Questo protocollo fornisce conoscenze pratiche, utili per formulare particelle su scala nanometrica, cioè nanodischi, che incorporano stabilmente una vasta gamma di molecole bioattive idrofobiche. Questo metodo ha molte applicazioni pratiche.
La capacità di conferire solubilità acquosa a composti bioattivi altrimenti insolubili consente l'uso di nanofloppy in applicazioni di somministrazione di farmaci. Il metodo descritto è semplice. Si preferisce condurre studi alla scala descritta, cinque milligrammi di fosfolipidi, due milligrammi di proteina dell'impalcatura, in modo che la formazione di nanodischi sia prontamente monitorata mediante ispezione visiva.
A dimostrare la procedura saranno Michael Karo e Matthew Swackhammer, studenti universitari ricercatori nel laboratorio Ryan. Per preparare un'aliquota fosfolipidica, pesare cinque milligrammi di DMPC e trasferirla in una provetta di vetro. Sciogliere il fosfolipide aggiungendo 300 microlitri di cloroformio e 100 microlitri di metanolo per un rapporto di tre a uno.
Evaporare il solvente organico ponendo la provetta di vetro sotto un leggero flusso di azoto gassoso per 10-15 minuti, in modo tale che un sottile film di fosfolipidi essiccati si formi lungo le pareti della parte inferiore della provetta. Per formulare amfotericina B o AmpB-Nanodisks, pipettare 450 microlitri di PBS sull'aliquota fosfolipidica liofilizzata e vortice per 30 secondi per disperdere il lipide. Pipettare 50 microlitri di soluzione di AmpB da 20 milligrammi per millilitro nel campione di fosfolipidi dispersi e nel vortice.
Aggiungere 500 microlitri di quattro milligrammi per millilitro di proteina scaffold ApoE4 NT alla provetta di vetro contenente il fosfolipide disperso e AmpB. Bath sonicare il campione a 24 gradi Celsius fino a quando la soluzione non si chiarisce. Per la dialisi AmpB-Nanodisk, preparare una sezione di tubo di dialisi immergendolo accuratamente in acqua deionizzata distillata per 10 minuti.
Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che nessun liquido possa fuoriuscire. Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e trasferire il campione di AmpB-Nanodisk nel tubo di dialisi. Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.
Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente tampone PBS da un litro appena preparato. Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione al minimo, assicurandosi di non produrre un vortice. Consentire la dialisi per continuare durante la notte a quattro gradi Celsius.
Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione e collegarlo a un computer di supporto corrispondente premendo Controllo PC. Sul computer di supporto, aprire il software etichettato UVProbe 2.61 e connettersi allo spettrofotometro facendo clic su "connetti" nell'angolo in basso a sinistra. Fare clic sullo spettro, quindi fare clic su "metodo" nella barra degli strumenti in alto.
Fare clic sulla scheda di misurazione e immettere 500 nella casella di testo iniziale" situata sotto l'intervallo di lunghezze d'onda e 300 nella casella di testo "fine". Fare clic sul menu a discesa accanto alla scheda "velocità di scansione" e impostarlo su medio. Preparare un campione bianco trasferendo un millilitro di DMSO in due cuvette di quarzo.
Caricare entrambe le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro. Fare clic su "spazio vuoto automatico" e registrare uno spettro da 300 a 500 nanometri facendo clic su "start" nell'angolo in basso a sinistra. Per l'analisi spettrale standard AmpB, rimuovere la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione madre AmpB.
Caricare nuovamente la cuvetta nella scheda campione e fare clic su "start" per registrare l'assorbanza del campione. Dopo aver registrato l'assorbanza del campione, rimuovere la cuvetta e decantare il contenuto liquido in un contenitore per i rifiuti. Risciacquare accuratamente la cuvetta con tre lavaggi di acqua deionizzata, seguiti da tre lavaggi con etanolo al 70%.
Per l'analisi spettrale di AmpB-Nanodisk interrotto, preparare il campione pipettando 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di AmpB-Nanodisk stock in un millilitro di DMSO e incubare per un minuto prima di registrare lo spettro. Caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione e fare clic su "start" per registrare l'assorbanza del campione. Per l'analisi spettrale di un bianco tampone PBS, preparare un bianco trasferendo un millilitro di PBS in due cuvette di quarzo.
Caricare le cuvette nella porta del campione. Fare clic su "vuoto automatico" e registrare lo spettro da 300 a 500 nanometri. Per l'analisi spettrale di un campione di AmpB-Nanodisk non interrotto, rimuovere la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di campione di AmpB-Nanodisk nel buffer PBS.
Caricare nuovamente la cuvetta nella scheda campione. Fare clic su Start" e registrare lo spettro del campione. La reazione di formulazione AmpB-Nanodisk è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro.
Viene mostrata la spettroscopia di assorbimento visibile UV di campioni di AmpB in DMSO e PBS. Nel DMSO sono stati osservati tre distinti massimi di assorbanza a 372, 392 e 415 nanometri, picchi indicativi di AmpB. Gli spettri di assorbanza dei nanodischi AmpB in PBS hanno mostrato un singolo picco di assorbanza maggiore a una lunghezza d'onda più corta.
In confronto, gli spettri di assorbanza degli AmpB-Nanodisk nel DMSO apparivano simili agli spettri degli AmpB di serie. L'attività biologica di AmpB-Nanodisks è stata eseguita valutando i saggi di inibizione della crescita del lievito. Campioni di controllo come PBS, DMSO e lipoproteine ad alta densità ricostituite hanno dimostrato che i componenti dei nanodischi diversi dall'AmpB non hanno alcun effetto visibile sulla crescita del lievito.
Il controllo positivo ha confermato che AmpB è un inibitore efficiente della crescita del lievito. Nel caso dei nanodischi AmpB, è stata osservata un'attività di inibizione della crescita dipendente dalla concentrazione. Non tutti i preparati di nanodisk sono uguali.
Alcuni possono richiedere più tempo, lipidi diversi o diverse proteine dell'impalcatura. Esse sono solo indistinguibili è la chiarificazione del campione di nanodisk. Questa tecnica ha portato a nuove nanoparticelle utilizzate per studiare la cardiotossicità indotta da doxorubicina, l'apoptosi, le interazioni dei ligandi e ha fornito numerose molecole bioattive insolubili acquose, tra cui luteina e curcumina.
