Ci sono più di 100 distinte modifiche dell'RNA, due terzi delle quali sono metilazioni. Questo protocollo fornisce un metodo per un'analisi sensibile e accurata dell'attività dello scrittore di metilazione dell'RNA. Questa tecnica facile da usare ci consente di quantificare e visualizzare l'RNA metilato senza l'uso di anticorpi, che sono comunemente inclini agli artefatti.
A dimostrare la procedura sarà Samantha Shelton, una studentessa del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, impostare il saggio 100-microliter RNA metiltransferasi in un tubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio, come delineato nel protocollo di testo. Vortice il tubo per mescolare accuratamente e centrifugare a 200 volte g per cinque secondi per raccogliere la soluzione nella parte inferiore del tubo.
Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi, pulire la reazione utilizzando la purificazione delle colonne, come delineato nel protocollo di testo. Per eseguire il conteggio delle scintillazioni liquide, impostare il rack del conteggio delle scintillazioni con una fiala per campione, una fiala per una misurazione dello sfondo e una fiala per il test di scorrimento rapido.
Riempire le fiale con cinque millilitri di soluzione di conteggio scintillazione. Aggiungere 10 microlitri di ogni campione di RNA radioattivo eluito in una fiala. Stringere il coperchio e mescolare delicatamente.
Per preparare le fiale di prova di scorrimento rapido, strofinare accuratamente i tamponi di cotone su tutte le superfici e le attrezzature utilizzate durante la procedura. Aggiungere questi tamponi alle fiale riempite con soluzione di scintillazione e stringere il coperchio. Per eseguire i campioni sul contatore di scintillazione, aprire il cofano del contatore, inserire il rack nella macchina e chiudere il cofano.
Selezionare Conta rack singolo. Scegliere Seleziona programma utente. Selezionare o creare un programma che misura il trizio per 60 secondi e premere Count Rack.
Ripetere il conteggio delle scintillazioni tre volte. Successivamente, preparare e rominare un gel di poliacrilammide denaturante di urea, come delineato nel protocollo di testo. Trasferire 20 microlitri di materiale RNA radioattivo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri contenente 20 microlitri di tampone di carico del gel 2X.
Dopo aver preparato la scala, incubare i campioni a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Lavare ancora una volta i pozzi del gel immediatamente prima del caricamento del campione tubazionando il tampone dai serbatoi di gel nei pozzi del gel. Quindi, caricare 20 microlitri della scala preparata, 20 microlitri dei campioni e 20 microlitri di tampone di carico del gel 1X nelle corsie del gel.
Far funzionare il gel a 100 volt per 60-180 minuti, a seconda della percentuale di poliacrilammide. Una volta terminato il funzionamento del gel, rimuovere il gel dalla cassetta e posizionare in una scatola contenente 50 millilitri di tampone TBE 1X con cinque microlitri di macchia di gel acido nucleico ultrasensibile. Incubare su un rocker per cinque minuti per macchiare l'RNA.
Successivamente, eserti con cura il gel dalla scatola e posizionarlo sul transilluminatore UV del sistema di imaging in gel con i pozzi su e la scala a sinistra. Mettere a fuoco la fotocamera sul gel, accendere la luce UV e scattare un'immagine del gel. Quindi, disattivare l'esposizione ai raggi UV e salvare l'immagine come file TIFF.
Riposizionare il gel nella scatola, rimuovere il TBE e fissare il gel con 50 millilitri di soluzione di fissaggio su un rocker a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, spostare delicatamente il gel su una scatola nera fresca contenente 25 millilitri della soluzione di miglioramento dell'autorazione. Incubare sul rocker a temperatura ambiente per 30 minuti.
Sollevare delicatamente il gel e posizionarlo a faccia in giù su un foglio di plastica avvolgente con i pozzi alzati e la scala sul lato destro. Posizionare due fogli di carta cromatografica sul retro del gel e capovolgere l'intera pila. Prerimente riscaldare l'essiccatore a gel a 80 gradi Celsius.
Spostare indietro il coperchio di plastica sull'essiccatore a gel. Inserire l'intera pila sotto il coperchio di plastica e spostare di nuovo il coperchio di plastica verso il basso per creare una guarnizione. Asciugare il gel a 80 gradi Celsius per un'ora.
Quindi, spegnere l'essiccatore di gel e rimuovere delicatamente la pila. Rimuovere l'involucro e la seconda carta cromatografica. Nastro la carta cromatografica rimanente con il gel essiccato in una cassetta autoradiogramma.
In una stanza buia, aggiungi un foglio di pellicola autoratografica. Conservare la cassetta a -80 gradi Celsius e sviluppare il film al momento opportuno, a seconda dell'intensità del segnale. Una volta sviluppato il film, posizionarlo sopra la cassetta e utilizzare un marcatore da laboratorio per contrassegnare attentamente i quattro bordi del gel, ogni pozzo, e la posizione dei coloranti XC e BB.
Scansiona la pellicola con una risoluzione di 300 o 600 pixel per pollice e salva l'immagine come file TIFF. In questo studio, viene dimostrato un saggio privo di anticorpi per analizzare l'attività dell'RNA metiltransferasi. Una corsa tipica da una reazione di trascrizione in vitro con l'RNA polimerasi T7 del piccolo RNA nucleare 7SK mostra RNA relativamente breve e altamente strutturato.
Ci sono più bande indesiderate, sia più corte che più lunghe di 7SK, probabilmente risultanti da eventi casuali di iniziazione o terminazione trascrizionale. Per questo motivo, la purificazione del gel dopo la reazione di trascrizione in vitro è importante per ottenere un campione di RNA pulito. A questo punto, l'RNA di interesse può essere identificato dalla sua posizione rispetto alla scala e purificato dalla purificazione del gel.
Un saggio rappresentativo di RNA metiltransferasi utilizzando il limite inferiore delle concentrazioni raccomandate di RNA e proteine è mostrato qui. Questo saggio consente sia risultati quantitativi dal conteggio delle scintillazioni, sia risultati qualitativi dall'autoradiogramma. Qui, si dimostra che un RNA metiltransferasi noto per metilare 7SK è in grado di metilare U6. Inoltre, come mostrato di recente per 7SK, il legame dell'istone H4 al MePCE inibisce anche la metilazione U6.
Questo può essere osservato sia nel conteggio delle scintillazioni che nell'autoradiogramma, mostrando la robustezza di questo protocollo. L'RNA è suscettibile di degradazione, quindi assicurati di utilizzare reagenti senza RNasi e di pulire accuratamente tutte le superfici e le attrezzature. L'RNA etichettato radioattivamente ottenuto da questo saggio di metiltransferasi può essere usato direttamente per valutare l'attività della demetilasi dell'RNA o l'attività di legame dell'RNA per saggio di spostamento di mobilità elettroforetica, per esempio.
Questo metodo consente ai ricercatori di testare l'effetto di diversi fattori sull'attività dell'RNA metiltransferasi, comprese le mutazioni puntili e i trattamenti inibitori delle piccole molecole. Questo metodo utilizza materiale radioattivo, quindi assicurati di indossare i DPI appropriati e fai attenzione durante la manipolazione e lo smaltimento di materiali radioattivi.
