Ringraziamo il personale delle strutture centrali dell&#39;Istituto Francis Crick (Studio di Ricerca Biologica, In Vivo Imaging e Istopatologia Sperimentale) e Yolanda Saavedra-Torres e Mercedes Sanchez-Garzon, i veterinari di Crick e LRI rispettivamente per il loro prezioso aiuto. Siamo grati al Dr. W. Gray per aver letto in modo critico il manoscritto. DP è stato sostenuto da una borsa di ricerca non clinica dell&#39;EHA. Questo lavoro è stato sostenuto da The Francis Crick Institute, che riceve il suo fondamento fondamentale da Cancer Research UK (FC001045), dal Regno Unito Medical Research Council (FC001045) e dalla Welcome Trust (FC001045).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in base al PPL 70/8904, approvato dal Regno Unito Home Office e in conformità con le linee guida Cancer Research UK. L&#39;uso del sangue del cordone ombroso umano (UCB) e dei campioni primari di leucemia mieloide acuta umana (AML) è stato approvato dal Comitato Etico di East London dopo aver ricevuto il consenso ed è stato eseguito in conformità alla Dichiarazione di Helsinki. 1. Impianti biotecnologici a base di collagene con cellule ematopoietiche e stromali umane NOTA: L&#39;intero protocollo deve essere eseguito in condizioni sterili e con materiale sterile. Il mezzo di coltura cellulare 1 corrisponde al mezzo hMSC (MEM-α, P / S e 10% hMSC-FBS); Il mezzo di coltura cellulare 2 corrisponde al mezzo EC (M199, 20% FBS, P / S, 10mM HEPES, 50μg / mL eparina, 2mM glutammina e 50μg / mL ECGS) e il mezzo di coltura cellulare 3 corrisponde al mezzo cellulare ematopoietico (H5100 E P / S). <ol><li> Preparare il sangue del cordone ombelicale mCellule ononucleari (CB-MNCs) o primari AML (midollo osseo o MNCs periferici periferici) utilizzando un gradiente di densità Ficoll-Paque, secondo protocolli ben consolidati 53 . <ol><li> Per AML, esaurire le cellule T utilizzando l&#39;anticorpo OKT.3. Incubare 4 μg di OKT.3 per 1 x 10 6 AML MNCs per 30 minuti a temperatura ambiente prima di lavare le cellule in PBS. Se necessario, criopreservi i MNC in FBS con 10% DMSO a 2 x 10 8 cellule per ml. </li></ol></li><li> Preparare culture hMSC (coltura media 1) e EC (culture medium 2). Plate hMSC cellule (vedi tabella dei materiali ) su flasks di coltura di cellule regolari nel mezzo hMSC. Plate ECs (vedi tabella dei materiali ) sulle superfici rivestite con collagene 1 nella media CE. </li><li> Al 85-90% di confluenza cellulare rimuovere il mezzo, lavare due volte con PBS e aggiungere la soluzione di trysina-EDTA (20 μL per cm 2 ). <ol><li> Dopo 5 minuti, controllare che le celle siano staccate. Recuperare le celle diluendo 1:3 con mezzo di coltura cellulare. Centrifugare a 300 xg per 5 min e ri-sospendere nel medesimo corrispondente per ogni tipo di cellula e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer. </li><li> Utilizzare le cellule a 2 x 10 giugno - 10 luglio cellule per mL. Se entrambi i tipi di celle devono essere utilizzati insieme, mescolare le sospensioni hMSC e EC in un rapporto 1: 1. </li></ol></li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una siringa per insulina. </li><li> Utilizzando un bisturi, tagliare la scaffold iniziale (20 mm x 60 mm x 7 mm) della spugna sterilizzata di gelatina ( es. Gelfoam) in 24 pezzi di dimensioni simili (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, figura 1A e B ). </li><li> Ricostituire gli scaffolds di gelatina per immersione in PBS (5 min). </li><li> Uno per uno, mettere delicatamente i ponteggi su un tessuto sterile per rimuovere l&#39;eccesso di PBS. Trasferire le impalcature ad un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti (superficie ultra-bassa allegato) e usare la siringa per iniettare 50 ml contenenti 10 5 - 10 6 cellule (hMSC alUno o in combinazione con hEC; Figura 1C ). </li><li> Ripetere il passo 1.7 con ogni impalcatura fino a quando tutti i ponteggi richiesti vengono seminati con le cellule stromali. </li><li> Incubare per 1 h all&#39;interno di un incubatore di coltura cellulare (37 ° C e CO 2 5%). </li><li> Riempire ogni pozzetto con 3 ml di mezzo di coltura cellulare 1 ( figura 1D ) e restituire gli scaffolds ad un incubatore di colture di cellule (37 ° C e CO 2 5%) per l&#39;incubazione di notte. Utilizzare il mezzo di coltura delle cellule 2 se si usano gli ECs negli scaffolds. </li><li> Scongelare CB-MNC e isolare le loro cellule CD34 + seguendo un appropriato protocollo del kit di sezione CD34 + . Sospendere le celle CD34 + selezionate nel mezzo 3 e conteggiarle in una camera Neubauer. NOTA: Qui le cellule sono state utilizzate ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule per ml. <ol><li> Se si utilizzano campioni primari derivati ​​dal paziente AML, scongelare le cellule, diluirle 1:10 in FBS, centrifugarle per 5 min a 300xg, risospendere le cellule in PBS-2% FBS, aggiungere CD3 anticorpo anti-umano (di 2 - 4 g per 10 6 cellule), e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Centrifugare per 5 min a 300 xg e risospendere in mezzo di cellule ematopoietiche integrato con citochine (20 ng / mL fattore stimolante della colonia granulocitaria (G-CSF), 20 ng / mL IL-3 e 20 ng / mL trombopoietina (TPO) . </li></ol></li><li> Ripetere i punti 1.7 - 1.9, ma in questo caso sementi 1 x 10 5 cellule ematopoietiche umane invece di componenti stromali, come sopra. <ol><li> Riempire il pozzetto con 3 ml di terreno di coltura 3 ( figura 1D ) e restituire gli scaffolds ad un incubatore di coltura di cellule (37 ° C e CO 2 5%) per incubazione per overnight. Utilizzare un mescolamento 1: 1 di supporti di coltura delle cellule 2 e 3 Se ECs sono utilizzati negli scaffolds. </li></ol></li><li> Solo per i basamenti portanti morfogenetici delle proteine-2 (rhBMP-2) dell&#39;osso umano ricombinante, mettiamo delicatamente gli scaffali uno per uno su un tessuto sterile per rimuovere l&#39;eccesso di PBS. Trasferire i ponteggi a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ( figura 1E ) e aggiungere 5 μl di rhBMP-2, coprendo accuratamente l&#39;impalcatura. <ol><li> Aggiungere 20 μl di trombina seguita da 20 μL di fibrinogeno, coprendo accuratamente l&#39;impalcatura ogni volta ( Figura 1F ). Ripetere la procedura per ogni impalcatura fino a quando tutti i pontili richiesti vengono trattati e quindi incubare per 5-10 minuti a 37 ° C. Controllare se la coagulazione è stata formata correttamente. </li></ol></li></ol> 2. Impianto chirurgico di impalcature biotecnologiche NOTA: Qui sono stati utilizzati sia maschi che femmine, topi NSG da 6 a 12 settimane. Poiché gli animali sono immunodeficienti, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. Le fasi 2.10 - 2.13 sono correlate alle strategie di sopravvivenza e alle cure post-chirurgiche. <ol><li> 60 - 120 minuti prima della chirurgia, somministrare sottocutanea il farmaco del dolore (carprofen, 5 mg / kg di peso corporeo / mouse).</li><li> Indurre l&#39;anestesia in una camera con 0,5% isoflurano e 2 L / min O 2 . I topi dovrebbero essere monitorati continuamente durante la procedura. Trasferisci l&#39;animale all&#39;area chirurgica in posizione predestinata per avere un accesso facile alla schiena. Conservare l&#39;animale sotto anestesia utilizzando un cono a naso che fornisce 1,5% isoflurano e 2 L / min O 2 . Tenere il mouse sotto anestesia durante la procedura chirurgica e controllare frequentemente lo stato animale. </li><li> Mentre è sotto anestesia, utilizzare un gel oftalmico sugli occhi del topo per prevenire la secchezza e mantenere il topo a 37 ° C. </li><li> Rasare l&#39;area chirurgica sul retro del mouse usando un trimmer elettrico. Per sterilizzare la pelle, immergere una punta di cotone in clorexidina diluita (diluito 1:10 in PBS) e utilizzare questa punta per pulire la superficie della pelle. Ripetere due volte questa procedura. </li><li> Utilizzando pinze sterili e bisturi (o forbici), eseguire una incisione anteriore-posteriore da 0,5 a 0,7 cm dalla pelle. Utilizzare la pinza inseritaSotto il tessuto sottocutaneo per fare una tasca. </li><li> Inserire il ponteggio sottocutanea, assicurandosi che sia posizionato all&#39;interno della tasca ( Figura 1G e H ). Chiudere l&#39;incisione con colla chirurgica ( Figura 1I e J ). </li><li> Per il trattamento del dolore post-chirurgico, somministrare sottocutanea buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo). </li><li> Durante il recupero, posizionare l&#39;animale al suo fianco in una gabbia pre-riscaldata e monitorare il recupero fino al comportamento normale. </li><li> Diluire il farmaco del dolore in acqua (carprofen, 0,1 mg / ml d&#39;acqua) e fornire agli animali come acqua potabile per 4 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Controllare frequentemente l&#39;animale e la ferita durante il periodo post-operatorio a 48 ore per eventuali effetti negativi. </li></ol> 3. Trattamenti del mouse, eutanasia e recupero di campioni per l&#39;imaging NOTA: L&#39;analisi degli scaffold è eseguita tra8 e 24 settimane dopo l&#39;impianto. <ol><li> 60 minuti prima dell&#39;immagine, mantenere il topo implantato caldo in una scatola di riscaldamento a 37 ° C e somministrare per via intramuscolare 100 μL di immunoglobulina umana per bloccare siti non specificati. </li><li> 30 minuti prima dell&#39;immagine, somministrare per via endovenosa 10 μg (per mouse) di anticorpi specifici per etichettare le cellule di interesse. </li><li> 5 minuti prima dell&#39;immagine, somministrare per via endovenosa 15 μL (diluito in 100 μl di PBS) di 655-nm fluoroforo-etichettato, agente di pooling del vascello (655-VPA) per visualizzare strutture vascolari. </li><li> Eutanizzare il mouse attraverso la dislocazione cervicale. </li><li> Utilizzando forbici affilate, eseguire un&#39;incisione della pelle longitudinale sulla parte posteriore del mouse, vicino al sito di impianto originale. </li><li> Con l&#39;aiuto di pinzette e forbici, separare la pelle dalla tasca sottocutanea dove è stato impiantato il ponteggio. </li><li> Tenere il ponteggio con le pinzette e estrarlo delicatamente dalla pelle tagliando la membrana residua aTessuto che circonda lo scaffale con forbici. Vedere gli esempi di scaffold da recuperare in Figura 2 . </li><li> Fissare il ponteggio con colla adesiva ad azione rapida a una piastra di imaging (un piatto da 35 mm x 10 mm Petri) e riempire con soluzione salina (PBS) a temperatura ambiente. </li><li> Per i ponteggi BMP, prima di riempire la piastra con PBS, utilizzare un microdrillo chirurgico per sottile la superficie ossea sotto un microscopio microchirurgico; Questo consente la visualizzazione di fluoroforo e la cattura di immagini ad alta risoluzione. Utilizzare le bave da 1,2 o 1,6 mm, a seconda della dimensione dello scaffold. NOTA: L&#39;utente si renderà conto di quanto si deve eseguire in funzione dello spessore dell&#39;osso. In generale, poiché i basamenti BMP sono vascolarizzati, l&#39;osso cambia leggermente il colore e diventa più rosso quando si avvicina allo spessore corretto per l&#39;imaging. </li><li> Inserire la piastra sullo stadio del microscopio confocale. </li></ol> 4. Live-Imaging utilizzando microscopio a due fotoniopy NOTA: quando si utilizzano rivelatori non descritti (NDD), utilizzare sempre il cursore NDD per l&#39;imaging per dirigere la fluorescenza all&#39;IDD. La configurazione del microscopio è fornita in Figura 3 . <ol><li> Accendere il microscopio e il computer, avviare il software facendo clic su &quot;Avvia sistema&quot; e passare alla modalità &quot;Acquisizione&quot;. </li><li> Seleziona la casella &quot;Mostra strumenti manuali&quot;. Nel menu &quot;Laser&quot; passare &quot;acceso&quot; il laser a due fotoni e lasciarlo riscaldarsi e stabilizzarlo. </li><li> Nel menu &quot;Imaging Setup&quot;, attivare contemporaneamente &quot;Channel Mode&quot; e &quot;Switch track every Frame&quot;. Nel menu &quot;Percorso leggero&quot;, selezionare &quot;Non disciolto&quot; &quot;e&quot; Allineatore principale principale MBS 760+ &quot;. Selezionare per attivare i quattro NDD e impostare la configurazione come illustrato in Figura 3 . NOTA: con questa configurazione, il segnale di collagene dalle strutture ossee (secOnd generazione armonica, SHG) viene raccolta a 380 - 485 nm, cellule endoteliali umane FITC-hCD31 + e cellule ematopoietiche umane AF488-hCD45 + a 500-550 nm e 655-VPA a 640-690 nm. </li><li> Nel menu &quot;Canali&quot;, impostare la &quot;lunghezza d&#39;onda laser&quot; a 890 nm e la potenza al 50%. Impostare &quot;Gain (Master)&quot; a 500-600, &quot;Offset digitale&quot; a 0 e &quot;Gain digitale&quot; a 15 per ogni canale. Regolare questi valori una volta che l&#39;acquisizione è iniziata. </li><li> In modalità &quot;Acquisizione&quot;, impostare i parametri necessari per ottenere immagini ad alta risoluzione senza danneggiare il tessuto e sbiancare i fluorofori. Impostare &quot;Modalità di scansione&quot; su &quot;Frame&quot;, &quot;Frame Size&quot; a &quot;x512 y512,&quot; Line Step &quot;a 1,&quot; Velocità &quot;a 9,&quot; Numero di media &quot;a 8,&quot; Profondità del bit &quot; Modo &quot;a&quot; linea &quot;,&quot; Direzione &quot;a&quot; bidirezionale &quot;e&quot; Metodo &quot;per&quot; significare &quot;. <ol><li> Impostare &quot;Zo&quot;Om &quot;a 1 per la scansione iniziale dell&#39;immagine e aumentare se necessario per concentrarsi su particolari aree. </li></ol></li><li> Posizionare la lastra contenente l&#39;impalcatura sullo stadio del microscopio sotto l&#39;obiettivo di immersione ad acqua di 20X e 1,0 NA e abbassare l&#39;obiettivo fino a toccare la soluzione salina. Impostare l&#39;obiettivo dell&#39;obiettivo sullo scaffold utilizzando gli oculari del microscopio, utilizzando una lampada come sorgente luminosa. </li><li> Attivare il menu &quot;Z-stack&quot;, selezionare la funzione &quot;First / Last&quot; e impostare l&#39;intervallo desiderato tra due fette sub-sequenziali ( ad esempio, Z-stack da 2 μm). Tenere gli intervalli costanti all&#39;interno dello stack Z. </li><li> Selezionare &quot;Live&quot; per acquisire una scansione dal vivo del campione e regolare &quot;Digital Gain&quot; e &quot;Offset digitale&quot; per un&#39;esposizione ottimale. Per visualizzare contemporaneamente più canali, seleziona la funzione &quot;Split&quot;. </li><li> Nel menu &quot;Stage&quot;, mentre in modalità &quot;Live&quot;, scansionate l&#39;immagine e le regioni &quot;Mark&quot; di interEst (ROI), come la localizzazione delle cellule ematopoietiche umane e delle strutture vascolari. Quando la scansione del campione è completa, passare al primo ROI per avviare l&#39;imaging. </li><li> In modalità &quot;Live&quot;, impostare la parte superiore e inferiore dello stack Z in 3D che circonda l&#39;area di interesse utilizzando le funzioni &quot;Impostare prima&quot; e &quot;Impostare ultimo&quot;. Una volta terminata, impostare il centro, &quot;C.&quot; Avviare l&#39;acquisizione del ROI con il pulsante &quot;start experiment&quot;. Vedere esempi di immagini in Figura 4 , Figura 5 e Figura 6 . </li><li> Una volta che l&#39;acquisizione è completa, salvare l&#39;immagine nella cartella designata. Passare al ROI successivo e ripetere il passaggio 4.10. Una volta completato l&#39;esperimento, rimuovere la piastra di imaging dal microscopio, staccare attentamente il campione dalla piastra e pulire qualsiasi colla residua. </li><li> Preparare il campione per la tecnica di analisi successiva. </li></ol> 5. Processin del campioneG per Istologia e Immunostaining NOTA: i campioni vengono elaborati secondo il protocollo descritto nelle tecniche di laboratorio generali di JoVE 54 che descrivono i processi di fissazione, incorporazione e sezionamento dei campioni. I campioni di formazione delle ossa devono essere trattati per 7 giorni in un agente decalcificante basato su EDTA tra i processi di fissazione e di incorporazione. La soluzione di bloccaggio / permeabilizzazione è di 10 mM PBS pH 7,4 tampone con 1% Triton X-100, 1% albumina bovina serba (BSA) e 10% normale siero di capra (NGS). <ol><li> Mettere le fette in xilene per 10 min.), Xilene per 5 minuti, etanolo al 100% per 5 minuti, etanolo al 70% per 5 minuti, etanolo al 50% per 5 minuti e H 2 O per 5 minuti. </li><li> Trasferire le fette in una soluzione di lavoro antigene a base di citrato. </li><li> Fare bollire le fette per 15 minuti e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le fette in soluzione 10 mM di PBS pH 7.4 con 1% di Triton X-100 (5 min, 3 volte). </li><li> Trasferisci il samScorrere alla soluzione di bloccaggio / permeabilizzazione e incubare per 30 min. </li><li> Aggiungere anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco / permeabilizzazione e incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare le fette in soluzione 10 mM di PBS pH 7.4 con 1% di Triton X-100 (5 min, 3 volte). </li><li> Aggiungere un anticorpo secondario diluito nella soluzione di blocco / permeabilizzazione per 1 h al buio a temperatura ambiente. </li><li> Lavare con H 2 O (5 min, 3 volte). </li><li> Per ridurre la fluorescenza di fondo, immergere le fette nella soluzione di lavoro nero Sudan per 10 minuti, al buio e a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le fette in H 2 O (5 min, 3 volte). </li><li> Montare le fette usando un mezzo di montaggio fluorescente con DAPI (0,5 μg / mL). </li><li> Conservare le fette a 4 ° C e verificare che il supporto di montaggio sia asciutto prima di condurre immagini a fluorescenza. Vedere immagini di esempio nella Figura 7 . </li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

<html> Significato nel rispetto dei metodi esistenti: In questo protocollo abbiamo descritto un metodo per generare diversi microambienti umanizzati nei topi e per visualizzare la loro architettura mediante microscopia e istologia a due fotoni. I dati rappresentativi forniti mostrano la fattibilità dell&#39;approccio, utilizzando diverse cellule stromali per ingegnare tessuti umanizzati. Il protocollo ha applicazioni specifiche per lo studio delle cellule ematopoietiche umane e delle cellule derivate da nicchie di midollo osseo in condizioni normali e patologiche. Queste applicazioni includono lo studio dell&#39;evoluzione clonale, la screening di farmaci e la stretta interazione tra HSC umani e componenti stromali. Nel campo emergente dell&#39;ingegneria tissutale sono stati proposti diversi approcci alternativi. Approcci di nota includono lo sviluppo di strutture BM umanizzate 3D in vitro 55 , 56 , 57 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 e l&#39;innesto ortotopico di scaffold BM humanizzati nei topi 64 . Il nostro approccio ha il vantaggio di combinare sia la complessità del sistema in vivo con l&#39;agevole accessibilità anatomica del graft di tessuti umani. Modifiche e risoluzione dei problemi: Una fonte di variabilità in questo protocollo può essere trovata nella selezione delle cellule utilizzate per seminare gli scaffolds. Nel nostro lavoro abbiamo utilizzato hMSC derivanti da BM. Tuttavia, le cellule mesenchimali possono essere ottenute da diversi tessuti, che possono mostrare proprietà distintive a seconda dell&#39;origine. Pertanto, può essere considerato l&#39;uso di hMSC derivato da diversi organi. Tuttavia, la loro capacità di formare tessuto osseo in vivo deve essere testata prima dell&#39;uso in questo pQuesto protocollo utilizza una fonte di cellule endoteliali umane commercialmente disponibili ( ovvero HUVEC E4ORF1-transduced). Recentemente, l&#39;uso di cellule endoteliali specifiche per organi per scopi diversi è stato riportato 65 , 66 . Inoltre, l&#39;utilizzo di HEC primari derivati ​​dalla BM potrebbe rappresentare un interessante miglioramento del protocollo. Pertanto, l&#39;uso di differenti fonti di cellule endoteliali può produrre diversi risultati in vivo . Abbiamo utilizzato topi riceventi immunocompromessi NSG per favorire l&#39;impianto di scaffoldi umanizzati e per evitare il rigetto dei tessuti. Non escludiamo la possibilità di utilizzare questo protocollo per ingegnare tessuti di midollo osseo ectopici in altri ceppi del mouse. Infatti, rhBMP-2 può indurre la formazione di ossa in diversi modelli mammiferi 47 , 48 , 49 , 50 <sup&gt;, 52 . Tuttavia, le differenze nella vitalità cellulare e nel trapianto a lungo termine saranno probabilmente osservate usando differenti ceppi / modelli. La tempistica del recupero dello scaffale può anche essere flessibile, a seconda dello scopo finale dell&#39;esperimento. Nel protocollo presentato, recuperiamo i campioni a 8 - 12 settimane dopo l&#39;impianto per valutare l&#39;assunzione ematopoietica a lungo termine. Per studiare i primi passi della formazione nicana del BM umano ( ad es., Formazione di tessuto osteocondrale 47 o sviluppo vascolare) possono essere scelti diversi punti temporali. La tecnica live-imaging descritta in questo protocollo è indicata per l&#39;imaging a breve termine di esplanti. L&#39;uso di una camera equilibrata per mantenere la temperatura fisiologica, la tensione dell&#39;ossigeno e la concentrazione di CO 2 dovrebbero essere considerati nei casi di imaging a lungo termine, come per studiare i comportamenti della motilità. Critical StEps nel protocollo: Tra le sfide legate al protocollo, mettiamo in evidenza le competenze tecniche necessarie per alcuni passaggi. Le cellule mesenchimali e endoteliali dovrebbero essere utilizzate a numeri di passaggio bassi; In caso contrario, non saranno in grado di sostenere in vivo l&#39; assunzione di cellule ematopoietiche umane o di partecipare alla de novo vascolarizzazione e alla formazione dell&#39;osso in vivo . Raccomandiamo l&#39;utilizzo di hMSC e HECs nei passaggi da 1 a 5. La preparazione dello scaffale e le fasi di coltivazione delle cellule necessitano di conoscenze fondamentali sulla cultura cellulare e sulla conoscenza delle proprietà delle celle specifiche utilizzate nella procedura. Il protocollo chirurgico è abbastanza semplice ma richiede una certa pratica. La manutenzione di un ambiente asettico per evitare la contaminazione degli scaffold impiantati in topi immunodeficienti è fondamentale per garantire il successo dell&#39;esperimento. L&#39;esplante del campione e l&#39;imaging in diretta richiedono la pratica chirurgica (specialmente per l&#39;uso del microdrillo) e la conoscenza dellaMicroscopio. Infine, l&#39;elaborazione del campione e l&#39;istologia richiedono conoscenze di base delle tecniche da utilizzare. Limitazioni della tecnica: L&#39;approccio descritto permette di visualizzare le cellule ematopoietiche umane vive che seminano un microambiente di midollo osseo umanizzato, con cellule endoteliali umane che creano strutture vascolari e cellule mesenchimali che creano spazio osseo / midollo osseo. Poiché il tessuto è formato in vivo , l&#39;impalcatura finale progettata sarà ancora chimerica (umana e murina). Questo problema dovrebbe essere preso in considerazione, in quanto il tessuto chimico non può completamente imitare la complessità e l&#39;ambiente del midollo osseo umano. I ponteggi impiantati hanno una dimensione limitata (abbiamo provato un massimo di 6,6 x 7,5 x 7 mm) e quindi sono in grado di ospitare un numero limitato di cellule per xenotrapianto. Il numero assoluto di celle recuperate sarà anche limitato; Quindi, il numero di impalcature impiantate dovrebbeEssere calcolato in funzione del numero di celle richieste per l&#39;esperimento. L&#39;applicazione di imaging descritta è particolarmente utile per osservare grandi aree di tessuto vivo a profondità di 150-200 μm dalla superficie senza interrompere l&#39;architettura e danneggiare le cellule. Pertanto, non consente la visualizzazione di tutta l&#39;impalcatura. Se è necessaria una completa scansione del tessuto, approcci standard di immunofluorescenza sarebbero più appropriati. Applicazioni future: La direzione futura di questo modello bioengineered sarebbe aumentare la complessità delle componenti umane nel tessuto. Le conoscenze e la caratterizzazione della nicchia umana del BM sono state avanzate negli ultimi anni 67 e il protocollo descritto potrebbe essere una piattaforma interessante per studiare la funzione di questi nuovi componenti cellulari e fattori solubili, nonché il loro ruolo nel sostegno di normali / maligniAnt HSCs. Inoltre, la tecnica di imaging fornisce il potenziale per l&#39;imaging intravitale degli scaffold in studi longitudinali, che richiederebbero miglioramenti tecnici nell&#39;immagazzinamento dei ponteggi in topi vivi, anestetizzati, con recupero post-chirurgico. Questo approccio richiederebbe ulteriori passi ed è attualmente sotto inchiesta in laboratorio.

Le decisioni delle cellule di fato osservate nei compartimenti delle cellule staminali sono strettamente regolate da fattori intrinseci ed estrinseci. In particolare, è ora ampiamente riconosciuto che il microambiente BM svolge un ruolo fondamentale nel controllare l&#39;interruttore in HSC da una quiescenza ad uno stato attivo, così come nel loro processo di auto-rinnovo o di differenziazione della destanza 1 . Inoltre, recenti risultati mostrano che malignità ematologiche influenzano la funzione del microambiente BM, indicando l&#39;esistenza di una crosta attiva tra i due compartimenti 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Nonostante i recenti progressi, rimangono molte domande chiave su come l&#39;attività di specifici componenti BM-niche contribuisca al comportamento HSC e alla trasformazione maligna. Il microambiente di BM è altamente eterogeneo<html> Miscela enea e complessa di molti tipi di cellule differenti, ciascuna con funzioni specializzate. L&#39;abbondante componente endoteliale (EC) e vascolare regola il fatturato dei nutrienti e dei metaboliti, l&#39;ingresso e l&#39;uscita di diverse cellule da e verso BM e diverse funzioni HSC 7 , 8 . Le cellule stromali mesenchimali (MSC), una popolazione eterogenea di cellule staminali indifferenziate e progenitori impegnati attraverso tre differenti linee (ad es. Osteogeniche, condrogeniche, adipogeniche), sono un&#39;altra componente fondamentale della nicchia BM. Questi MSC localizzano sia nelle aree centrali della BM che in prossimità della regione endosteale. Essi possono essere associati a strutture vascolari e sono implicati nella regolazione della funzione HSC 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,&quot;&gt; 14 , 15 . Molte testimonianze suggeriscono che i HSC risiedono in vari siti definiti all&#39;interno del midollo e che la loro funzione potrebbe dipendere dalla loro precisa localizzazione. La maggior parte delle conoscenze attuali riguardanti le HSC e la loro interazione con il microambiente BM deriva da studi murini 1 . L&#39;uso di modelli xenograft ha esteso questa conoscenza a HSCs normali e maligni umani, inserendo nel BM murino di topi immunodeficienti 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Anche se questo rappresenta un modello valido, presenta ancora molte sfide, come la necessità di condizionare il mouse destinatario nella maggior parte dei casi per consentire l&#39;individuazione e l&#39;inserimento di HSC umano o la barriera tra specie e la sua influenza poco capita sulle interazioni delle cellule cellulari e funzioni. L&#39;uso di anticorpi neutralizzanti e topi geneticamente modificati, insieme a xenotrapianto, è stato strumentale per evidenziare la complessa dialogo che i HSC umani stabiliscono con i loro microambienti. L&#39;introduzione e lo sviluppo della microscopia confocale intravitale a due fotoni ha spostato questi studi un passo in avanti, consentendo l&#39;imaging diretto, ad alta risoluzione e dinamica del midollo osseo 19 , 20 , 21 , 22 e fornisce un potente strumento per la funzionalità Caratterizzazione del microambiente BM e il suo ruolo nella regolazione della funzione HSC. Al fine di aggirare alcuni dei problemi che emergono nei modelli classici di xenotrapianto, è stato messo in evidenza il concetto di ingegneria di una struttura BM umanizzata. La fusione di biomateriali e concetti di impianto cellulare, i rapporti hanno dimostrato la fattibilità di imitare l&#39;osso umano mArrow microambiente nelle regioni eterotopiche 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Questo apre la possibilità di utilizzare la bioingegneria nei modelli del mouse per studiare l&#39;ematopoiesi umana normale e maligna 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenesis e metastasi 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Sulla base di precedenti esperienze in ingegneria dei tessuti ossei e in vivo 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , descriviamo un protocollo per i bio-ingegneri e gli organotipi umani del tessuto umano. Queste strutture sono originarie dell&#39;impianto di cellule stromali derivate da umani BM in basi a collagene innestate sottocutanea in topi immunodeficienti. In una precedente relazione abbiamo dimostrato che i MSC umani assicurano la formazione di un microambiente umano adeguato per l&#39;assunzione di cellule ematopoietiche umane 45 . Inoltre, qui descriviamo come il coimpianto di altri componenti cellulari umani BMCome le cellule endoteliali umane (hEC) e / o le citochine importanti per la formazione dell&#39;osso ( es., HBMP2), collaborano con gli hMSC per generare differenti microambienti umani, che possono essere immaginati in situ in situ .

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	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:277px;">Ge Healthcare</td>
			<td style="width:229px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cd34 positive selection Kit</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18056</td>
			<td style="width:480px;">Store a 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Magnet</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3</td>
			<td style="width:277px;">Bioxcell</td>
			<td style="width:229px;">BE0001-2</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Used for T cell depletion in primary AML samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)</td>
			<td style="width:277px;">PeproTech</td>
			<td style="width:229px;">200-03, 300-23 and 300-18</td>
			<td style="width:480px;">For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100&#956;L of water and mix them. Add 200&#956;L, do alicuots of 45&#956;L and Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">DMSO</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D4540</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:392px;">FBS</td>
			<td style="width:277px;">Life technologies</td>
			<td style="width:229px;">10270106</td>
			<td style="width:480px;">Heat-inactivate at 56&#176;C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">MEM-&#945;</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">32571-028</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Myelocult H5100</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">5100</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">199</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">41150-020</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">hMSC-FBS, Heat-inactivated</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">12662-029</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">P/S</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">P0781</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ECGS</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">02-102</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:392px;">HEPES</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">S1558-50ML</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Heparin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">H3149</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Glutamine</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">25030</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Collagen 1 coated cell culture plate</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">354505</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">25200056</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:392px;">hMSC</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:229px;">PT-2501</td>
			<td style="width:480px;">Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">VeraVec HUVEC endothelial cells</td>
			<td style="width:277px;">Angiocrine bioscience</td>
			<td style="width:229px;">hVera101</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:392px;">Human hematopoietic cells</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:392px;">Gelfoam, Size 12-7mm</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">00009-0315-08</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">PBS</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">10010023</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical material</td>
			<td style="width:277px;">Multiple</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Sterile tissues</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Heat-sterilize paper tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">1 ml Syringe with needle of 25G</td>
			<td style="width:277px;">Terumo</td>
			<td style="width:229px;">SS+01H25161</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td style="width:277px;">Corning</td>
			<td style="width:229px;">3473 or 3471</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">BMP2</td>
			<td style="width:277px;">Noricum</td>
			<td style="width:229px;">rhBMP-2</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Thrombin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">T9010</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:392px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">F3879</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353001</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">U-Botton 96 well plate</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353077</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NSG mice</td>
			<td style="width:277px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:229px;">5557</td>
			<td style="width:480px;">NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:277px;">G9</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Dilute 1:10 before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Carprofen</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">Rimadyl</td>
			<td style="width:480px;">5 mg/g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:277px;">Alstoe</td>
			<td style="width:229px;">Vetergesic</td>
			<td style="width:480px;">0.1 mg/g of mouse body weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:277px;">Abbott</td>
			<td style="width:229px;">B506</td>
			<td style="width:480px;">Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trimmer</td>
			<td style="width:277px;">Wella</td>
			<td style="width:229px;">Contura HS61</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical glue</td>
			<td style="width:277px;">3M</td>
			<td style="width:229px;">Vetbond</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">carbomer (polyacrylic acid)&#160; as Ophthalmic gel</td>
			<td style="width:277px;">Novartis</td>
			<td style="width:229px;">Viscotears Liquid Gel</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">Human Normal Immunoglobulin</td>
			<td style="width:277px;">Gammaplex</td>
			<td style="width:229px;">10g vial</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NT-QTracker</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">Q21021MP</td>
			<td style="width:480px;">Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">AF488-hCD45</td>
			<td style="width:277px;">Biolegend</td>
			<td style="width:229px;">304017</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">FITC-hCD31</td>
			<td style="width:277px;">BD Pharmigen</td>
			<td style="width:229px;">555445</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Super glue</td>
			<td style="width:277px;">Loctite&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Super Glue</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Micro-Drill Kit</td>
			<td style="width:277px;">IDEAL - Fisher Scientific</td>
			<td style="width:229px;">NC9010016</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsurgical microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">No specific brand/company is adviced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:277px;">Zeiss</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">MaiTai &#8220;High Performance&#8221; fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation</td>
			<td style="width:277px;">&#160;Spectra-Physics</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">HT501128</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ethanol</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">32294</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Osteosoft</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">1.01728.1000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Polysine slices</td>
			<td style="width:277px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:229px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Antigen unmasking solution</td>
			<td style="width:277px;">Vector</td>
			<td style="width:229px;">H-3300</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Triton 100x</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">T9284</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">A96470</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Normal Goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">G9023</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Endomucin Antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-65495</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hVimentin antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-6260</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD31 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0823</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD45 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0701</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ADRP (Perilipin2)</td>
			<td style="width:277px;">antibodies-online</td>
			<td style="width:229px;">ABIN283918</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:392px;">Goat anti mouse secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11029 or A11005</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:392px;">Goat anti Rabbit secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11037 or A11008</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Goat anti Rat secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11007 or A21247</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Sudan Black</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">S2380</td>
			<td style="width:480px;">Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">DAPI</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D8417</td>
			<td style="width:480px;">Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Fluorescent mounting media</td>
			<td style="width:277px;">Dako</td>
			<td style="width:229px;">S3023</td>
			<td style="width:480px;">Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cover glass</td>
			<td style="width:277px;">VWR</td>
			<td style="width:229px;">631-0147</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging

Le cellule staminali ematopoietiche umane (HSCs) si trovano nella nicchia del midollo osseo (BM), una complessa rete multifattoriale di componenti che producono citochine, fattori di crescita e matrice extracellulare. La capacità di HSCs di rimanere in silenzio, di rinnovarsi o di differenziarsi e di acquisire mutazioni e di diventare maligne dipende dalle complesse interazioni che stabiliscono con diversi componenti stromali. Per osservare la crosstalk tra HSC umani e la nicchia umana BM in condizioni fisiologiche e patologiche, abbiamo progettato un protocollo per modellare e rappresentare in modo ectopicamente una nicchia BM humanizzata in topi immunodeficienti. Mostriamo che l&#39;impiego di diversi componenti cellulari consente la formazione di strutture umanizzate e l&#39;opportunità di sostenere l&#39;impegno a lungo termine dell&#39;immaginazione ematopoietica umana. Utilizzando la microscopia a due fotoni, possiamo visualizzare queste strutture in situ alla risoluzione delle singole cellule, fornendo un potente strumento nuovo per la caratterizzazione funzionale del BM umanoMicroambiente e il suo ruolo nella regolazione dell&#39;ematopoiesi normale e maligna.

Nella figura 1 sono mostrate immagini rappresentative dei processi di semilavorazione e di impianto di scaffold. Nella figura 1C , notare che le cellule vengono iniettate direttamente nel ponteggio. Nella figura 1G , notare che un&#39;incisione è fatta nella parte posteriore del mouse, dove viene creata la tasca sottocutanea e viene impianto il ponteggio. La figura 2 mostra la morfologia lorda di diversi pontili impiantati in topi NSG e recuperati dopo 8 settimane. Si noti la leggera vascolarizzazione negli scaffold semplificati hMSC ( Figura 2A ). La co-radiante di ECs umane con gli hMSC nello scaffold consente la formazione di vasculature più rilevanti negli scaffolds ( Figura 2B ). Infine, la presenza di rhBMP-2 induce la formazione di ossa. Gli scaffoldi recuperati sono più grandi in questo caso e sono costituiti daTessuto duro, simile all&#39;osso. La Figura 3 mostra l&#39;impostazione della configurazione del canale sul microscopio per l&#39;imaging in tempo reale con NDD (dettagli nella leggenda della figura). La Figura 4 e il Video 1 mostrano le cellule ematopoietiche umane in strutture impregnate con hMSC. Gli scaffali sono stati esplorati 8 settimane dopo l&#39;impianto e dopo l&#39;inoculazione endovenosa di AF488-hCD45 e 655-VPA. Questa procedura consente la visualizzazione di cellule ematopoietiche umane impiantate e la struttura vascolare mediante microscopia confocale a due fotoni. In questo caso, le immagini mostrano vasi sanguigni (655-VPA) negli scaffolds e l&#39;impegno a lungo termine di cellule ematopoietiche umane (AF488-hCD45) nel parenchima del ponteggio. La Figura 5 e il Video 2 corrispondono a impalcature umane seminate con hECs e hMSCs. 8 settimane dopo l&#39;intervento chirurgico, le scaffolds sono state esplorate dopo l&#39;intravenoInoculazione dell&#39;anticorpo FITC-hCD31 e 655-VPA, e le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a due fotoni, come detto in precedenza. Le immagini mostrano la partecipazione di hECs alla formazione di navi nella scaffold, con conseguente vascolarizzazione chimerica murino-umana. La figura 6A mostra i dati rappresentativi dell&#39;approccio utilizzato per stimolare la formazione dell&#39;osso negli scaffali MSC. Simile alle figure precedenti, 8 settimane dopo l&#39;impianto, è stata eseguita l&#39;inoculazione endovenosa di 655-VPA, sono stati recuperati scaffold e le immagini sono state acquisite con microscopia confocale a due fotoni. Gli scaffoldi stimolati da rhBMP-2 inducono la formazione di tessuti ossee che possono essere visualizzati a causa dello SHG (colore ciano nelle immagini) fornito dal calcio nell&#39;osso. Le immagini fornite mostrano anche la formazione di cavità e tessuto endosteo vascolarizzato, che assomigliano molto al tessuto endosteo BM. Nella figura 6B </sTrong&gt; e Video 3 , hECs sono stati co-impiantati con hMSCs. I ponteggi sono stati recuperati dopo l&#39;inoculazione endovenosa dell&#39;anticorpo FITC-hCD31 e 655-VPA e le immagini microscopiche confocalizzate a due fotoni mostrano la partecipazione di hECs alla neovascolarizzazione in un basamento formando osso. La Figura 7 mostra immagini rappresentative dell&#39;istologia, una procedura eseguita per corroborare i risultati precedentemente descritti. Le immagini immunofluorescenti mostrano vascolarizzazione del topo, hECs, hMSCs e cellule ematopoietiche umane tracciate a lungo termine nelle strutture dello scaffold. Gli scaffali recuperati dai topi sono stati fissati e utilizzati per l&#39;immunofluorescenza. Nelle rastrelliere che formano ossa di rhBMP-2 ( figura 7D- F ), nota la morfologia del tessuto, somigliante al midollo osseo maturo con il tessuto adiposo. In questo scaffold che forma osso, mostriamo che hMSCs sono fibroblasti, che indicerebbero tCappello contribuiscono al tessuto appena formato come cellule stromali. Mostriamo anche l&#39;espressione di marcatore adipocitario umano, che indica che hMSC contribuiscono anche alla formazione del tessuto adiposo. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" /> Figura 1. Immagini rappresentative dei processi di semina e di impianto. A) Struttura iniziale e il suo metodo di taglio con un bisturi. B) 24 pezzi ottenuti dallo scaffold iniziale. C) Metodo di coltivazione di celle di sasso utilizzando una siringa. D) Telai a base di cellule con supporto di coltura pronto per essere impiantato. EF) Fasi specifiche per i pontili per formare ossa: E) il ponteggio viene trasferito su una piastra a 96 pozzetti, in U e F) immagine rappresentativa del metodo utilizzato per aggiungere rhBMP2, trombina e fibrinogeno allo scaffold. GJ) Surgi<html> G) ferita creata nell&#39;impianto di pelle e impalcatura, H) metodo di impianto e IJ) procedura di chiusura della ferita con colla chirurgica. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" /> Figura 2. Scaffolds diversi prelevati dai topi. Immagini rappresentative di ponteggi MSC (a sinistra), scaffolds MSC + EC (medio) e scaffolds MSC + EC + BMP (a destra). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 4 / 55914fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Configurazione del canale. Viene mostrata l&#39;impostazione del filtro del microscopio. A) Esistono quattro moduli di rivelazione NDD: nel primo modulo ci sono due cubi di filtri; Il secondo e il terzo modulo hanno un cubo di filtro ciascuno; E l&#39;ultimo modulo non ha cubo (non utilizzato). Il primo tubo fotomoltiplicatore (PMT) è per il canale lontano rosso (640 - 690 nm), riflettendo le lunghezze d&#39;onda inferiori; I seguenti sono 380 - 485 nm, 500 - 550 nm e 555 - 625 nm (l&#39;ordine è sempre dalle lunghezze d&#39;onda più basse e più alte). B) Le emissioni di fluoroforo rilevabili con le configurazioni di cui sopra (colore codificato). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" /> Figura 4. Impalcatura MSC<html> S Permettere per la formazione di una nicchia per le cellule ematopoietiche umane. A) e B) ricostruzioni 3D di Z-stack prese dopo esplante, dopo inoculazione endovenosa con AF488-hCD45 (verde), per etichettare le cellule ematopoietiche umane e 655-VPA (magenta) m per etichettare la vascolarizzazione. Le barre di scala rappresentano 20 μm in A e B (pannelli superiori) e 5 μm in B (pannelli inferiori). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" /> Video 1. Gli scaffali MSC consentono la formazione di una nicchia per le cellule ematopoietiche umane . Ricostruzione 3D di cellule ematopoietiche umane (AF488-hCD45) associate alla vasculatura (655-VPA) nello scaffold MSC (strutture collagene: SHG, cyan). Ogni stack misura 140 x 140 μm.Ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Si prega di cliccare qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.) <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" /> Figura 5. ECs umane partecipano alla formazione di navi humanizzate in ponteggi MSC. Ricostruzione 3D della vasculatura (655-VPA) fiancheggiata da EC di origine umana (FITC-hCD31) negli scaffold MSC + EC. Le barre di scala rappresentano 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" /> Video 2. ECs umane partecipano alla formazione di navi humanizzate in ponteggi MSC. Ricostruzione 3D di EC EC umane (FITC-hCD31) rivestimento della va<html> Scultura (655-VPA) negli scaffold MSC + EC. Ogni stack misura 240 x 240 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" /> Figura 6. Gli impalcature portanti rhBMP-2 hanno superfici ossei e vasculature humanizzate simile al midollo osseo. A) Ricostruzione 3D di scaffolds MSC + BMP che mostrano la formazione di strutture ossee (SHG-cyan) e vasculature (655-VPA). Le barre di scala rappresentano 100 μm (a sinistra), 70 μm (medio) e 50 μm (a destra). B) Ricostruzione 3D di scaffold MSC + EC + BMP che mostrano vasi humanizzati (655-VPA) fiancheggiati da ECs umane (FITC-hCD31). Le barre di scala rappresentano 50 μm (a sinistra) e 30 μm (medio e destro).14 / 55914fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" /> Video 3. I rulli di supporto rhBMP-2 hanno le superfici ossee e la vasculatura humanizzata simile al midollo osseo. Ricostruzione 3D di impalcature MSC + VERA + BMP (osso: SHG, vasi: 655-VPA, ECs umani: FITC-hCD31). Ogni stack misura 600 x 600 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)</a> <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" /> Figura 7. Immagini rappresentative dell&#39;immunofluorescenza eseguite su ponteggi fissi. AF) Studi di immunofluorescenza eseguiti per individuare le cellule umane impiantate iN scaffolds. AC) Telai implantati con hECs, hMSCs e hHSCs. DF) Impastanti di forma ossea impiantati con hECs, hMSCs e hHSCs. I canali di colore sono i seguenti: AD) EC (hCD31) e struttura vascolare del mouse (endomucina, ENDOM), BE) hMSC (hVimentin, hVIM) e cellule vascolari del mouse (endomucina, ENDOM), C) cellule ematopoietiche umane (hCD45) E vascolarizzazione del mouse (endomucina, ENDOM) e F) proteina legata all&#39;illuminazione adiposa umana (hADRP) e vasculatura del topo (endomucina, ENDOM). Le barre di scala rappresentano 10 μm (A e C), 20 μm (B e E) e 40 (D e F) μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Viene presentato un metodo per creare e vivere immagini diverse nicchie di midollo osseo umanizzato nei topi. Sulla base della nicchia di supporto creata da cellule mesenchimali umane, l&#39;aggiunta di cellule endoteliali umane induce la formazione di vasi umani, mentre l&#39;aggiunta di rhBMP-2 induce la formazione di tessuto osseo chimerico maturo umano-mouse.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.6K Views.  The Francis Crick Institute.  Viene presentato un metodo per creare e vivere immagini diverse nicchie di midollo osseo umanizzato nei topi. Sulla base della nicchia di supporto creata da cellule mesenchimali umane, l'aggiunta di cellule endoteliali umane induce la formazione di vasi umani, mentre l'aggiunta di rhBMP-2 induce la formazione di tessuto osseo chimerico maturo umano-mouse. 

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali umane e la loro coltivazione in poroso Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...