L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di caratterizzare biochimicamente l'attività tRNA-Isopentenil Transferasi in vitro. Questo metodo è utile per il rilevamento e la caratterizzazione in vitro dell'attività tRNA-isopentenil transferasi degli enzimi ricombinanti purificati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un saggio semplice e diretto usato per rilevare una modifica covalente dell'RNA.
Sebbene questo metodo fornisca informazioni sull'attività tRNA-isopentenil transferasi, è potenzialmente adattabile per la caratterizzazione biochimica di enzimi di modifica a vasta gamma o RNA. Il primo passo di questa procedura è pulire accuratamente le lastre di vetro che verranno utilizzate per la fusione del gel. Lavare i piatti con acqua e sapone, risciacquare bene con acqua deionizzata, quindi pulire i piatti con isopropanolo e salviette senza pelucchi.
Quindi, assemblare le piastre e i distanziale. Mescolare i seguenti reagenti per fare un 100 millilitro 20%acrilammide, 7,5 urea molare, 1 gel TBE 1x. 80 millilitri di concentrato di gel di urea, 10 millilitri di diluente di gel di urea e 10 millilitri di tampone di gel di urea.
Aggiungere alla miscela 40 microlitri di T-med e 800 microlitri di persolfuro di ammonio preparato al momento. Disegnare la soluzione di gel in una grande siringa e distribuire la soluzione di gel tra le lastre di vetro che toccano il vetro mentre si eroga la soluzione per prevenire la formazione di bolle. Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente per 30 minuti.
Dopo che il gel si è solidificato, piantare il gel su un apparato gel verticale. Riempire le camere tampone superiore e inferiore con 1 TBE. Due ore prima di caricare il gel, pre-eseguire il gel a 20 milliarti per due ore per consentire al limite del buffer di esaurirsi e far funzionare gli oligonucleotidi più piccoli.
Preparare ogni reazione per il saggio di isopentenilazione dell'RNA in un volume finale di 17 microlitri. Aggiungere ad ogni tubo 50 millimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 millimolare ATP, 5.8 millimolare cloruro di magnesio, 0,2 millimolare DMAPP, 10 unità inibitore della RNasi, 40.000 CPM internamente 32P etichettato RNA, 5,3 micromolare Mod5 e 1,2 millimolare 2-mercaptoetanolo. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per un'ora.
Dopo un'ora, l'etanolo precipita la RNasi usando 2,5 volumi di etanolo al 100% e 1/10 volume di 3,5 acetato di sodio molare pH 5,5, e posizionarlo negativo di 20 gradi Celsius per un'ora durante la notte. Quindi, centrifugare i campioni di RNA a 15, 400 g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Rimuovere con cura il supernatante e lavare ogni pellet di RNA con 500 microlitri di 70%etanolo.
Centrifugare i campioni a 15, 400 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere con cura il supernatante e asciugare all'aria i pellet di RNA per 15 minuti o fino a quando tutto l'etanolo non è evaporato. Successivamente sospendere ogni pellet di RNA in 10 microlitri di otto urea molare.
Aggiungere 150 unità di RNasi T1 a ciascun campione e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, aggiungere due microlitri di buffer di caricamento 6x a ciascun campione. Caricare 10 microlitri di ogni campione di RNA su un gel di urea molare pre-eseguito, 20%poliacrilammide, 7,5 urea molare.
Eseguire il gel a 25 milliambi per due ore. Dopo due ore, interrompere l'elettroforesi e rimuovere il gel dall'apparecchio. Rompere la tenuta tra le due piastre di vetro e rimuovere con cura una delle piastre di vetro con il gel rimanente su entrambe le piastre.
Posizionare uno strato di plastica avvolgere il gel ed esporre su uno schermo di fosforo per tre ore. Questo protocollo rileva in modo affidabile l'apertura di residui di tRNA sia canonici che non canonici modificati dalla S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. In questo esempio il tRNA tirosina è stato etichettato internamente con 32P-adenosina e Mod5 è stato incubato con RNasi in presenza o assenza di DMAPP.
Gli RNA sono stati digeriti con RNasi T1 e risolti su un gel di poliacrilammide denaturante. Mod5 modifica il residuo previsto in presenza di DMAPP e indicato dal nucleotide shiftato 10, tripla adenosina contenente frammento in posizioni nucleoside da 36 a 38 contengono frammento nel tRNA tirosina. L'adenosina modificata 37 risiede è indicata con un asterisco.
Allo stesso modo, quando il tRNA di serina viene incubato con Mod5 e DMAPP, si osserva uno spostamento completo della tripla adenosina 10 nucleotidi contenente frammento in posizione nucleoside da 36 a 38. È interessante notare che si osserva uno spostamento parziale di un frammento di sette nucleotidi che non contiene la tripla adenosina contenente frammento in posizioni nucleoside da 36 a 38, suggerendo che la tripla adenosina contenente frammento in posizione nucleoside 36-38 sequenza e struttura potrebbe non essere richiesta per l'attività in vitro mod5. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiederà da due, quattro a sei ore giorni se viene eseguita correttamente.
Bene, tentando questa procedura è importante ricordare di mantenere e monitorare l'integrità dell'RNA, perché la degradazione dell'RNA potrebbe effettuare la modifica dell'RNA e confondere l'interpretazione dei dati. Seguendo questa procedura studi mutazionali utilizzando il tuo enzima di interesse, potrebbe essere fatto per determinare residui specifici o domini necessari per l'attività enzimatica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA, per dire attività tRNA-isopentenil transferasi di enzimi procariotici ed eucariotici.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il protocollo per il rilevamento dell'attività isopenteniltransferasi del tuo enzima di interesse. Non dimenticare che lavorare con la radioattività può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare DPI adeguati, utilizzare una schermatura adeguata e smaltire correttamente la radioattività dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
