MCV è membro del programma CIB Intramural &quot;Macchine Molecolari per una migliore vita&quot; (MACBET). La ricerca che ha portato a questi risultati è stato finanziato dall&#39;ente spagnolo Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), dal ministero spagnolo de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP alla MCV ), Il governo regionale di Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) e la Commissione europea (Programma quadro 7 (FP7)) il progetto ComplexINC (contratto n. 279039 a MCV). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta di dati e nell&#39;analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Attenzione: Prima dell&#39;uso consultare tutte le schede tecniche di sicurezza relative ai materiali (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e corrosive. Utilizzare pratiche appropriate quando si esegue l&#39;estrazione di tRNA utilizzando fenolo, incluso l&#39;uso di un cappuccio e delle attrezzature di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse, ecc .). Questo protocollo utilizza una macchia acida nucleica non tossica. L&#39;uso di macchie alternative può richiedere ulteriori precauzioni e smaltimento specializzato del colorante se tossico e / o cancerogeno ( es . Bromuro di etidio). 1. Preparazione del gel agarosico <ol><li> Pesare 2 g di agarosio e aggiungerlo ad una bottiglia di vetro per preparare un gel agarosico al 2% in peso. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone di tris-borato-etilendiammetraacetico (EDTA) (TBE) alla bottiglia contenente agarosio. Sciogliere per riscaldamento in un forno a microonde. A intervalli di 30 secondi, ruotare il contenuto da mescolareBene e ripetere questa fase fino a quando l&#39;agarosio è completamente sciolto. Lasciare raffreddare la soluzione agarosa a circa 50-60 ° C. </li><li> Nastri i bordi aperti di un vassoio di gel per creare uno stampo, posizionare un pettine appropriato per creare i pozzetti e lanciare l&#39;agarosio fuso in esso. Evitare la formazione di bolle e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente. </li><li> Una volta solidificato, posizionare il vassoio gel in un&#39;unità di elettroforesi e riempirlo con tampone TBE fino a quando il gel è completamente coperto. </li></ol> 2. Preparazione del tRNA <ol><li> Express tRNA (UUU) in E. coli <ol><li> In mattinata, utilizzare un flacone di E. coli BL21 congelato (DE3) trasformato con il vettore di espressione pET23d-EcUUU 2 (porti il ​​gene che codifica E. coli tRNA (UUU)) per strisciare un Luria Broth (LB) Piastra integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Invertire la piastra e posizionarla in un incubatore a 37 ° C fino a quando le colonie non appaiono (tardi afternoon). </li><li> Inoculare una ben coltivata singola colonia in 5 mL di LB e 100 μg / mL di ampicillina e si sviluppa per una notte a 220 giri / min a 37 ° C. </li><li> La mattina successiva, le cellule (6,500 xg per 10 minuti a 4 ° C), sostituire il mezzo con 5 ml di LB fresco e 100 μg / mL di ampicillina e risospendere. Utilizzare questa sospensione per inoculare 200 mL LB più 100 μg / mL ampicillina. Crescere per 5 ore a 220 giri / min a 37 ° C. </li><li> Quando la densità ottica della coltura a 590 nm (OD 590 ) ha raggiunto 0,6 - 0,8, aggiungere 1 mM IPTG alla coltura per innescare l&#39;espressione del gene tRNA (UUU). Incubare a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 6.500 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lisi e estrazione <ol><li> Resuspendere il pellet cellulare in 5 ml di tampone di lisi (0,3 M acetato di sodio, 10 mM EDTA). Da questo punto in poi, utilizzavano buffers autoclavati e mantenete tutti i campioni contenenti tRNA a 4 ° C per evitare tRNA degradazione. </li><li> Aggiungere 1 volume di fenolo acido (pH 4,3) al pellet di cellule risospese nel cofano. Mescolare per 1 min per inversione per lire le cellule e centrifugare a 10.000 xg (10 min, 4 ° C). </li><li> Raccogliere la fase acquosa superiore contenente il tRNA solubile (UUU) (e minori concentrazioni degli altri pool di tRNA) usando una pipetta facendo attenzione a non aspirare la fase organica (inferiore). Scartare lo strato inferiore e il pellet, costituito dalla fase organica e dai detriti cellulari, in un contenitore adeguato. </li><li> Precipitare il tRNA mescolando accuratamente la fase solubile (acquosa) con etanolo da 2,5 vol. Al 100% v / v per inversione per 1 h a 4 ° C. Centrifugare la miscela a 15.000 xg (30 min, 4 ° C). </li><li> Decanta il supernatante con attenzione e riposiziona il pellet ricco di tRNA in tampone di filtrazione gel da 4 mL (20 mM fosfato di sodio o fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Eseguire 5 μL del pool tRNA risospeso in un agarosio di 2% in peso. NOTA:Il tRNA di buona qualità appare come una singola banda (dimensione molecolare tra 50-100 bp). </li></ol></li><li> Purificazione di tRNA (UUU) <ol><li> Seguendo la pratica cromatografica standard 12 , caricare il tRNA (UUU) resuspendito su una colonna di filtrazione gel ad alta risoluzione (dimensioni: 16 x 600 mm, volume letto: 120 mL, intervallo di risoluzione: 1.000-70.000 Da) precedentemente equilibrato nel tampone di filtrazione gel (fase mobile). Impostare la portata a 1 mL / min per eluire i campioni. NOTA: Il picco di tRNA (UUU) eluisce approssimativamente a 75,5 ml. In genere, si può ottenere una resa di 0,5-1,0 mg / l tRNA di coltura. </li><li> Analizzare i campioni nei volumi rappresentativi di eluizione mediante elettroforesi di 5-10 μL di ciascun campione su un agarosio 2% in peso di agarosio. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione del campione <ol><li> Esprimere e purificare TcdA secondo López-Estepa et al . 2 . NOTA: Fino a 250 μMTcdA può essere utilizzato per lo studio. </li><li> Pipettare la corrispondente quantità di TcdA come indicato nella tabella 1 in tubi centrifugati di 1,5 ml etichettati correttamente. Aggiungere 1,6 mM di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) (concentrazione finale) e mescolare delicatamente usando una pipetta. Chiudere il coperchio e incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 10 μM di trifosfato di adenosina (ATP) e 50 mM di MgCl2 (concentrazioni finali). Mescolare con una pipetta e incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il tRNA purificato (UUU) (sezione 2.3) secondo la tabella 1 , mescolare con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere salina tampone fosfato (PBS) fino a 100 μL di volume finale. Mescolare correttamente e aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale del 10% v / v. </li><li> Vortice il campione e brevemente scomponi il contenuto del tubo (10.000 xg, 1 min, 4 ° C). </li></ol> 4. Sviluppo del gel e di elettroforesi<ol><li> Posizionare l&#39;unità di elettroforesi in un vassoio pieno di ghiaccio tritato per mantenere la camera a 4 ° C durante l&#39;esecuzione dell&#39;elettroforesi. </li><li> Attentamente, pipettare 5 μL di ogni campione nel pozzetto corrispondente. Aggiungere un indicatore appropriato del DNA. </li><li> Inserire gli elettrodi negli appositi alloggiamenti dell&#39;alimentatore. Accendere l&#39;alimentatore e impostare la tensione su 100 V e far funzionare il gel per 90 minuti. </li></ol> 5. La colorazione del gel per osservare l&#39;interazione tRNA-Protein <ol><li> Preparare la soluzione di colorazione mescolando 50 ml di TBE con 1x di una macchia adeguata del DNA. Evitare di esporre la soluzione di colorazione alla luce solare coprendo il contenitore di colorazione con foglio di alluminio. NOTA: le macchie di DNA vengono normalmente memorizzate come scorte concentrate di 10.000 o 20.000x. </li><li> Dopo 90 minuti di elettroforesi, rimuovere accuratamente il gel dal vassoio e metterlo in un contenitore con una soluzione di colorazione. Posizionarlo su un bilanciere a bassa velocità di rotazione a temperatura ambienteUre per 30 min. </li><li> Rimuovere il gel agarosio dal contenitore di colorazione, toccarlo con cura su un pezzo di tessuto di cellulosa o carta filtrante per rimuovere il liquido in eccesso e collocarlo direttamente su un transilluminatore. Accendere la luce UV per visualizzare le bande contenenti tRNA. Prendi una fotografia del gel. </li><li> Colorazione delle proteine ​​(opzionale). <ol><li> Eliminare in modo sicuro la soluzione di colorazione del DNA (secondo procedure di sicurezza) e sostituirla con 50 ml di soluzione Coomassie Brilliant Blue (CBB). Posizionare il vassoio su un bilanciere a temperatura ambiente e macchiare durante la notte (&gt; 12 h). Eliminare la soluzione di colorazione CBB e sostituirla con 50 mL di PBS per rimuovere la tintura in eccesso. Destain per 1 ora su un rocker. </li></ol></li><li> Visualizzare i complessi tRNA contenenti proteine ​​sotto un transilluminatore di luce e fotografare il gel da confrontare con l&#39;immagine del gel tRNA UV. </li></ol>

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	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il saggio di retardazione del gel agarosico di proteina-tRNA descritto qui può essere modificato in diversi modi. In primo luogo, la percentuale di agarosio nel gel può essere ridotta per consentire la separazione e la visualizzazione di complessi proteina-tRNA significativamente più grandi di quelli analizzati qui (120 kDa). In secondo luogo, se la proteina bersaglio è termolabile, occorre prendere ulteriori precauzioni per garantire che la temperatura sia mantenuta al di sotto della massima temperatura accettabile...

<html> Il saggio di ritardo di gel 1 (noto anche come test di spostamento di mobilità elettroforetica, EMSA) è un metodo elettroforetico progettato per studiare e caratterizzare le interazioni proteiche-acido nucleico. Permette di analizzare le proteine-DNA e le interazioni proteine-RNA e in particolare le interazioni tra tRNA e proteine ​​leganti tRNA, utilizzando componenti purificati o miscele complesse di proteine ​​( ad es. , Lisati cellulari) o acidi nucleici ( ad esempio tRNA piscine). Abbiamo applicato saggi di retardazione del gel allo studio dell&#39;interazione tra tRNA purificato (UUU) e TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi, che ciclizza la catena laterale di treonilcarbamoil attaccata ad A37 nel ciclo anticodonale (ASL) Di tRNA a ciclica t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA è anche conosciuto come CsdL 3 ,F &quot;&gt; 4. Il gene tcdA / csdL forma un cluster con i geni 5 e 5 che codificano la cisteina desulfurasi e l&#39;acquirente dello zolfo del sistema cisina sulfinasi desulfinato (CSD) ed è richiesto per sostenere la funzione TcdA in vivo 3 . La ragione dietro i test di retardazione del gel è che, mentre le molecole di acido nucleico libere migrano rapidamente alla parte anteriore di acrilammide o gel agarosio in virtù della loro grande carica negativa, la mobilità elettroforetica dei complessi proteici degli stessi acidi nucleici è drasticamente ridotta. La riduzione della mobilità è visualizzata come un &quot;spostamento&quot; nei complessi proteici dell&#39;acido nucleico, che risolvono come bande discrete. Il complesso proteico acido nucleico caricato e maggiormente mostrato mostra un maggiore spostamento o riduzione della mobilità su un gel. Poiché la neutralizzazione del carico del complesso è un fenomeno universalePer i complessi di acido nucleico proteico, il saggio di retardazione del gel può essere applicato ad una vasta gamma di complessi e tipi di acido nucleico. Il metodo è semplice, poco costoso e può essere condotto in laboratori con attrezzature minime. Richiede solo piccole quantità di proteine ​​e tRNA. Questo è un vantaggio rispetto alle tecniche biofisiche alternative, che di solito consumano grandi quantità di campioni. Il saggio di retardazione del gel è stato ampiamente usato per lo studio dei fattori di trascrizione. Il saggio è stato utilizzato per analizzare la cinetica legante, la forza e la specificità dei fattori di trascrizione per molte sequenze di DNA diverse. Fu proprio in questo campo che l&#39;EMSA fu per la prima volta sviluppata 6 , 7 . I test di ritardo di gel con RNA 8 , 9 , 10 , 11 e molecole di tRNA sono stati utilizzati anche nella ricerca di ribosomiE di analizzare, come facciamo qui, gli enzimi che modificano i nucleosidi del tRNA post-trascrizionale. Molti parametri diversi influenzano il risultato di un test di ritardo di gel come la temperatura, la qualità della proteina e il campione tRNA e la forza del legame. La pianificazione e l&#39;esecuzione attenta dell&#39;esperimento è fondamentale per l&#39;interpretazione dei risultati delle specie libere di acido nucleico e proteine. Qui abbiamo usato il tRNA (UUU) codificante gene sintetico clonato in un vettore di espressione il cui promotore manca del sito di legame dei ribosomi Shine-Dalgarno, portando alla sintesi di grandi quantità del tRNA 2 . Questo protocollo dettagliato è inteso a fornire una guida chiara per eseguire esperimenti di ritardo del tRNA gel evitando errori comuni.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td></tr><tr><td>LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker (Thermostated)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&amp;nbsp;</td><td>Any shaker incubator with temperature control can be used.</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &gt;=99%</td><td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous, &gt;99%</td><td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &gt;99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated) rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &amp;plusmn; 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td></tr><tr><td>Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosive to metals and skin.</td></tr><tr><td>ATP [Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), anhydrous, &gt;=98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), &gt;99%</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), &gt;99%</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis unit</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe nucleic acid staining</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X stock</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G:Box/EF)</td><td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&amp;nbsp;</td><td>Fisher brand</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

Esistono metodi per l&#39;espressione e la purificazione di tRNA (UUU) in Escherichia coli e l&#39;analisi mediante test di ritardo di gel del legame di tRNA (UUU) a TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi che ciclizza il treonilcarbamoil La catena laterale attaccata ad A37 nel loop di gambo anticodon (ASL) di tRNA a ciclica t 6 A (ct 6 A). La transcrizione del gene sintetico che codifica il tRNA (UUU) è indotta in E. coli con 1 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e le cellule contenenti tRNA vengono raccolte 24 h postinduzione. La frazione RNA viene purificata usando il metodo di estrazione di fenolo acido. Il tRNA puro viene ottenuto mediante una cromatografia di filtrazione a gel che effettua la separazione efficiente delle molecole di tRNA di piccole dimensioni dai più grandi acidi nucleici intatti o frammentati. Per analizzare il legame TcdA a tRNA (UUU), TcdA viene mescolato con tRNA (UUU) e separato su un gel agarosico nativo a 4 ° C.Il tRNA libero (UUU) migra più velocemente, mentre i complessi TcdA-tRNA (UUU) subiscono un ritardo di mobilità che può essere osservato durante la colorazione del gel. Abbiamo dimostrato che TcdA è un enzima tRNA (UUU) -binding. Questo test di ritardo di gel può essere utilizzato per studiare mutanti TcdA e gli effetti degli additivi e di altre proteine ​​sul legame.

Grandi quantità di tRNA (UUU) possono essere ottenute esprimendo il gene tRNA in E. coli sotto il controllo di un forte promotore T7 inducibile. L&#39;espresso tRNA (UUU) si accumula nel citoplasma e si arricchisce sulla piscina di tRNA naturali abbondanti. Un procedimento di purificazione a due fasi costituito da una fase di cattura / estrazione e una fase di filtrazione / lucidatura gel è stata utilizzata per ottenere il tRNA di grado EMSA. La fase di cattura / estrazione ut...

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Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l&#39;analisi di tRNA (UUU) in complesso con l&#39;enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.

Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l&#39;analisi del<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -reonilcarbamoyladenosine TcdA Funzione

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

9.7K Views.  Spanish National Research Council (CSIC).  Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio. 

Video: Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Preparazione e<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilizzo di una sonda Activity-based per<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidasi

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

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Biochimica

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

Test in vitro Metilazione tRNA con l&#39;Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Immunologia e infezioni

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetica

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Bioingegneria

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l'analisi del

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Test in vitro Metilazione tRNA con l'Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme