Name: live confocal imaging of developing arabidopsis flowers
Uploaded: 2017-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

L&#39;autore desidera ringraziare il Prof. Elliot M. Meyerowitz per il suo sostegno, e commenti sul manoscritto, così come Ann Lavanway al Dartmouth College e il Dr. Andres Collazo alla struttura di imaging biologico al Caltech per il loro aiuto nella risoluzione di problemi tecnici con il confocale vivo. Il lavoro di Nathanaël Prunet è sostenuto dal National Institutes of Health di Grant attraverso R01 GM104244 a Elliot M. Meyerowitz.

1. Media e preparazione piatti <ol><li> Preparare dissezione piatti riempiendo scatole rotondo plastica (larghezza di circa 6 cm, 2 cm di profondità) a 0,5 cm con 2% agarosio. </li><li> Preparare l&#39;imaging piatti. <ol><li> Per un microscopio confocale verticale, riempire plastica rettangolare incernierato scatole (lunga circa 7 cm, largo 4,5 cm, 3 cm di profondità) a 0,5 cm con mezzo di imaging (vedere la sezione 1.3, &quot;medio Imaging&quot;; Figura 1F). </li><li> Per un microscopio confocale invertito: riempire piccola scatola di Petri (largo circa 3,5 cm, 1 cm di profondità) esattamente fino all&#39;orlo di mezzo di imaging (vedere la sezione 1.3, &quot;medio Imaging&quot;; la figura 1G). </li></ol></li><li> Preparare mezzo di imaging. <ol><li> Per l&#39;imaging singolo punto, utilizzare 1% agarosio. </li><li> Per gli esperimenti time-lapse, utilizzare mezzo di crescita apice (0,5x Murashige e Skoog miscela di sali basale senza vitamina, 1% saccarosio, 0,8% agarosio, pH 5,8 con idrossido di potassioe soluzione, integrata con vitamina [0,01% myo-inositolo, acido nicotinico 0,0001%, 0,0001% piridossina cloridrato, 0,001% cloridrato di tiamina, 0,0002% glicina] e citochinine [500 nM N6-benziladenina]) 15. </li></ol></li></ol> 2. crescita delle piante <ol><li> Seminare sterilizzati su lastre MS (0,5 o miscela di sali basale 1x Murashige e Skoog senza vitamina, 0,8% agar, pH 5,8 con soluzione di idrossido di potassio) con selezione appropriata. piastre posto a giorno lungo (16 ore di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C Condizioni per due settimane. </li><li> piantine trapianto nel suolo con spaziatura sufficiente per consentire lo sviluppo robusto. piante luogo a giorno corto, 16-22 ° C Condizioni per tre settimane. NOTA: coltivazione di piante in giornata o in condizioni di giorno in continuo direttamente dopo il trapianto risultati in fioritura precoce e infiorescenze che sono meno vigorosi, e molto più difficile da sezionare. Allo stesso modo, lasciando piante in breve Condit giornoioni per più di tre settimane si traduce in giorno la fioritura di lunghezza indipendente e infiorescenze che sono meno vigorosi. </li><li> piante Trasferire giorno lungo (16 ore di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C Condizioni fino a quando non fiore. apici dei germogli sono più facili da sezionare quando l&#39;infiorescenza è lungo 2-10 cm. </li></ol> 3. La dissezione della Ripresa Apex <ol><li> Opzionale: Usando una bella pietra affilatura e una goccia di olio leggero, affinare pinze con lo stereomicroscopio per renderli a lama, non puntiforme. </li><li> Rimuovere silique, boccioli anziani e infiorescenze secondari dalla infiorescenza primaria spingendo la base dei peduncoli con la pinza fino alla rottura. Rimuovere il maggior numero possibile di fiori senza ingrandimento (Figura 1, confrontare A e B). </li><li> Utilizzando pinze, perforare un foro verticale nel agarosio di un piatto dissezione, tagliare gli ultimi 0,5 cm delle infiorescenze e bastone verticalmente nel agarosio. Il restoboccioli devono essere al di sopra della superficie agarosio. </li><li> Riempire il piatto di imaging con acqua sterile deionizzata in modo che l&#39;apice ripresa è completamente immerso. Posizionare il piatto dissezione con lo stereomicroscopio, ed eliminare l&#39;aria intrappolata attorno all&#39;apice ripresa creando getti d&#39;acqua con una pipetta 1000 microlitri (Figura 1, confronta C e D). </li><li> Con lo stereomicroscopio, utilizzare le pinze per rimuovere boccioli che non sono per essere ripreso premendo sulla base del peduncolo o all&#39;inizio della germoglio fino alla rottura peduncolo (Figura 1E). È importante che i peduncoli rompono nettamente all&#39;incrocio con lo stelo, come peduncoli avanzi ostacolano la rimozione dei giovani boccioli. </li><li> Se solo immagini boccioli fase 5 e minore (figura 2a), rimuovere l&#39;acqua prima di sezionare fase 6-8 boccioli. Se boccioli di fiori di imaging fase 5 e più anziani, procedere alla ablazione sepalo (vedere paragrafo 5.1). In caso contrario, proCEED al punto 3.7. </li><li> Utilizzando pinze, perforare un foro verticale nel mezzo di un piatto di imaging, e bastone all&#39;apice montante sezionato nel mezzo, in modo che solo il germoglio apicale meristema e circostanti boccioli sono al di sopra della superficie del terreno. A seconda del germoglio di fiore (s) sono da acquisire, potrebbe essere necessario inclinare leggermente il campione, come boccioli non sono necessariamente orientati esattamente come lo stelo (Figura 2A). </li><li> Procedere alla colorazione del campione, se necessario. In caso contrario la colorazione e / o il campione di imaging subito, aggiungere l&#39;acqua e chiudere il piatto di imaging per prevenire la disidratazione. Se si utilizza un microscopio invertito, posizionare il piatto di imaging in una scatola di plastica trasparente e chiuderlo. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> Figura 1: Preparazione dei apici dei germogli per l&#39;imaging confocale vivo. (A - E) dissezione di unsparare apice per l&#39;imaging. Infiorescenza prima (A) e dopo (B) rimozione di silique e fiori anziani. (C - D) sparare apice immersa in acqua nel piatto dissezione, con una bolla d&#39;aria intrappolata sulla punta (C) e dopo la rimozione della bolla d&#39;aria (D). (E) sparare apice nel piatto dissezione, dopo la dissezione di boccioli più vecchi di fase 5. (F - G) Veduta di apici dei germogli nel piatto di imaging, sulla scena di un montante (F) e invertita (G) microscopio confocale . A (F), una lente acqua immersione 40X è posizionata sopra uno degli apici, con la punta della lente immerso in acqua. A (G), l&#39;apice ripresa viene posizionato capovolto sopra dell&#39;obiettivo acqua-immersione 40X, con una colonna d&#39;acqua che collega il mezzo di imaging alla punta della lente. Il pannello più piccolo (F) mostra un higla vista ingrandimento dell&#39;area nel rettangolo rosso, con un apice ripresa inserito nel mezzo di imaging; linee rosse e blu indicano la superficie del terreno e dell&#39;acqua, rispettivamente. (H - I) Esempi di dispositivi su misura che permettono di aggiungere più acqua alla punta della lente acqua immersione: un manicotto di gomma siliconica fatto da un raccordo candela (H), ed un manicotto di fortuna fatta dal dito di un guanto in lattice senza polvere (G). Barre di scala = 0,5 cm in (A) e (B), 0,1 cm di (C) e (D), e 100 um (E). Questa figura è stato pubblicato inizialmente riferimento 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 4. colorazione NOTA: Le pareti cellulari o membrane plasmatiche possono essere colorate con ioduro di propidio o FM4-64, rispettivamente, per ottenere la risoluzione cellularedurante l&#39;imaging. In alternativa, le linee giornalista con proteine fluorescenti tag alla membrana plasmatica possono essere utilizzati 6, 16. <ol><li> Rimuovere l&#39;acqua dal piatto di imaging, e garantire la superficie del terreno è asciutto per evitare di diluire il colorante. </li><li> Con lo stereomicroscopio, applicare 20 a 30 microlitri di 1 mg / mL soluzione ioduro di propidio, o 80 mg / ml soluzione FM4-64 all&#39;apice sezionato con una pipetta 10 microlitri. Assicurarsi che tutto il campione è coperto in colorante per garantire una colorazione omogenea. </li><li> Macchia per 2 minuti se si utilizza ioduro di propidio, o 20 minuti se si utilizza FM4-64. </li><li> Risciacquare due volte con acqua sterile deionizzata. </li></ol> 5. Sepal Ablazione NOTA: Nella fase 4, primordi sepal iniziano copre la FM. Man mano che crescono, filtrano la fluorescenza dal tessuto sottostante, e ostacolano il processo di imaging. Sepali possono sia essere rimossi manualmente mediante un perno metallico mounted su un perno-morsa, o impedito di crescere utilizzando ablazione laser emergente primordia sepalo. In alternativa, è possibile, in alcuni casi da usare mutanti come apetala1-1, in cui sepali sono mancanti o sostituiti da organi simili a foglie che non coprono l&#39;FM mentre la parte centrale del fiore si sviluppa normalmente (Figura 2F) 17. <ol><li> Ablazione sepalo su boccioli fase 5 e più vecchio con uno spillo-morsa possesso di un ago metallico rettilineo (Figura 2, E1-E2) <ol><li> Posizionare il piatto dissezione con l&#39;apice sezionato con lo stereomicroscopio, e impostare l&#39;ingrandimento al massimo. Immergere l&#39;apice riprese in acqua sterile, deionizzata, o in alternativa, una pipetta 1000 microlitri per applicare acqua fino all&#39;apice ripresa regolarmente mentre sezionare sepali. </li><li> Con il perno-morsa, posizionare il cursore sulla cima sepalo abaxial, tangenzialmente rispetto all&#39;apice sparare. spingere delicatamente sepalo lontano dall&#39;apice ripresa finché non si staccadal bocciolo. </li><li> Procedere allo stesso modo con il sepal adaxial, ma spingere il sepal verso l&#39;apice riprese. </li><li> Procedere in maniera simile con sepali laterali, ma posizionare il perno radialmente rispetto all&#39;apice riprese, e spingere i sepali di lato, lontano dal germoglio di fiore. </li><li> Immergere l&#39;apice riprese in acqua sterile deionizzata per pochi minuti per prevenire la disidratazione. </li></ol></li><li> Ablazione laser di primordi sepalo nella fase 3-4 (Figura 2, C5-D5) <ol><li> Porre la capsula di imaging con il macchiato, apice sezionato su palco microscopio confocale. Individuare e concentrarsi sul vertice come preparandosi all&#39;immagine (vedere la sezione 6, &quot;setup di imaging&quot;). </li><li> Utilizzando il software di sistema di ablazione laser, definiscono la zona di ablazione, che corrisponde alla cresta e punta del primordi sepalo emergente prima di iniziare copre il meristema fiore (tipicamente, allo stadio 3 per sepali abaxial e adaxial, e in fase tardiva 3 / inizio fase 4 per se lateralePals). </li><li> Regolare la potenza del laser e tempo di permanenza di parametri appropriati per l&#39;ablazione abbastanza cellule senza infliggere troppi danni ai tessuti sottostanti. In genere, a seconda del sistema di ablazione laser utilizzato, parametri corretti inizialmente devono essere identificati attraverso un processo di tentativi ed errori per assicurare che abbastanza cellule vengono rimosse per evitare che le sepali a crescere in seguito sul FM, senza influenzare il resto del fiore germoglio. Utilizzando la potenza del laser troppo e dimora risultati in tempo di danni al centro del fiore, che ne alterino la crescita e / o la sopravvivenza. Una volta identificati i parametri corretti, possono essere riutilizzati per esperimenti successivi. NOTA: Se l&#39;ablazione iniziale risulta insufficiente, è possibile procedere ad una seconda ablazione nei giorni seguenti (figura 2, C4 e D2). </li></ol></li></ol> 6. Imposta Imaging <ol><li> Utilizzare un microscopio verticale. <ol&gt; <li> Riempire il piatto di imaging con gli apici sezionato con sterile, acqua deionizzata in modo che la superficie del terreno è coperto in acqua 2.5-5 mm (Figura 1F). Completamente immergere i campioni. NOTA: Quando l&#39;imaging con un microscopio verticale, diversi apici possono essere collocati nello stesso piatto di imaging. Tuttavia, se il processo di imaging dura più di un&#39;ora, propidio ioduro tende ad essere diluito, e alcuni campioni potrebbe essere necessario ri-colorazione prima di imaging. </li><li> Porre la capsula di imaging sul palco microscopio (Figura 1F). Abbassare la lente acqua-immersione e sollevare la fase in modo che la punta della lente immerge in acqua. Procedere con cautela per non schiacciare apici sezionati o immergere la lente nel mezzo di imaging. </li><li> Se una bolla d&#39;aria è intrappolato sulla punta della lente, rendere getti d&#39;acqua con una pipetta 1000 microlitri per rimuoverlo. </li><li> Sotto illuminazione epifluorescenza, posizionare uno dei vertici sezionati nel campo lente utilizzando l&#39;aria XYtroller. Guardare attraverso gli oculari e mettere a fuoco il campione utilizzando il controller Z. Procedere con cautela al fine di non schiacciare il campione. </li><li> Utilizzando il software microscopio confocale, lo zoom sul fiore gemma da acquisire, e procedere di imaging vostro campione. </li></ol></li><li> Utilizzare un microscopio invertito. <ol><li> Usando una pipetta microlitri 1000, mettere una goccia di sterili, acqua deionizzata sulla punta della lente. </li><li> Tenere il piatto di imaging capovolto, e con una pipetta 1000 microlitri, aggiungere una goccia di acqua sterile deionizzata all&#39;apice sezionato. </li><li> Porre la capsula di imaging capovolta sul palco microscopio (Figura 1G). Procedere con cautela per non schiacciare il campione. </li><li> Sotto illuminazione epifluorescenza, posizionare l&#39;apice sezionato sulla punta della lente utilizzando il controller XY. Con il controller Z, attenzione abbassare la fase fino a che il campione raggiunge la goccia d&#39;acqua sulla punta della lente. Una colonna d&#39;acqua dovrebbe formare between la punta della lente e il mezzo. </li><li> Se la colonna d&#39;acqua non forma, aggiungere con cautela una goccia d&#39;acqua al campione con una pipetta 1000 microlitri. Aggiungere maniche improvvisati alla lente al fine di aggiungere più acqua alla sua punta, che facilita la creazione e la manutenzione della colonna d&#39;acqua (Figura 1H e 1I). </li><li> Sotto illuminazione epifluorescenza, guardare attraverso gli oculari e mettere a fuoco il campione utilizzando il controller Z. Procedere con cautela per non schiacciare il campione. </li><li> Utilizzando il software microscopio confocale, lo zoom sul fiore gemma da acquisire, e procedere alla imaging del campione. </li></ol></li><li> Se esegue esperimenti time-lapse, versare l&#39;acqua del piatto imaging e chiuderlo per prevenire la disidratazione tra punti temporali. Posizionare il piatto di imaging con gli esempi nel giorno lungo (16 h di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C condizioni. campioni di Re-macchia prima di ogni punto di tempo. NOTA: Mentre le cellule a sviping organi fiorali possono dividere più velocemente, le cellule in divisione meristema floreale una o due volte ogni due giorni, e linee cellulari sono facili da rintracciare, con punti di tempo ogni 24 h. Tuttavia, se necessario, è possibile l&#39;immagine dei campioni ogni sei ore. </li></ol> 7. Considerazioni sui parametri di imaging NOTA: Come impostare i parametri di imaging dipende molto dal sistema confocale utilizzato. Di seguito sono riportati i suggerimenti per alcuni di questi parametri che possono essere utilizzati con qualsiasi microscopio confocale. Per ulteriori considerazioni sui parametri di imaging, vedere la sezione di discussione e riferimento 14. <ol><li> Per la risoluzione XY: utilizzare 1.024 x 1.024 per una buona risoluzione cellulare. In alternativa, utilizzare 512 x 512 per ridurre il tempo di imaging, a scapito della risoluzione. </li><li> Per la risoluzione Z: impostare il passo di integrazione a 0,5-1,5 um. Abbassando il passo dimensione aumenta la risoluzione Z, ma anche il tempo di imaging. </li><li&gt; Per il foro stenopeico: impostare il foro stenopeico al 1-1,5 unità ariose. Aumentando il foro aumenta l&#39;intensità del segnale, ma anche il rumore da aerei non focali. </li></ol> 8. La visualizzazione di dati confocale <ol><li> Girare ancora immagini dei momenti di sviluppo del fiore in un film. <ol><li> Aprire le immagini fisse (in formato jpeg o tif) nel software (ad esempio, Figi). </li><li> Vai a Immagine&gt; Stack&gt; Immagini Stack. Le immagini aperte vengono raggruppate in una pila. </li><li> Se l&#39;ordine delle immagini nello stack non corrisponde l&#39;ordine cronologico, usare il plugin Stack Sorter (Plugin&gt; Stack&gt; Stack sorter) per riordinarli. </li><li> Per attivare la pila in un film, andare su File&gt; Salva con nome&gt; AVI. </li></ol></li></ol>

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L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

Qui, forniamo un protocollo per l&#39;imaging, in via di sviluppo boccioli di fiori dal vivo di Arabidopsis con un microscopio confocale e una lente d&#39;acqua-immersione. Anche se questo può essere fatto sia con un montante o un microscopio invertito, è più facile e più veloce da usare al primo. È anche interessante notare che diversi sistemi confocale variano notevolmente in termini di velocità, sensibilità e capacità di separare lunghezze d&#39;onda. I migliori microscopi confocali consentono ora di immagine diversi canali (per esempio GFP, YFP, DsRed e propidio ioduro; figura 2G) nei medesimi campioni. Alcuni microscopi confocali sono dotati di un rivelatore spettrale, che consenta di raccogliere la fluorescenza da diversi fluorocromi contemporaneamente e separarli successivamente. Quando si utilizza un rilevatore normale, tuttavia, una serie di laser e filtri deve essere utilizzato per eccitare e separare la fluorescenza da differenti fluorofori. Alcuni fluorofori sono completamente distinti spettri di emissione (es PCP und YFP), e può essere ripreso contemporaneamente. Altri fluorofori hanno spettri di emissione parzialmente sovrapposti (es GFP e YFP), e di solito devono essere ripreso separatamente, il che aumenta il tempo di imaging. Imaging chiudi fluorofori anche spesso richiede limitare la quantità di spettro viene raccolto per ciascun canale per impedire fluorescenza da un fluoroforo fuoriuscita in un altro canale. Ciò provoca una perdita di intensità del segnale raccolta, che può essere compensata da un aumento della potenza del laser e guadagno. Tuttavia, il tempo di imaging prolungato e una maggiore potenza laser possono candeggina e / o danneggiare il campione. Aumento della potenza del laser e / o aumento può anche aumentare il rumore di fondo. Ottimizzazione di intensità del segnale, la risoluzione e il tempo di imaging per ogni campione avviene attraverso un processo di tentativi ed errori, e coinvolge compromessi permanenti. Questo protocollo spiega come eseguire l&#39;imaging confocale in diretta di gemme a fiore in via di sviluppo sui fianchi di un apice germoglio sezionato. essopuò essere sostenuto che il fatto che l&#39;apice riprese non è collegata al resto della pianta e cresce in un mezzo contenente citochinine possono incidere SAM e sviluppo del fiore. Tuttavia, questo mezzo è stato progettato empiricamente attraverso un processo di tentativi ed errori per assicurare le riprese sezionato meristemi apicali produrre nuovi boccioli di fiori al plastochron normale, e che questi boccioli di fiori si sviluppano normalmente 15. Allo stesso modo, la dissezione sepalo non sembra influenzare pattern di espressione genica o lo sviluppo del resto del fiore. Altri protocolli dettaglio come eseguire confocale vivo della SAM ancora attaccate al resto dell&#39;impianto (ad esempio riferimento 11). Tali protocolli potrebbero essere adattati a, e offrono una valida alternativa per l&#39;imaging sviluppare fiori, soprattutto quando si studiano processi citochinine legati. Essi presentano tuttavia diversi inconvenienti: si allunga staminali e torsioni, e cambia l&#39;orientamento dei boccioli; unnd mentre l&#39;imaging di un apice germoglio attaccato al resto della pianta funziona bene con un microscopio verticale, è molto più complicata di farlo con un microscopio invertito. Lenti immersione hanno una migliore apertura numerica (NA) di lenti &quot;a secco&quot; (cioè lenti che sono separate dal campione mediante aria), e quindi fornire una risoluzione più fine del campione, che è fondamentale quando si usa un microscopio confocale. Utilizzando un obiettivo acqua immersione fornisce quindi una migliore NA di un obiettivo asciutto, evitando l&#39;apice sparare da disidratazione durante il processo di imaging. Mentre glicerina, lenti olio hanno una ancora maggiore NA di lenti d&#39;acqua, che richiedono l&#39;uso di un vetrino, che è molto poco pratico con un campione delle dimensioni di un apice germoglio, che mantiene anche crescere durante gli esperimenti time-lapse. Date le dimensioni dei campioni (a seconda delle fasi floreali, pile possono essere più di 150 micron di spessore), è anche importante utilizzare un obiettivo con una lunga distanza di lavoro. Usiamo tipicamente una lente 20 o 40X con una NA di 1 e una distanza di lavoro di 1.7-2.5 mm. Software microscopio confocale offre diversi modi per visualizzare i dati confocale, tra ricostruzioni tridimensionali (Figura 2, B1, B2 e B4) e viste fetta (Figura 2, B3). Mentre i più comunemente usati viste tridimensionali sono proiezioni di massima intensità di Z-stack confocale (Figura 2, B1 e B4), alcuni software (es ZEN e Imaris) offrono anche una vista trasparenza che filtra il segnale dalle parti più profonde della il campione (Figura 2, B2), che può essere utile quando si esaminano i processi che avvengono, o geni espressi in, strato epidermico. Intensità del segnale può essere sia codificato con un singolo colore (Figura 2, B1), utilizzando pixel intensity, oppure utilizzando un codice colore (Figura 2, B4). immagini dal vivo confocale offre non solo preziose intuizioni qualitativi in ​​sviluppo del fiore, ma anche potenzialmente fornisce biologi dello sviluppo con una ricchezza di dati quantitativi. Diversi software (es Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permette di quantificare il numero o il volume di cellule che esprimono uno o più reporter, o il livello di espressione di un reporter in celle diverse. Tale software può essere utilizzato anche per eseguire la segmentazione delle cellule automatica, tracciare linee cellulari e quantificare la crescita. Questo software diverso offre strumenti simili, ma si differenzia anche in molti modi. MARS-ALT e MorphoGraphX stati progettati specificamente per piante 15, 20, 21, a differenza di un ImarisND Fiji. MorphoGraphX ​​consente solo per la segmentazione e l&#39;analisi dello strato epidermico, mentre Imaris e MARS-ALT consentono la segmentazione e l&#39;analisi dell&#39;intero campione. Tuttavia, MARS-ALT richiede la preventiva immagini dello stesso campione da tre diverse angolazioni 15, e Imaris richiede solo una singola pila. L&#39;accesso a informazioni quantitative è fondamentale per la nostra comprensione dello sviluppo del fiore.

La maggior parte del corpo pianta forma post-embrionalmente da gruppi di cellule staminali situate in corrispondenza o in prossimità della punta - o meristemi apicali - dei germogli e le radici. Tutte le strutture fuori terra della pianta adulta derivano dal meristema apicale (SAM), che produce continuamente organi laterali sui fianchi: foglie durante la fase vegetativa, e meristemi fiori (FM) dopo esso transizioni di fase riproduttiva. FM a loro volta sviluppano in fiori. Mentre l&#39;Arabidopsis SAM produce organi laterali uno alla volta, in una, modello a spirale iterativo, FM producono quattro tipi di organi floreali all&#39;interno quattro spirali, in modo parzialmente sincrono, con più programmi di sviluppo dipanando simultaneamente. Le reti genetici alla base della specifica l&#39;identità dei diversi organi fiorali sono stati parzialmente decifrato (per le recensioni, vedi riferimenti 1, 2), ma molti aspetti del fiore SVILUPPOnt, come il posizionamento degli organi fiorali e la definizione dei confini tra spire, rimangono poco compreso. I primi studi genetici molecolari di sviluppo delle piante si affida tecniche come l&#39;ibridazione in situ e reporter GUS per analizzare l&#39;espressione genica. Mentre questi metodi hanno fornito una ricchezza di informazioni e notevolmente contribuito alla nostra comprensione della crescita delle piante e lo sviluppo del fiore, ci sono delle limitazioni importanti: mancano di buona risoluzione cellulare, non consentono la facile osservazione del pattern di espressione di geni multipli nello stesso campioni, e soprattutto, possono essere applicati solo a tessuti morti, fissi. I recenti progressi nella microscopia confocale hanno superato questi limiti, e di fornire biologi dello sviluppo con un potente strumento per indagare i processi sottostanti morfogenesi impianto. In particolare, la microscopia confocale permette l&#39;osservazione dei tessuti vivi ed organi durante la loro formazione, che è critical per comprendere appieno un processo tipicamente dinamico come sviluppo. Vivo imaging confocale è stato ampiamente utilizzato per analizzare la crescita aerea delle piante e la produzione di organi laterali dal SAM (ad esempio fa riferimento 3, 4, 5, 6), ma con l&#39;eccezione di alcuni rapporti (es riferimenti 7, 8, 9, 10), esso non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore. Protocolli per l&#39;imaging confocale in diretta del SAM sono disponibili (ad esempio, fa riferimento 11, 12), e forniscono una buona base per come rappresentare il via di sviluppo boccioli di fiori che circondano la SAM. Tuttavia, boccioli di fiori di imaging presenta sfide specifiche: per esempio,boccioli diventano rapidamente più grande della SAM, e allo stadio 4, sepali iniziano coprendo le fasi FM (come descritto nel riferimento 13), e regolazione della fluorescenza da tessuti sottostanti (Figura 2A). Qui, forniamo un protocollo dettagliato che spiega come eseguire l&#39;imaging confocale in diretta sullo sviluppo di boccioli di fiori di Arabidopsis utilizzando un montante o un microscopio invertito e una lente d&#39;acqua-immersione. Abbiamo precedentemente pubblicato questo protocollo di riferimento 14.

<table><tbody><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>80 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Straight Stainless Steel Needles&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-50</td><td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Round plastic boxes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64332</td><td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td></tr><tr><td>Rectangular hinged boxes</td><td>Durphy Packaging Co.&amp;nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>transparent, 2-7/8&amp;rdquo; long, 2&amp;rdquo; wide, 1-1/4&amp;rdquo; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td></tr><tr><td>P10 and P1000 pipettes&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>with corresponding filter tips</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>with an 80-90X maximum magnification</td></tr><tr><td>Laser ablation system</td><td></td><td></td><td>for sepal ablation</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 or 40X water-dipping lens</td><td></td><td></td><td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog basic salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>without vitamins</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>N6-Benzyladenine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, a cytokinin</td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>dilute in water to 80&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL, to stain the plasma membranes</td></tr></tbody></table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

Lo studio della crescita e dello sviluppo pianta è a lungo invocato tecniche sperimentali che utilizzano morti, tessuti fissati e prive di adeguata risoluzione cellulare. I recenti progressi nella microscopia confocale, in combinazione con lo sviluppo di numerosi fluorofori, hanno superato questi problemi e ha aperto la possibilità di studiare l&#39;espressione di diversi geni contemporaneamente, con una buona risoluzione cellulare, in campioni dal vivo. vivo imaging confocale fornisce biologi vegetali con un potente strumento per studiare lo sviluppo, ed è stato ampiamente utilizzato per studiare la crescita delle radici e la formazione di organi laterali sui fianchi del meristema apicale. Tuttavia, non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore, in parte a causa di problemi che sono specifici per l&#39;imaging fiori, come i sepali che crescono nel meristema fiore, e filtrare la fluorescenza da tessuti sottostanti. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per eseguire l&#39;imaging confocale in diretta su Live, sviluppo araboidopsis boccioli, utilizzando sia un montante o un microscopio invertito.

La figura 2 illustra varie viste confocale Z-pile di boccioli Arabidopsis fiori vivi esprimenti differenti geni reporter fluorescenti, e trattata con uno ioduro di propidio (Figura 2, A-C5 e G) o FM4-64 (figura 2, E1-F) fornire una chiara risoluzione cellulare. Molti sistemi confocali consentono l&#39;imaging del due fluorofori con senza sovrapposizione spettri di emissione come GFP o YFP insieme sia con ioduro di propidio o FM4-64 (Figura 2A - 2F). I migliori sistemi confocali sono anche in grado di separare più fluorofori con gli spettri di emissione parzialmente sovrapposti negli stessi campioni, come GFP e YFP e DsRed e ioduro di propidio (figura 2G). Tre esempi di esperimenti time-lapse sono presentati nella figura2 e mostrano boccioli svilupparsi normalmente dopo l&#39;ablazione sepalo è stata eseguita sia con un sistema di ablazione laser (Figura 2, C1-C5 e D1-D5) o manualmente con un perno-morsa ed un perno metallico (Figura 2, E1-E2). Si noti che il germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, E1-E2 è da una pianta mutante superman-1, che è il motivo primordia carpello non si osservano al centro del bocciolo nella fase 7. ablazione laser primordi sepal emergente del germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, C1-C5 impedisce loro di coprire la FM, che può ancora essere ripreso nella fase 5 (Figura 2, C5). Al contrario, nel caso del germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, D1-D5, ablazione laser soltanto ritardato crescita sepalo, ma sepali cresciuto fino a coprire la maggior parte della FM fase 5 (Figura 2, D5 </strong&gt;). Al contrario, se troppo potenza del laser e abitazione tempo viene utilizzato durante l&#39;ablazione laser, danni diffonde alla parte centrale del fiore e colpisce la sua crescita e talvolta provoca la successiva morte dell&#39;intero germoglio di fiore. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> Figura 2: Visualizzazione confocale Z-pile di boccioli vivi. A e B2 sono viste di trasparenza; B1 e B4-G sono proiezioni di massima intensità; B3 è una vista in sezione ortogonale. (A - E2) fiori che esprimono un reporter di Venere per il gene APETALA3 (verde); pareti cellulari sono state colorate con ioduro di propidio (rosso, eccetto B4, verde). (A) Infiorescenza; numeri indicano fasi floreali; sepali in fase 4 e 5 fiori filtrano la fluorescenza del reporter Venere, che normalmente forms un anello. Si noti che alcuni boccioli di fiori appaiono inclinate rispetto al infiorescenza. (B1 - B4) Quattro differenti viste dello stesso confocale Z-stack di un germoglio fase 5 fiore: proiezioni intensità massima (B1 e B4) con intensità di segnale Venere codificato con intensità di pixel nel colore verde (B1) o con il codice colore fuoco (B4; codice colore viene mostrato nella parte inferiore del pannello); guarda la trasparenza (B2) e vista slice ortogonale (B3, l&#39;orientamento XY, XZ e YZ delle sezioni è indicato nel pannello). (C1 - C5) 4 giorni time-lapse di un germoglio di fiore individuo dal livello 3 al livello 5; ablazione laser (contrassegnate come caratteri bianchi) il giorno 1 e il giorno 3 erano sufficienti ad impedire sepali di coprire il centro del germoglio di fiore nella fase 5. (D1 - D5) 4 giorni time-lapse di un germoglio di fiore individuo da palcoscenico3 al livello 5; ablazione laser eseguite il giorno 1, 2 e 3 erano sufficienti per impedire sepali di coprire centro del germoglio di fiore. (E1 - E2) Individuale fiore gemma dopo rimozione manuale del abaxial e sepali adaxial (E1) e di ogni sepali (E2); frecce bianche indicano sepali rimanenti; asterischi bianche indicano cicatrici derivanti dalla rimozione dei sepali. (F) fase 7 fiore apetala1-1 esprimere un reporter DR5-3xVenusN7 18 (verde); membrane plasmatiche sono state colorate con FM4-64 (rosso); frecce blu indicano le strutture simili a foglie che sostituiscono sepali e non coprono il bocciolo. (G) Fase 4 germoglio di fiore esprimono un reporter GFP fluorescente per Dornroschen-SIMILE 7 (verde), un reporter Venus SUPERMAN (rosso) e un reporter DsRed per CLAVATA3 19 (ciano); cellulele pareti sono state colorate con ioduro di propidio (grigio). d: giorno; st: stage. Barre di scala = 25 um; scala è identica a B1, B2 e B4, in C1-C5 e D1-D5. Questo dato è stato modificato dal riferimento 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

immagini dal vivo confocale offre biologi con un potente strumento per studiare lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia confocale in diretta di sviluppare Arabidopsis fiori.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K Views.  California Institute of Technology.  immagini dal vivo confocale offre biologi con un potente strumento per studiare lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia confocale in diretta di sviluppare Arabidopsis fiori. 

Video: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Ricerca

Genetica

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Biologia dello sviluppo

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un metodo semplice per l&#39;imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biologia

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Misurazione spaziale e temporale Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un metodo Versatile per il montaggio di Arabidopsis lascia per l'Imaging di time-lapse videomicroscopia

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

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Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Un metodo semplice per l'imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

Cella di analisi specifica di

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di

Misurazione spaziale e temporale Ca

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

Un metodo Versatile per il montaggio di Arabidopsis lascia per l'Imaging di time-lapse videomicroscopia