L&#39;autore desidera ringraziare il Prof. Elliot M. Meyerowitz per il suo sostegno, e commenti sul manoscritto, così come Ann Lavanway al Dartmouth College e il Dr. Andres Collazo alla struttura di imaging biologico al Caltech per il loro aiuto nella risoluzione di problemi tecnici con il confocale vivo. Il lavoro di Nathanaël Prunet è sostenuto dal National Institutes of Health di Grant attraverso R01 GM104244 a Elliot M. Meyerowitz.

1. Media e preparazione piatti <ol><li> Preparare dissezione piatti riempiendo scatole rotondo plastica (larghezza di circa 6 cm, 2 cm di profondità) a 0,5 cm con 2% agarosio. </li><li> Preparare l&#39;imaging piatti. <ol><li> Per un microscopio confocale verticale, riempire plastica rettangolare incernierato scatole (lunga circa 7 cm, largo 4,5 cm, 3 cm di profondità) a 0,5 cm con mezzo di imaging (vedere la sezione 1.3, &quot;medio Imaging&quot;; Figura 1F). </li><li> Per un microscopio confocale invertito: riempire piccola scatola di Petri (largo circa 3,5 cm, 1 cm di profondità) esattamente fino all&#39;orlo di mezzo di imaging (vedere la sezione 1.3, &quot;medio Imaging&quot;; la figura 1G). </li></ol></li><li> Preparare mezzo di imaging. <ol><li> Per l&#39;imaging singolo punto, utilizzare 1% agarosio. </li><li> Per gli esperimenti time-lapse, utilizzare mezzo di crescita apice (0,5x Murashige e Skoog miscela di sali basale senza vitamina, 1% saccarosio, 0,8% agarosio, pH 5,8 con idrossido di potassioe soluzione, integrata con vitamina [0,01% myo-inositolo, acido nicotinico 0,0001%, 0,0001% piridossina cloridrato, 0,001% cloridrato di tiamina, 0,0002% glicina] e citochinine [500 nM N6-benziladenina]) 15. </li></ol></li></ol> 2. crescita delle piante <ol><li> Seminare sterilizzati su lastre MS (0,5 o miscela di sali basale 1x Murashige e Skoog senza vitamina, 0,8% agar, pH 5,8 con soluzione di idrossido di potassio) con selezione appropriata. piastre posto a giorno lungo (16 ore di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C Condizioni per due settimane. </li><li> piantine trapianto nel suolo con spaziatura sufficiente per consentire lo sviluppo robusto. piante luogo a giorno corto, 16-22 ° C Condizioni per tre settimane. NOTA: coltivazione di piante in giornata o in condizioni di giorno in continuo direttamente dopo il trapianto risultati in fioritura precoce e infiorescenze che sono meno vigorosi, e molto più difficile da sezionare. Allo stesso modo, lasciando piante in breve Condit giornoioni per più di tre settimane si traduce in giorno la fioritura di lunghezza indipendente e infiorescenze che sono meno vigorosi. </li><li> piante Trasferire giorno lungo (16 ore di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C Condizioni fino a quando non fiore. apici dei germogli sono più facili da sezionare quando l&#39;infiorescenza è lungo 2-10 cm. </li></ol> 3. La dissezione della Ripresa Apex <ol><li> Opzionale: Usando una bella pietra affilatura e una goccia di olio leggero, affinare pinze con lo stereomicroscopio per renderli a lama, non puntiforme. </li><li> Rimuovere silique, boccioli anziani e infiorescenze secondari dalla infiorescenza primaria spingendo la base dei peduncoli con la pinza fino alla rottura. Rimuovere il maggior numero possibile di fiori senza ingrandimento (Figura 1, confrontare A e B). </li><li> Utilizzando pinze, perforare un foro verticale nel agarosio di un piatto dissezione, tagliare gli ultimi 0,5 cm delle infiorescenze e bastone verticalmente nel agarosio. Il restoboccioli devono essere al di sopra della superficie agarosio. </li><li> Riempire il piatto di imaging con acqua sterile deionizzata in modo che l&#39;apice ripresa è completamente immerso. Posizionare il piatto dissezione con lo stereomicroscopio, ed eliminare l&#39;aria intrappolata attorno all&#39;apice ripresa creando getti d&#39;acqua con una pipetta 1000 microlitri (Figura 1, confronta C e D). </li><li> Con lo stereomicroscopio, utilizzare le pinze per rimuovere boccioli che non sono per essere ripreso premendo sulla base del peduncolo o all&#39;inizio della germoglio fino alla rottura peduncolo (Figura 1E). È importante che i peduncoli rompono nettamente all&#39;incrocio con lo stelo, come peduncoli avanzi ostacolano la rimozione dei giovani boccioli. </li><li> Se solo immagini boccioli fase 5 e minore (figura 2a), rimuovere l&#39;acqua prima di sezionare fase 6-8 boccioli. Se boccioli di fiori di imaging fase 5 e più anziani, procedere alla ablazione sepalo (vedere paragrafo 5.1). In caso contrario, proCEED al punto 3.7. </li><li> Utilizzando pinze, perforare un foro verticale nel mezzo di un piatto di imaging, e bastone all&#39;apice montante sezionato nel mezzo, in modo che solo il germoglio apicale meristema e circostanti boccioli sono al di sopra della superficie del terreno. A seconda del germoglio di fiore (s) sono da acquisire, potrebbe essere necessario inclinare leggermente il campione, come boccioli non sono necessariamente orientati esattamente come lo stelo (Figura 2A). </li><li> Procedere alla colorazione del campione, se necessario. In caso contrario la colorazione e / o il campione di imaging subito, aggiungere l&#39;acqua e chiudere il piatto di imaging per prevenire la disidratazione. Se si utilizza un microscopio invertito, posizionare il piatto di imaging in una scatola di plastica trasparente e chiuderlo. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> Figura 1: Preparazione dei apici dei germogli per l&#39;imaging confocale vivo. (A - E) dissezione di unsparare apice per l&#39;imaging. Infiorescenza prima (A) e dopo (B) rimozione di silique e fiori anziani. (C - D) sparare apice immersa in acqua nel piatto dissezione, con una bolla d&#39;aria intrappolata sulla punta (C) e dopo la rimozione della bolla d&#39;aria (D). (E) sparare apice nel piatto dissezione, dopo la dissezione di boccioli più vecchi di fase 5. (F - G) Veduta di apici dei germogli nel piatto di imaging, sulla scena di un montante (F) e invertita (G) microscopio confocale . A (F), una lente acqua immersione 40X è posizionata sopra uno degli apici, con la punta della lente immerso in acqua. A (G), l&#39;apice ripresa viene posizionato capovolto sopra dell&#39;obiettivo acqua-immersione 40X, con una colonna d&#39;acqua che collega il mezzo di imaging alla punta della lente. Il pannello più piccolo (F) mostra un higla vista ingrandimento dell&#39;area nel rettangolo rosso, con un apice ripresa inserito nel mezzo di imaging; linee rosse e blu indicano la superficie del terreno e dell&#39;acqua, rispettivamente. (H - I) Esempi di dispositivi su misura che permettono di aggiungere più acqua alla punta della lente acqua immersione: un manicotto di gomma siliconica fatto da un raccordo candela (H), ed un manicotto di fortuna fatta dal dito di un guanto in lattice senza polvere (G). Barre di scala = 0,5 cm in (A) e (B), 0,1 cm di (C) e (D), e 100 um (E). Questa figura è stato pubblicato inizialmente riferimento 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 4. colorazione NOTA: Le pareti cellulari o membrane plasmatiche possono essere colorate con ioduro di propidio o FM4-64, rispettivamente, per ottenere la risoluzione cellularedurante l&#39;imaging. In alternativa, le linee giornalista con proteine fluorescenti tag alla membrana plasmatica possono essere utilizzati 6, 16. <ol><li> Rimuovere l&#39;acqua dal piatto di imaging, e garantire la superficie del terreno è asciutto per evitare di diluire il colorante. </li><li> Con lo stereomicroscopio, applicare 20 a 30 microlitri di 1 mg / mL soluzione ioduro di propidio, o 80 mg / ml soluzione FM4-64 all&#39;apice sezionato con una pipetta 10 microlitri. Assicurarsi che tutto il campione è coperto in colorante per garantire una colorazione omogenea. </li><li> Macchia per 2 minuti se si utilizza ioduro di propidio, o 20 minuti se si utilizza FM4-64. </li><li> Risciacquare due volte con acqua sterile deionizzata. </li></ol> 5. Sepal Ablazione NOTA: Nella fase 4, primordi sepal iniziano copre la FM. Man mano che crescono, filtrano la fluorescenza dal tessuto sottostante, e ostacolano il processo di imaging. Sepali possono sia essere rimossi manualmente mediante un perno metallico mounted su un perno-morsa, o impedito di crescere utilizzando ablazione laser emergente primordia sepalo. In alternativa, è possibile, in alcuni casi da usare mutanti come apetala1-1, in cui sepali sono mancanti o sostituiti da organi simili a foglie che non coprono l&#39;FM mentre la parte centrale del fiore si sviluppa normalmente (Figura 2F) 17. <ol><li> Ablazione sepalo su boccioli fase 5 e più vecchio con uno spillo-morsa possesso di un ago metallico rettilineo (Figura 2, E1-E2) <ol><li> Posizionare il piatto dissezione con l&#39;apice sezionato con lo stereomicroscopio, e impostare l&#39;ingrandimento al massimo. Immergere l&#39;apice riprese in acqua sterile, deionizzata, o in alternativa, una pipetta 1000 microlitri per applicare acqua fino all&#39;apice ripresa regolarmente mentre sezionare sepali. </li><li> Con il perno-morsa, posizionare il cursore sulla cima sepalo abaxial, tangenzialmente rispetto all&#39;apice sparare. spingere delicatamente sepalo lontano dall&#39;apice ripresa finché non si staccadal bocciolo. </li><li> Procedere allo stesso modo con il sepal adaxial, ma spingere il sepal verso l&#39;apice riprese. </li><li> Procedere in maniera simile con sepali laterali, ma posizionare il perno radialmente rispetto all&#39;apice riprese, e spingere i sepali di lato, lontano dal germoglio di fiore. </li><li> Immergere l&#39;apice riprese in acqua sterile deionizzata per pochi minuti per prevenire la disidratazione. </li></ol></li><li> Ablazione laser di primordi sepalo nella fase 3-4 (Figura 2, C5-D5) <ol><li> Porre la capsula di imaging con il macchiato, apice sezionato su palco microscopio confocale. Individuare e concentrarsi sul vertice come preparandosi all&#39;immagine (vedere la sezione 6, &quot;setup di imaging&quot;). </li><li> Utilizzando il software di sistema di ablazione laser, definiscono la zona di ablazione, che corrisponde alla cresta e punta del primordi sepalo emergente prima di iniziare copre il meristema fiore (tipicamente, allo stadio 3 per sepali abaxial e adaxial, e in fase tardiva 3 / inizio fase 4 per se lateralePals). </li><li> Regolare la potenza del laser e tempo di permanenza di parametri appropriati per l&#39;ablazione abbastanza cellule senza infliggere troppi danni ai tessuti sottostanti. In genere, a seconda del sistema di ablazione laser utilizzato, parametri corretti inizialmente devono essere identificati attraverso un processo di tentativi ed errori per assicurare che abbastanza cellule vengono rimosse per evitare che le sepali a crescere in seguito sul FM, senza influenzare il resto del fiore germoglio. Utilizzando la potenza del laser troppo e dimora risultati in tempo di danni al centro del fiore, che ne alterino la crescita e / o la sopravvivenza. Una volta identificati i parametri corretti, possono essere riutilizzati per esperimenti successivi. NOTA: Se l&#39;ablazione iniziale risulta insufficiente, è possibile procedere ad una seconda ablazione nei giorni seguenti (figura 2, C4 e D2). </li></ol></li></ol> 6. Imposta Imaging <ol><li> Utilizzare un microscopio verticale. <ol&gt; <li> Riempire il piatto di imaging con gli apici sezionato con sterile, acqua deionizzata in modo che la superficie del terreno è coperto in acqua 2.5-5 mm (Figura 1F). Completamente immergere i campioni. NOTA: Quando l&#39;imaging con un microscopio verticale, diversi apici possono essere collocati nello stesso piatto di imaging. Tuttavia, se il processo di imaging dura più di un&#39;ora, propidio ioduro tende ad essere diluito, e alcuni campioni potrebbe essere necessario ri-colorazione prima di imaging. </li><li> Porre la capsula di imaging sul palco microscopio (Figura 1F). Abbassare la lente acqua-immersione e sollevare la fase in modo che la punta della lente immerge in acqua. Procedere con cautela per non schiacciare apici sezionati o immergere la lente nel mezzo di imaging. </li><li> Se una bolla d&#39;aria è intrappolato sulla punta della lente, rendere getti d&#39;acqua con una pipetta 1000 microlitri per rimuoverlo. </li><li> Sotto illuminazione epifluorescenza, posizionare uno dei vertici sezionati nel campo lente utilizzando l&#39;aria XYtroller. Guardare attraverso gli oculari e mettere a fuoco il campione utilizzando il controller Z. Procedere con cautela al fine di non schiacciare il campione. </li><li> Utilizzando il software microscopio confocale, lo zoom sul fiore gemma da acquisire, e procedere di imaging vostro campione. </li></ol></li><li> Utilizzare un microscopio invertito. <ol><li> Usando una pipetta microlitri 1000, mettere una goccia di sterili, acqua deionizzata sulla punta della lente. </li><li> Tenere il piatto di imaging capovolto, e con una pipetta 1000 microlitri, aggiungere una goccia di acqua sterile deionizzata all&#39;apice sezionato. </li><li> Porre la capsula di imaging capovolta sul palco microscopio (Figura 1G). Procedere con cautela per non schiacciare il campione. </li><li> Sotto illuminazione epifluorescenza, posizionare l&#39;apice sezionato sulla punta della lente utilizzando il controller XY. Con il controller Z, attenzione abbassare la fase fino a che il campione raggiunge la goccia d&#39;acqua sulla punta della lente. Una colonna d&#39;acqua dovrebbe formare between la punta della lente e il mezzo. </li><li> Se la colonna d&#39;acqua non forma, aggiungere con cautela una goccia d&#39;acqua al campione con una pipetta 1000 microlitri. Aggiungere maniche improvvisati alla lente al fine di aggiungere più acqua alla sua punta, che facilita la creazione e la manutenzione della colonna d&#39;acqua (Figura 1H e 1I). </li><li> Sotto illuminazione epifluorescenza, guardare attraverso gli oculari e mettere a fuoco il campione utilizzando il controller Z. Procedere con cautela per non schiacciare il campione. </li><li> Utilizzando il software microscopio confocale, lo zoom sul fiore gemma da acquisire, e procedere alla imaging del campione. </li></ol></li><li> Se esegue esperimenti time-lapse, versare l&#39;acqua del piatto imaging e chiuderlo per prevenire la disidratazione tra punti temporali. Posizionare il piatto di imaging con gli esempi nel giorno lungo (16 h di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C condizioni. campioni di Re-macchia prima di ogni punto di tempo. NOTA: Mentre le cellule a sviping organi fiorali possono dividere più velocemente, le cellule in divisione meristema floreale una o due volte ogni due giorni, e linee cellulari sono facili da rintracciare, con punti di tempo ogni 24 h. Tuttavia, se necessario, è possibile l&#39;immagine dei campioni ogni sei ore. </li></ol> 7. Considerazioni sui parametri di imaging NOTA: Come impostare i parametri di imaging dipende molto dal sistema confocale utilizzato. Di seguito sono riportati i suggerimenti per alcuni di questi parametri che possono essere utilizzati con qualsiasi microscopio confocale. Per ulteriori considerazioni sui parametri di imaging, vedere la sezione di discussione e riferimento 14. <ol><li> Per la risoluzione XY: utilizzare 1.024 x 1.024 per una buona risoluzione cellulare. In alternativa, utilizzare 512 x 512 per ridurre il tempo di imaging, a scapito della risoluzione. </li><li> Per la risoluzione Z: impostare il passo di integrazione a 0,5-1,5 um. Abbassando il passo dimensione aumenta la risoluzione Z, ma anche il tempo di imaging. </li><li&gt; Per il foro stenopeico: impostare il foro stenopeico al 1-1,5 unità ariose. Aumentando il foro aumenta l&#39;intensità del segnale, ma anche il rumore da aerei non focali. </li></ol> 8. La visualizzazione di dati confocale <ol><li> Girare ancora immagini dei momenti di sviluppo del fiore in un film. <ol><li> Aprire le immagini fisse (in formato jpeg o tif) nel software (ad esempio, Figi). </li><li> Vai a Immagine&gt; Stack&gt; Immagini Stack. Le immagini aperte vengono raggruppate in una pila. </li><li> Se l&#39;ordine delle immagini nello stack non corrisponde l&#39;ordine cronologico, usare il plugin Stack Sorter (Plugin&gt; Stack&gt; Stack sorter) per riordinarli. </li><li> Per attivare la pila in un film, andare su File&gt; Salva con nome&gt; AVI. </li></ol></li></ol>

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L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

Qui, forniamo un protocollo per l&#39;imaging, in via di sviluppo boccioli di fiori dal vivo di Arabidopsis con un microscopio confocale e una lente d&#39;acqua-immersione. Anche se questo può essere fatto sia con un montante o un microscopio invertito, è più facile e più veloce da usare al primo. È anche interessante notare che diversi sistemi confocale variano notevolmente in termini di velocità, sensibilità e capacità di separare lunghezze d&#39;onda. I migliori microscopi confocali consentono ora di immagine diversi canali (per esempio GFP, YFP, DsRed e propidio ioduro; figura 2G) nei medesimi campioni. Alcuni microscopi confocali sono dotati di un rivelatore spettrale, che consenta di raccogliere la fluorescenza da diversi fluorocromi contemporaneamente e separarli successivamente. Quando si utilizza un rilevatore normale, tuttavia, una serie di laser e filtri deve essere utilizzato per eccitare e separare la fluorescenza da differenti fluorofori. Alcuni fluorofori sono completamente distinti spettri di emissione (es PCP und YFP), e può essere ripreso contemporaneamente. Altri fluorofori hanno spettri di emissione parzialmente sovrapposti (es GFP e YFP), e di solito devono essere ripreso separatamente, il che aumenta il tempo di imaging. Imaging chiudi fluorofori anche spesso richiede limitare la quantità di spettro viene raccolto per ciascun canale per impedire fluorescenza da un fluoroforo fuoriuscita in un altro canale. Ciò provoca una perdita di intensità del segnale raccolta, che può essere compensata da un aumento della potenza del laser e guadagno. Tuttavia, il tempo di imaging prolungato e una maggiore potenza laser possono candeggina e / o danneggiare il campione. Aumento della potenza del laser e / o aumento può anche aumentare il rumore di fondo. Ottimizzazione di intensità del segnale, la risoluzione e il tempo di imaging per ogni campione avviene attraverso un processo di tentativi ed errori, e coinvolge compromessi permanenti. Questo protocollo spiega come eseguire l&#39;imaging confocale in diretta di gemme a fiore in via di sviluppo sui fianchi di un apice germoglio sezionato. essopuò essere sostenuto che il fatto che l&#39;apice riprese non è collegata al resto della pianta e cresce in un mezzo contenente citochinine possono incidere SAM e sviluppo del fiore. Tuttavia, questo mezzo è stato progettato empiricamente attraverso un processo di tentativi ed errori per assicurare le riprese sezionato meristemi apicali produrre nuovi boccioli di fiori al plastochron normale, e che questi boccioli di fiori si sviluppano normalmente 15. Allo stesso modo, la dissezione sepalo non sembra influenzare pattern di espressione genica o lo sviluppo del resto del fiore. Altri protocolli dettaglio come eseguire confocale vivo della SAM ancora attaccate al resto dell&#39;impianto (ad esempio riferimento 11). Tali protocolli potrebbero essere adattati a, e offrono una valida alternativa per l&#39;imaging sviluppare fiori, soprattutto quando si studiano processi citochinine legati. Essi presentano tuttavia diversi inconvenienti: si allunga staminali e torsioni, e cambia l&#39;orientamento dei boccioli; unnd mentre l&#39;imaging di un apice germoglio attaccato al resto della pianta funziona bene con un microscopio verticale, è molto più complicata di farlo con un microscopio invertito. Lenti immersione hanno una migliore apertura numerica (NA) di lenti &quot;a secco&quot; (cioè lenti che sono separate dal campione mediante aria), e quindi fornire una risoluzione più fine del campione, che è fondamentale quando si usa un microscopio confocale. Utilizzando un obiettivo acqua immersione fornisce quindi una migliore NA di un obiettivo asciutto, evitando l&#39;apice sparare da disidratazione durante il processo di imaging. Mentre glicerina, lenti olio hanno una ancora maggiore NA di lenti d&#39;acqua, che richiedono l&#39;uso di un vetrino, che è molto poco pratico con un campione delle dimensioni di un apice germoglio, che mantiene anche crescere durante gli esperimenti time-lapse. Date le dimensioni dei campioni (a seconda delle fasi floreali, pile possono essere più di 150 micron di spessore), è anche importante utilizzare un obiettivo con una lunga distanza di lavoro. Usiamo tipicamente una lente 20 o 40X con una NA di 1 e una distanza di lavoro di 1.7-2.5 mm. Software microscopio confocale offre diversi modi per visualizzare i dati confocale, tra ricostruzioni tridimensionali (Figura 2, B1, B2 e B4) e viste fetta (Figura 2, B3). Mentre i più comunemente usati viste tridimensionali sono proiezioni di massima intensità di Z-stack confocale (Figura 2, B1 e B4), alcuni software (es ZEN e Imaris) offrono anche una vista trasparenza che filtra il segnale dalle parti più profonde della il campione (Figura 2, B2), che può essere utile quando si esaminano i processi che avvengono, o geni espressi in, strato epidermico. Intensità del segnale può essere sia codificato con un singolo colore (Figura 2, B1), utilizzando pixel intensity, oppure utilizzando un codice colore (Figura 2, B4). immagini dal vivo confocale offre non solo preziose intuizioni qualitativi in ​​sviluppo del fiore, ma anche potenzialmente fornisce biologi dello sviluppo con una ricchezza di dati quantitativi. Diversi software (es Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permette di quantificare il numero o il volume di cellule che esprimono uno o più reporter, o il livello di espressione di un reporter in celle diverse. Tale software può essere utilizzato anche per eseguire la segmentazione delle cellule automatica, tracciare linee cellulari e quantificare la crescita. Questo software diverso offre strumenti simili, ma si differenzia anche in molti modi. MARS-ALT e MorphoGraphX stati progettati specificamente per piante 15, 20, 21, a differenza di un ImarisND Fiji. MorphoGraphX ​​consente solo per la segmentazione e l&#39;analisi dello strato epidermico, mentre Imaris e MARS-ALT consentono la segmentazione e l&#39;analisi dell&#39;intero campione. Tuttavia, MARS-ALT richiede la preventiva immagini dello stesso campione da tre diverse angolazioni 15, e Imaris richiede solo una singola pila. L&#39;accesso a informazioni quantitative è fondamentale per la nostra comprensione dello sviluppo del fiore.

La maggior parte del corpo pianta forma post-embrionalmente da gruppi di cellule staminali situate in corrispondenza o in prossimità della punta - o meristemi apicali - dei germogli e le radici. Tutte le strutture fuori terra della pianta adulta derivano dal meristema apicale (SAM), che produce continuamente organi laterali sui fianchi: foglie durante la fase vegetativa, e meristemi fiori (FM) dopo esso transizioni di fase riproduttiva. FM a loro volta sviluppano in fiori. Mentre l&#39;Arabidopsis SAM produce organi laterali uno alla volta, in una, modello a spirale iterativo, FM producono quattro tipi di organi floreali all&#39;interno quattro spirali, in modo parzialmente sincrono, con più programmi di sviluppo dipanando simultaneamente. Le reti genetici alla base della specifica l&#39;identità dei diversi organi fiorali sono stati parzialmente decifrato (per le recensioni, vedi riferimenti 1, 2), ma molti aspetti del fiore SVILUPPOnt, come il posizionamento degli organi fiorali e la definizione dei confini tra spire, rimangono poco compreso. I primi studi genetici molecolari di sviluppo delle piante si affida tecniche come l&#39;ibridazione in situ e reporter GUS per analizzare l&#39;espressione genica. Mentre questi metodi hanno fornito una ricchezza di informazioni e notevolmente contribuito alla nostra comprensione della crescita delle piante e lo sviluppo del fiore, ci sono delle limitazioni importanti: mancano di buona risoluzione cellulare, non consentono la facile osservazione del pattern di espressione di geni multipli nello stesso campioni, e soprattutto, possono essere applicati solo a tessuti morti, fissi. I recenti progressi nella microscopia confocale hanno superato questi limiti, e di fornire biologi dello sviluppo con un potente strumento per indagare i processi sottostanti morfogenesi impianto. In particolare, la microscopia confocale permette l&#39;osservazione dei tessuti vivi ed organi durante la loro formazione, che è critical per comprendere appieno un processo tipicamente dinamico come sviluppo. Vivo imaging confocale è stato ampiamente utilizzato per analizzare la crescita aerea delle piante e la produzione di organi laterali dal SAM (ad esempio fa riferimento 3, 4, 5, 6), ma con l&#39;eccezione di alcuni rapporti (es riferimenti 7, 8, 9, 10), esso non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore. Protocolli per l&#39;imaging confocale in diretta del SAM sono disponibili (ad esempio, fa riferimento 11, 12), e forniscono una buona base per come rappresentare il via di sviluppo boccioli di fiori che circondano la SAM. Tuttavia, boccioli di fiori di imaging presenta sfide specifiche: per esempio,boccioli diventano rapidamente più grande della SAM, e allo stadio 4, sepali iniziano coprendo le fasi FM (come descritto nel riferimento 13), e regolazione della fluorescenza da tessuti sottostanti (Figura 2A). Qui, forniamo un protocollo dettagliato che spiega come eseguire l&#39;imaging confocale in diretta sullo sviluppo di boccioli di fiori di Arabidopsis utilizzando un montante o un microscopio invertito e una lente d&#39;acqua-immersione. Abbiamo precedentemente pubblicato questo protocollo di riferimento 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72701-D</td>
			<td style="width:325px;">Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pin Vise</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13560</td>
			<td>80 cm long, for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Straight Stainless Steel Needles&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13561-50</td>
			<td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Round plastic boxes</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64332</td>
			<td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular hinged boxes</td>
			<td>Durphy Packaging Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DG-0730</td>
			<td>transparent, 2-7/8&#8221; long, 2&#8221; wide, 1-1/4&#8221; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25382-064</td>
			<td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P10 and P1000 pipettes&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with corresponding filter tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with an 80-90 x maximum magnification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser ablation system</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope system</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 or 40 x water-dipping lens</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Agarose</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige and Skoog basic salt mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5524</td>
			<td>without vitamins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0761</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyridoxine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6280</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1270</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8790</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-Benzyladenine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3408</td>
			<td>BAP, a cytokinin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Propidium iodide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FM4-64</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F34653</td>
			<td>dilute in water to 80 &#956;g/mL, to stain the plasma membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

Lo studio della crescita e dello sviluppo pianta è a lungo invocato tecniche sperimentali che utilizzano morti, tessuti fissati e prive di adeguata risoluzione cellulare. I recenti progressi nella microscopia confocale, in combinazione con lo sviluppo di numerosi fluorofori, hanno superato questi problemi e ha aperto la possibilità di studiare l&#39;espressione di diversi geni contemporaneamente, con una buona risoluzione cellulare, in campioni dal vivo. vivo imaging confocale fornisce biologi vegetali con un potente strumento per studiare lo sviluppo, ed è stato ampiamente utilizzato per studiare la crescita delle radici e la formazione di organi laterali sui fianchi del meristema apicale. Tuttavia, non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore, in parte a causa di problemi che sono specifici per l&#39;imaging fiori, come i sepali che crescono nel meristema fiore, e filtrare la fluorescenza da tessuti sottostanti. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per eseguire l&#39;imaging confocale in diretta su Live, sviluppo araboidopsis boccioli, utilizzando sia un montante o un microscopio invertito.

La figura 2 illustra varie viste confocale Z-pile di boccioli Arabidopsis fiori vivi esprimenti differenti geni reporter fluorescenti, e trattata con uno ioduro di propidio (Figura 2, A-C5 e G) o FM4-64 (figura 2, E1-F) fornire una chiara risoluzione cellulare. Molti sistemi confocali consentono l&#39;imaging del due fluorofori con senza sovrapposizione spettri di emissione come GFP o YFP insieme sia con ioduro di propidio o FM4-64 (Figura 2A - 2F). I migliori sistemi confocali sono anche in grado di separare più fluorofori con gli spettri di emissione parzialmente sovrapposti negli stessi campioni, come GFP e YFP e DsRed e ioduro di propidio (figura 2G). Tre esempi di esperimenti time-lapse sono presentati nella figura2 e mostrano boccioli svilupparsi normalmente dopo l&#39;ablazione sepalo è stata eseguita sia con un sistema di ablazione laser (Figura 2, C1-C5 e D1-D5) o manualmente con un perno-morsa ed un perno metallico (Figura 2, E1-E2). Si noti che il germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, E1-E2 è da una pianta mutante superman-1, che è il motivo primordia carpello non si osservano al centro del bocciolo nella fase 7. ablazione laser primordi sepal emergente del germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, C1-C5 impedisce loro di coprire la FM, che può ancora essere ripreso nella fase 5 (Figura 2, C5). Al contrario, nel caso del germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, D1-D5, ablazione laser soltanto ritardato crescita sepalo, ma sepali cresciuto fino a coprire la maggior parte della FM fase 5 (Figura 2, D5 </strong&gt;). Al contrario, se troppo potenza del laser e abitazione tempo viene utilizzato durante l&#39;ablazione laser, danni diffonde alla parte centrale del fiore e colpisce la sua crescita e talvolta provoca la successiva morte dell&#39;intero germoglio di fiore. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> Figura 2: Visualizzazione confocale Z-pile di boccioli vivi. A e B2 sono viste di trasparenza; B1 e B4-G sono proiezioni di massima intensità; B3 è una vista in sezione ortogonale. (A - E2) fiori che esprimono un reporter di Venere per il gene APETALA3 (verde); pareti cellulari sono state colorate con ioduro di propidio (rosso, eccetto B4, verde). (A) Infiorescenza; numeri indicano fasi floreali; sepali in fase 4 e 5 fiori filtrano la fluorescenza del reporter Venere, che normalmente forms un anello. Si noti che alcuni boccioli di fiori appaiono inclinate rispetto al infiorescenza. (B1 - B4) Quattro differenti viste dello stesso confocale Z-stack di un germoglio fase 5 fiore: proiezioni intensità massima (B1 e B4) con intensità di segnale Venere codificato con intensità di pixel nel colore verde (B1) o con il codice colore fuoco (B4; codice colore viene mostrato nella parte inferiore del pannello); guarda la trasparenza (B2) e vista slice ortogonale (B3, l&#39;orientamento XY, XZ e YZ delle sezioni è indicato nel pannello). (C1 - C5) 4 giorni time-lapse di un germoglio di fiore individuo dal livello 3 al livello 5; ablazione laser (contrassegnate come caratteri bianchi) il giorno 1 e il giorno 3 erano sufficienti ad impedire sepali di coprire il centro del germoglio di fiore nella fase 5. (D1 - D5) 4 giorni time-lapse di un germoglio di fiore individuo da palcoscenico3 al livello 5; ablazione laser eseguite il giorno 1, 2 e 3 erano sufficienti per impedire sepali di coprire centro del germoglio di fiore. (E1 - E2) Individuale fiore gemma dopo rimozione manuale del abaxial e sepali adaxial (E1) e di ogni sepali (E2); frecce bianche indicano sepali rimanenti; asterischi bianche indicano cicatrici derivanti dalla rimozione dei sepali. (F) fase 7 fiore apetala1-1 esprimere un reporter DR5-3xVenusN7 18 (verde); membrane plasmatiche sono state colorate con FM4-64 (rosso); frecce blu indicano le strutture simili a foglie che sostituiscono sepali e non coprono il bocciolo. (G) Fase 4 germoglio di fiore esprimono un reporter GFP fluorescente per Dornroschen-SIMILE 7 (verde), un reporter Venus SUPERMAN (rosso) e un reporter DsRed per CLAVATA3 19 (ciano); cellulele pareti sono state colorate con ioduro di propidio (grigio). d: giorno; st: stage. Barre di scala = 25 um; scala è identica a B1, B2 e B4, in C1-C5 e D1-D5. Questo dato è stato modificato dal riferimento 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

immagini dal vivo confocale offre biologi con un potente strumento per studiare lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia confocale in diretta di sviluppare Arabidopsis fiori.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.7K Views.  California Institute of Technology.  immagini dal vivo confocale offre biologi con un potente strumento per studiare lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia confocale in diretta di sviluppare Arabidopsis fiori. 

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

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Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

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This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

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In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...