di semina con 9.000 iPSC per 100 microlitri in CDM1 integrati con 20 inibitori ROCK micromolari, tre inibitori micromolari della catenina WNT o IWR-1 e cinque micromolari SB-431542. Aggiungere 100 microlitri di terreno di semina per pozzetto a una piastra inferiore a V a 96 pozzetti. Tenere la piastra in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Per generare neurosfere, il primo giorno, osserva che si stanno formando aggregati di cellule rotonde con bordi lisci definiti. Si notino le cellule morte intorno agli aggregati. Continuare a coltivare nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Il terzo giorno, agitare la piastra toccando i lati tre volte per staccare le cellule morte, quindi aggiungere 100 microlitri di CDM1 integrati con 20 inibitori ROCK micromolari, tre micromolari IWR-1 e cinque micromolari SB-431542 a ciascun pozzetto. Tenere la piastra all'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il sesto giorno, rimuovere con cura 80 microlitri del mezzo surnatante da ciascun pozzetto.
Evitare di toccare il fondo del pozzo. Aggiungere 100 microlitri di CDM1 integrati con tre micromolari IWR-1 e cinque micromolari SB-431542 a ciascun pozzetto e incubare la piastra. Ripetere il passaggio precedente ogni tre giorni fino al giorno 18.
Il giorno 18, per trasferire le neurosfere, preparare CDM2 e aggiungere 10 millilitri a una piastra di coltura cellulare ad attacco ultra basso da 100 millimetri. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri con la punta tagliata per trasferire le neurosfere rotonde dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra di coltura cellulare ad attacco ultra basso da 100 millimetri. Rimuovere cinque millilitri di mezzo dalla piastra contenente le neurosfere e aggiungere cinque millilitri di CDM2 fresco.
Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Ogni tre giorni, aspirare accuratamente il mezzo surnatante e sostituirlo con CDM2 fresco. Lasciare una piccola quantità del mezzo per evitare che le neurosfere si secchino.
Il giorno 35, prepara CDM3. Aspirare il mezzo dalla piastra e aggiungere 10 millilitri di CDM3 freddo. Dopo aver cambiato il mezzo, riposizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Cambia il mezzo ogni tre o cinque giorni a seconda del tasso di crescita indicato dal colore del mezzo. Il giorno 70, preparare CDM4. Utilizzare il mezzo CDM4 fino al raggiungimento dell'età desiderata degli organoidi.
Durante questo periodo, mantenere la piastra su uno shaker orbitale impostato a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Cambia il mezzo ogni tre o cinque giorni a seconda del tasso di crescita. Preparare la soluzione al 4% di PFA e posizionarla sotto un cappuccio di sicurezza.
Raccogli gli organoidi cerebrali e trasferiscili delicatamente con una pipetta Pasteur di plastica da tre millilitri con punta smussata su una piastra a sei pozzetti piena di PFA. Conservare gli organoidi nella soluzione di PFA per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il PFA con una pipetta Pasteur in plastica da tre millilitri e lavare gli organoidi fissi tre volte utilizzando PBS.
Conservare gli organoidi fissi a quattro gradi Celsius in PBS fino a nuovo utilizzo. Gli organoidi generati utilizzando questo protocollo contengono neuroni maturi che possono essere visualizzati utilizzando marcatori proteici specifici per assoni e dendriti. Gli organoidi maturi contengono non solo cellule neuronali, ma anche cellule gliali.
Utilizzando l'analisi degli organoidi cerebrali affettati, è possibile monitorare gli assoni positivi SMI 312 e i dendriti MAP2 positivi o le cellule beta gliali S100. Inoltre, le immagini confocali aiutano a studiare la distribuzione dettagliata e l'organizzazione dei progenitori neurali positivi SOX2 rispetto ai neuroni beta-3 positivi alla tubulina. Gli organoidi cerebrali sono stati colorati per marcatori specifici dei mitocondri, come translocase della membrana esterna o TOM20.
Il profilo bioenergetico degli organoidi cerebrali è stato eseguito misurando sia il metabolismo mitocondriale utilizzando il tasso di consumo di ossigeno, o OCR, sia il metabolismo glicolitico utilizzando il tasso di acidificazione extracellulare, o ECAR. L'oligomicina provoca un calo del profilo OCR e quindi identifica l'OCR necessario per la produzione di ATP. Dopo il trattamento con oligomicina, ci può anche essere un aumento compensatorio dell'ECAR suggerendo che le cellule possono sovraregolare la glicolisi per prevenire lo stress metabolico.
Quando si trasferiscono le neurosfere dalla piastra a 96 pozzetti a una piastra di coltura o durante la procedura di fissaggio, è fondamentale maneggiare delicatamente gli organoidi per evitare di danneggiarli. Dopo la generazione di organoidi cerebrali, l'array multi-elettrodo o l'imaging del calcio sarebbero metodi ideali per testare la funzionalità degli organoidi.
