Name: application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
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Siamo grati per il sostegno finanziario della Fondazione Whitehall. Vorremmo ringraziare Samuel T. Kissinger per i preziosi commenti.

1. Impostazione del sistema <ol><li> Costruire l&#39;unità di controllo della pressione. <ol><li> Montare l&#39;unità di controllo della pressione in base alla mappa del circuito ( Figura 1 ). Saldare le parti necessarie sul circuito stampato (PCB) realizzato secondo gli schemi dei circuiti elettrici ( figura 1b ). Utilizzare resistori standard, LED, transistori campo-effetto (Semiconductor Metal-Oxide Semiconductor), condensatori e connettori (vedi tabella dei materiali ). Le elettrovalvole a saldare sul PCB. Collegare il sensore della pompa dell&#39;aria e della pressione dell&#39;aria al PCB con filo elettrico. NOTA: Dovrebbe impiegare circa 2 ore per costruire l&#39;unità di controllo pressione con tutte le parti necessarie messe a disposizione. </li></ol></li><li> Collegare la scheda di acquisizione dati secondaria (DAQ). <ol><li> Collegare le uscite dei dati dalla scheda a circuito stampato alla scheda DAQ, seguendo la tabella 1 . NOTA: La scheda DAQ wilSto eseguendo in modalità &quot;Single-ended&quot;. La mappa del porto può essere trovata nel manuale dell&#39;utente (vedi tabella dei materiali ). </li><li> Collegare &quot;AIn Pr S&quot; ad uno dei canali di ingresso analogico (AI) e &quot;R-Gr&quot; a uno dei motivi analogici della scheda secondaria DAQ. </li><li> Collegare l&#39;uscita primaria dall&#39;amplificatore a uno dei canali AI e il suolo al terreno analogico della scheda secondaria DAQ. NOTA: È possibile utilizzare un cavo BNC standard per collegare l&#39;uscita primaria dall&#39;amplificatore. </li><li> Strip l&#39;altra estremità e collegare il segnale positivo ( cioè il rame) al canale AI e al suolo ( cioè il filo sottile intorno al nucleo) al suolo analogico. Ripetere questo passaggio per un secondo canale se viene utilizzato più canali patch. NOTA: L&#39;ingresso analogico alla scheda DAQ verrà configurato in passaggi successivi. </li><li> Collegare l&#39;alimentazione alla potenza della scheda DAQ secondaria. Utilizzare un potere separato da 12 V cosìPer la pompa. </li></ol></li><li> Collegare il tubo. <ol><li> Collegare la pompa dell&#39;aria e le due valvole secondo la Tabella 2 . Utilizzare un connettore a 3 vie per collegare il tubo morbido dalla porta superiore valvola 2, dal sensore di pressione e dal porta pipetta nell&#39;ultimo passaggio. </li><li> Aggiungere un altro connettore a 3 vie al tubo collegato al porta pipetta se si usano due pipette. Passare manualmente tra le valvole e le pipette in uso durante la patch. </li></ol></li><li> Installare Autopatcher IG. NOTA: Requisiti di sistema: Autopatcher IG è stato testato solo su un PC con Windows 7. Non è stato convalidato per altri sistemi operativi. La procedura descritta si applica specificamente all&#39;hardware elencato nella tabella dei materiali. <ol><li> Scarica Autopatcher-IG da GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Installare Python (vedere la tabella dei materiali per la versione e l&#39;indirizzo di download). </li><li> Disinstallare PyQt4Digitando &quot;pip disinstalla PyQt4&quot; in un terminale di riga di comando. NOTA: il sistema utilizza una versione precedente della libreria PyQt4 per ottenere la compatibilità con le librerie Qwt e Opencv. </li><li> Installare le librerie Python dai file delle ruote storiche (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Trovare i seguenti file: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Per installare i file ruota, passare alla directory dove vengono salvati i file e digitare &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl.&quot; Sostituisci &quot;*** wheelfilename ***&quot; con il nome effettivo del file. NOTA: &quot;cp27&quot; nel nome del file ruota indica Python 2.7 e &quot;win32&quot; indicano Windows a 32 bit. Se &quot;win32&quot; non funziona, prova &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Per controllare la telecamera CCD, scaricare e installare il programma di installazionePer 64 bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Quindi scaricare MicroManager per 64 bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) per controllare la fotocamera in Python. </li><li> Per controllare i manipolatori e la fase del microscopio, installare il software di controllo fornito dal produttore. NOTA: In questo modo viene installato anche il driver necessario per controllare i manipolatori. Il pacchetto di installazione è comunemente fornito in un CD-ROM. </li><li> Per controllare la scheda secondaria DAQ, installare la libreria universale dal CD-ROM, purché l&#39;acquisto della scheda DAQ. </li></ol></li><li> Configurare l&#39;hardware per Autopatcher IG. <ol><li> Collegare lo stadio del microscopio e i manipolatori al computer tramite le porte USB. </li><li> Assegnare i numeri di porta COM all&#39;unità 0: stadio microscopio, unità 1: manipolatore sinistro e unità 2: manipolatore destro, in questo ordine, nel file di configurazione &quot;ports.csv&quot; nella cartella &quot;configurazione&quot;. LEva gli altri parametri nel file ports.csv ( cioè &quot;SCI&quot; ​​e &quot;1&quot;) invariati. NOTA: Le informazioni sul numero di porta COM possono essere trovate eseguendo il software di configurazione del manipolatore fornito dal produttore. Vai alla scheda &quot;Impostazioni&quot;, seleziona &quot;Impostazioni&quot; e la pagina &quot;Movimento&quot; e leggi le etichette per ogni scheda in alto. In alternativa, queste informazioni possono essere trovate nel PC Device Manager. </li><li> Assegnare numeri di canale di ingresso analogico sulla scheda DAQ per un sensore di pressione e il canale di patch 1 e 2 (corrispondente all&#39;unità 1 e 2). Immettere il numero del canale nel file &quot;DAQchannels.csv&quot; nella cartella &quot;configurazione&quot;. NOTA: Si consiglia di aprire i file .csv con l&#39;applicazione Notepad anziché un foglio di calcolo, in quanto potrebbe modificare le informazioni quando si salva le modifiche. </li></ol></li><li> Esegui Autopatcher IG. <ol><li> Accendere l&#39;amplificatore, il controllore del microscopio e il regolatore del manipolatore. EnsuChe il software dell&#39;amplificatore è in esecuzione. </li><li> Eseguire l&#39;Autopatcher IG con Python da un terminale di riga di comando come segue: prima, cambiare la directory (comando &quot;cd&quot; per i terminali più comuni) in cui è installato Autopatcher IG, digitare &quot;Python Autopatcher_IG.pyw&quot; nel terminale di riga di comando e premere &quot;Tasto Invio. NOTA: Non eseguire il software di controllo del manipolatore prima di eseguire Autopatcher IG perché occuperà lo stadio e il manipolatore del microscopio, causando che Autopatcher IG non riesce a trovare l&#39;hardware. Il software di controllo del manipolatore può essere eseguito dopo che Autopatcher IG è completamente avviato se ci sono ulteriori moduli da controllare ( ad esempio, il riscaldatore in linea). </li></ol></li><li> Calibrare la pipetta primaria. <ol><li> Tirare le pipette patch come descritto in precedenza 9 . Riempire una pipetta di vetro tirata con soluzione interna e caricarla sul piano di testa. NOTA: Le pipette vuote di vetro hanno diversi contrasti sottoIl microscopio e può portare a una calibrazione imprecisa. </li><li> Spostare la punta della pipetta nel campo visivo del microscopio e metterlo in messa a fuoco. Se il quadrante è utilizzato per spostare i manipolatori e / o lo stadio microscopico, aggiornare le coordinate premendo &quot;z&quot; sulla tastiera. NOTA: Questa azione non è necessaria se la tastiera (stadio microscopico: asse A / D - x, asse W / S - y, asse R / F - z, manipolatori: H / K - asse x, U / J - asse Y, O / L - asse z, 1/2 - numero di unità) viene utilizzato per controllare il movimento perché le coordinate saranno aggiornate in tempo reale. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avvia calibrazione&quot; sull&#39;interfaccia grafica utente grafica (GUI) per l&#39;unità corrispondente su cui è caricata la pipetta ( Figura 2 ). NOTA: una finestra popup apparirà quando la calibrazione è terminata. NOTA: La calibrazione verrà eseguita automaticamente, che richiede circa 3,5 min. Cliccando sullo stesso pulsante (ora commutato per &quot;annullare la calibrazione&quot; afTer avviare la calibrazione) interromperà il tentativo di calibrazione. </li><li> Salvare la calibrazione facendo clic su &quot;salva la calibrazione&quot; nella parte inferiore della GUI principale (salva la calibrazione corrente per entrambi i manipolatori e può essere caricata in futuro). NOTA: Il campo visivo in basso (4 o 10 volte) e alto (40x) deve essere allineato per la calibrazione secondaria per funzionare correttamente. Fare riferimento al manuale d&#39;uso del sistema ottico in uso per le procedure di allineamento. </li></ol></li></ol> 2. Procedura di morsetto automatico di patch <ol><li> Preparare le fette acute del cervello, come descritto in precedenza 10 . </li><li> Preparare pipette di vetro per il morsetto patch. </li><li> Posizionare una fetta del cervello al centro della camera di registrazione. Stabilizzare la fetta con una fetta tenere premuta, o &quot;arpa&quot;. </li><li> Rileva la cella fluorescente. <ol><li> Trova l&#39;area di interesse sotto la lente 4X. Spostare la fase del microscopio accendendo il tasto cliCk-to-move (&quot;CTM&quot;) e fare clic sul centro dell&#39;area di interesse. In alternativa, utilizzare la tastiera per spostare la fase del microscopio (asse A / D - x, asse W / S - y, asse R / F - z). </li><li> Passare all&#39;obiettivo ad alto ingrandimento e regolare la messa a fuoco spostando il microscopio nell&#39;asse z, usando R / F sulla tastiera. NOTA: Si consiglia di regolare il livello del bagno d&#39;acqua in modo che il piano focale sotto le lenti a basso e alto ingrandimento siano uguali o simili nell&#39;asse z. </li><li> Fai clic sul pulsante &quot;Rileva cella&quot; nella colonna GUI principale, &quot;Unità 0.&quot; Se il LED o la sorgente luminosa laser dell&#39;impostazione non può essere controllata dal segnale TTL, accendere manualmente il LED / laser; Apparirà una finestra pop-up quando il rilevamento delle celle è terminato. <ol><li> Spegnere il LED / laser se necessario; Un elenco delle coordinate delle celle apparirà nella GUI &quot;Posizioni di memoria&quot;. Rimuovi le cellule indesiderate dall&#39;elenco facendo clic sul pulsante &quot;X&quot; accanto alle coordinate. </li><li>In alternativa, se le celle di destinazione non sono etichettate in fluorescenza, fare clic su &quot;Modalità mouse&quot; nella GUI principale. Clicca sulla cella di interesse; Sulla cella apparirà un punto giallo con un numero e le coordinate della cella appariranno nella GUI &quot;Posizioni di memoria&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibrare la pipetta secondaria. <ol><li> Riempire 1/3 di una pipetta di vetro con soluzione interna. Caricare la pipetta sul supporto della pipetta attaccato allo stadio della testa. </li><li> Utilizzare l&#39;obiettivo a basso ingrandimento. Portare la pipetta nel campo visivo e regolare la messa a fuoco usando la tastiera (H / K - asse x, asse U / J - y, asse O / L - z). Usare &quot;1&quot; e &quot;2&quot; per passare dall&#39;unità 1 all&#39;unità 2. </li><li> Caricare la calibrazione primaria facendo clic su &quot;Carica calibrazione&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Calibrazione secondaria&quot; nella GUI principale sotto l&#39;unità in uso. Ad esempio, se l&#39;unità 2 è in uso, fare clic sul pulsante &quot;Calibrazione secondaria&quot; nell&#39;unità &quot;Unit 2&quot;lumn. Seguire le istruzioni della finestra popup per passare all&#39;obiettivo ad alta magnificazione. </li></ol></li><li> Patch una cella di destinazione. <ol><li> Assicurarsi che il software &quot;MultiClamp&quot; (ad es. Amplificatore) sia in esecuzione. Fare clic sul pulsante &quot;Controllo patch&quot; per aprire la GUI &quot;Patch control&quot;; Potrebbe richiedere fino a pochi minuti per aprire questa GUI. </li><li> Utilizzare l&#39;obiettivo di ingrandimento 40X controllando &quot;40X&quot; nella colonna principale dell&#39;unità &quot;Unit 0&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;vai a&quot; accanto alla cella di interesse nell&#39;elenco di coordinate nella GUI &quot;Posizione memoria&quot;; Il microscopio si sposterà verso la cella. </li><li> Fare clic sul pulsante CTM dell&#39;unità in uso nella GUI principale per abilitare il movimento dopo un clic del mouse. Clicca sulla cella di interesse; La punta della pipetta si sposterà nella cella. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Patch&quot; sulla GUI &quot;Patch control&quot;. NOTA: L&#39;avvio automatico avrà inizio e la pressione e la resistenza possono essere monitoratiLa GUI &quot;Patch control&quot;. <ol><li> Usare il pulsante &quot;Unit 1 selected&quot; per commutare il segnale di ingresso tra le due unità. NOTA: Il sistema si avvicinerà alla cella di destinazione, applica una pressione negativa, corrisponde al potenziale della membrana cellulare e rileva la formazione gigaseale basata su una serie di soglie di pressione e di resistenza e di logica. </li><li> Manipolare il processo automatico in qualsiasi momento facendo clic sui rispettivi pulsanti sulla GUI &quot;Controllo patch&quot;. Ad esempio, fare nuovamente clic sul pulsante &quot;Patch&quot; per annullare la prova di patch e fare clic su &quot;Prossima tappa&quot; per avanzare il processo di patching al passaggio successivo, indipendentemente dalla soglia. NOTA: Una finestra pop-up notificherà all&#39;utente quando si è formata una gigaseal e verrà presentata l&#39;opzione di applicare zap e una grande pressione negativa. </li></ol></li><li> Selezionare &quot;Sì&quot; per interromperla con zap e aspirazione combinata. In alternativa, selezionare &quot;No&quot; per rompersi solo con aspirazione. <br/&gt; NOTA: quando una riuscita patch di celle intero è completata, una finestra a comparsa ricorda all&#39;utente di salvare il log di patch di esperimenti. </li><li> Salva il registro patch di esperimenti. NOTA: se una prova di patch non è riuscita, una finestra popup informerà l&#39;utente e il processo di patch verrà ripristinato. </li><li> Tornate al punto 2.4 e ripetete i passaggi con una cella diversa. </li></ol></li><li> Raffinare le soglie di patch (opzionale). NOTA: Soglie per la resistenza iniziale della pipetta, pressione positiva e negativa, resistenza gigaseale, ecc . Può essere modificato da un file di configurazione. <ol><li> Aprire il file &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; nella cartella &quot;Configurazione&quot; nella destinazione in cui è installato il sistema. Modificare i numeri corrispondenti a ciascun valore di soglia. Non modificare i nomi dei valori; Ciò comporterà voci non riconoscibili nel sistema. </li><li> Attenersi immediatamente ai nuovi valori di soglia premendo &quot;CtRl + L &quot;senza riavviare il programma; il riavvio del programma implementerà il nuovo valore di soglia dal file. </li></ol></li></ol> 3. Effettuare le registrazioni NOTA: la modalità nell&#39;amplificatore microelettrodo controllato dal computer verrà impostata automaticamente su &quot;Current Clamp&quot; (&quot;IC&quot;) dal software di autopatcher una volta ottenuta una patch di successo. Le registrazioni a morsetto delle patch intere cellule possono essere eseguite usando il software di registrazione di scelta (questo sistema non include una funzione di registrazione). Se sono state identificate più celle di destinazione, dopo aver terminato una registrazione, tornare al passaggio 2.4 e provare un&#39;altra cella. <ol><li> Eseguire esperimenti automatici di applicazione di farmaci locali utilizzando un picospritzer (opzionale). NOTA: Qui viene utilizzato un esperimento di applicazioni locali di droga come esempio per descrivere come utilizzare la funzione &quot;Sequenza di comando&quot; aggiuntiva per controllare l&#39;hardware esterno tramite i segnali TTL. <ol><li> Collegare la porta A chaNnel 0 e il terreno sulla scheda DAQ secondaria all&#39;ingresso di trigger trigger sul digitizzatore utilizzando un cavo BNC spogliato (come descritto nel punto 1.2.3). Collegare un canale di uscita digitale sul digitizzatore al trigger esterno sul picospritzer. </li><li> Preparare il picospritzer secondo il manuale dell&#39;utente. Collegare l&#39;uscita dell&#39;aria picospritzer al supporto della pipetta di droga collegato ad un micromanipolatore. </li><li> Caricare una pipetta piena di un farmaco scelto. Fissarlo al porta pipetta. Calibrare la pipetta, come descritto nel punto 1.7. </li><li> Dopo aver patchato una cella come descritto al passaggio 2.6, selezionare la posizione desiderata per la somministrazione di droga cliccando con il mouse nella GUI della visualizzazione della fotocamera in &quot;modalità mouse&quot; (commutata dalla GUI principale). In alternativa, utilizzare la GUI &quot;Griglia&quot; per progettare una griglia, con ogni pixel della griglia come una delle destinazioni di destinazione. NOTA: la griglia può essere manipolata nella GUI della visualizzazione della telecamera trascinandola con il mouse. </li><li> Nella sezione &quot;Command SequClicca su &quot;carica punti mouse&quot; o &quot;punti di griglia di carico&quot; per importare tutte le coordinate per la consegna della droga. <ol><li> Fare clic su ogni voce di coordinate per modificare il segnale specifico TTL di comando nella colonna di destra. Nella prima voce di comando, fare clic sulla cifra più a destra per spostarla da &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, inviando un segnale TTL + 5 V. Impostare il tempo (T) alla durata del segnale TTL desiderato, in ms. </li><li> Nella seconda voce di comando, impostare tutte le cifre su &quot;0&quot; e impostare T sulla durata della lunghezza di registrazione della prova. Modifica comandi per tutte le voci di coordinate. Aggiungere le voci di comando facendo clic su &quot;+&quot; se sono necessari più segnali TTL. NOTA: I bit a 8 cifre rappresentano i canali A di porta 0-7 sul DAQ secondario (le porte 1 - 3 sono occupate dalla pompa e da due valvole), se necessario, può essere commutato. </li></ol></li><li> Creare così un protocollo di registrazione nel modulo di acquisizione datiChe l&#39;avvio di una spazzata viene attivato dal trigger di avvio esterno. Modificare il protocollo per consegnare il farmaco all&#39;ora desiderata. </li><li> Nella GUI &quot;Comando Sequenza&quot;, fai clic su &quot;Esegui&quot; a sinistra per eseguire tutte le coordinate. In alternativa, fai clic su &quot;Esegui&quot; a destra per eseguire solo la sequenza selezionata. NOTA: la pipetta si sposterà ad ogni coordinata ed esegue il segnale TTL come definito per avviare la registrazione. </li></ol></li></ol>

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Una domanda di brevetto non provvisorio &quot;SISTEMI E METODI PER L&#39;ELETTROFISIOLOGIA DI PATCH CLIP ELETROFISIOLOGICO AUTOMATICO GUIDATA IN VITRO&quot;, US N ° di serie: 15 / 353,719, è stata depositata il 16 novembre 2016, rif. N. PRF 67270-02.

Qui descriviamo un metodo per le registrazioni automatiche delle morsetti di patch guidate dall&#39;immagine in vitro . I passi chiave di questo processo sono riepilogati come segue. Innanzitutto, la visione informatica viene utilizzata per riconoscere automaticamente la punta della pipetta usando una serie di immagini acquisite tramite un microscopio. Queste informazioni vengono poi utilizzate per calcolare la funzione di trasformazione delle coordinate tra il microscopio ei sistemi di coordinate del manipolat...

La tecnica della pinzetta patch è stata sviluppata da Neher e Sakmann negli anni &#39;70 per studiare i canali ionici delle membrane eccitabili 1 . Da allora, il bloccaggio della patch è stato applicato allo studio di molti soggetti diversi a livello cellulare, sinaptico e a livello di circuito sia in vitro che in vivo, in diversi tipi di cellule, inclusi neuroni, cardiomiociti, oociti Xenopus e liposomi artificiali 2 . Questo processo prevede la corretta identificazione e il targeting di una cella di interesse, il controllo di micromanipulatore intricato per spostare la pipetta patch in prossimità della cella, l&#39;applicazione di una pressione positiva e negativa alla pipetta nel momento giusto per stabilire una patch gigasea stretta, E un break-in per stabilire una configurazione di patch di cellule intere. Il bloccaggio delle patch viene tipicamente eseguito manualmente e richiede un&#39;estesa formazione per il master. Anche per un ricercatore esperto con la patchMorsetto, il tasso di successo è relativamente basso. Più recentemente, sono stati fatti diversi tentativi per automatizzare gli esperimenti di patch-clamp. Due strategie principali si sono evolute per realizzare l&#39;automazione: aumentando le apparecchiature standard di bloccaggio delle patch per fornire il controllo automatico del processo di patching e la progettazione di nuove attrezzature e tecniche dal punto di vista fondamentale. L&#39;ex strategia è adattabile all&#39;hardware esistente e può essere utilizzata in una varietà di applicazioni di morsetti di patch, tra cui in vivo patch morsetto patch 3 , 4 , 5 in vitro di patch patch di cervelli acuti, colture organotipiche di fetta e neuroni dissocati coltivati 6 . Permette l&#39;interrogazione di circuiti locali complessi utilizzando simultaneamente più micromanipulatori 7 . Il metodo di patch pianistico è un esempio della nuova strategia di sviluppo, che può raggiungere l&#39;elevato throughput simultaneo pMorsetto di cellule in sospensione per scopi di screening dei farmaci 8 . Tuttavia, il metodo di patch planare non è applicabile a tutti i tipi di cellule, in particolare i neuroni con lunghi processi o circuiti intatti che contengono collegamenti estesi. Questo limita la sua applicazione alla mappatura dei circuiti intricati del sistema nervoso, che è un vantaggio fondamentale della tecnologia tradizionale patch clamp. Abbiamo sviluppato un sistema che automatizza il processo di morsetto di patch in vitro incrementando l&#39;hardware standard di patch clamp. Il nostro sistema, Autopatcher IG, fornisce la calibrazione automatica delle pipette, l&#39;identificazione del bersaglio a fluorescenza, il controllo automatico del movimento delle pipette, la patch automatica delle cellule intere e la registrazione dei dati. Il sistema può acquisire automaticamente più immagini di fette del cervello a diverse profondità; Analizzarli usando la visione del computer; E estrarre informazioni, incluse le coordinate delle cellule etichettate con fluorescenza. Queste informazioni possono essere alloraUtilizzati per mirare e bloccare automaticamente le celle di interesse. Il software è scritto in Python - un linguaggio di programmazione gratuito e aperto - utilizzando diverse librerie a sorgenti aperte. Ciò assicura la sua accessibilità ad altri ricercatori e migliora la riproducibilità e il rigore degli esperimenti di elettrofisiologia. Il sistema ha un design modulare, in modo tale che gli hardware aggiuntivi possano essere facilmente interfacciati con l&#39;attuale sistema dimostrato qui.

<table><tbody><tr><td>CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &amp;ldquo;Linlab2&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>computer-controlled microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm wavelength</td></tr><tr><td>Data acquisition board</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ.&lt;br/&gt; See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Solenoid valves</td><td>The Lee Co.</td><td>LHDA0531115H</td><td></td></tr><tr><td>Air pump</td><td>Virtual industry</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Air pressure sensor</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>version 2.7 (32-bit for windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Screw Terminals</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)</td></tr><tr><td>(2-Pin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Channel MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Red 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Green 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Locking Male x Female x Female Stopcock</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Outer Diameter: 1/8 in.&lt;br/&gt; Inner Diameter: 1/16 in.</td></tr><tr><td>BNC male to BNC male coaxial cable</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

Il morsetto di patch a cellule intere è il metodo standard gold per misurare le proprietà elettriche delle singole cellule. Tuttavia, il morsetto di patch in vitro rimane una tecnica impegnativa e di bassa produttività grazie alla sua complessità e all&#39;alta dipendenza dal funzionamento e dal controllo da parte degli utenti. Questo manoscritto dimostra un sistema di bloccaggio automatico delle patch per le esperienze di morsetti di patch a cellule in vitro in fette acute del cervello. Il nostro sistema implementa un algoritmo basato su visione informatica per rilevare le celle con etichette fluorescenti e per indirizzarle per la patch completamente automatica usando un micromanipulator e un controllo interno della pressione della pipetta. L&#39;intero processo è altamente automatizzato, con requisiti minimi per l&#39;intervento umano. Le informazioni sperimentali in tempo reale, tra cui la resistenza elettrica e la pressione interna della pipetta, sono documentate elettronicamente per analisi futura e per ottimizzazione a diversi tipi di cellule. Anche se il nostro sistema è descritto nel contesto di brai acutiN può essere applicato anche alla messa a punto automatizzata di patch di neuroni dissociati, culture di fetta organotipica e altri tipi di cellule non neuronali.

<html> Il nostro sistema è stato testato sulla sua capacità di patch delle cellule in fette cerebrali acute, cellule staminali pluripotenti indotte da mouse (iPSCs) differenziate in neuroni e cellule HEK 293 artificialmente esprimendo canali di interesse. La Figura 3 mostra un esperimento che usa i topi transgenici Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) targeting neuroni piramidali strati 5 fluorescenti etichettati nella corteccia visiva. La...

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall&#39;immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.5K Views.  Purdue University.  Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall'immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro . 

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Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Ricerca

Neuroscienze

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

Stabilire una configurazione di voltage-clamp a cellula intera per registrazioni elettrofisiologiche in fette di cervello

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

Tecnica automatizzata di patch clamp guidata da immagini per lo studio dei neuroni nelle fette di cervello

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Source: Qi, G., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52358">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Paired Patch-Clamp ...

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

To place the multi-channel probe in the ex vivo brain tissue slide, perfuse bubbled experimental ACSF at three to six milliliters per minute, and transfer the brain slice containing the area of interest onto the mesh grid in the microscope perfusion chamber. Anchor the brain slice with a platinum harp. Rotate the mesh grid so that the line of electrode contacts on the distal end of the multichannel probe is approximately perpendicular to the PL surface.
Under broad-field illumination and fine control of the micromanipulator, lower the multichannel probe toward the surface of the slice. Engage the appropriate filter cube for visualization of the fluorescent reporter protein expressed in axon terminals of cortical afferents.
If necessary, rotate the slice to more precisely align the probe with the PL surface. Position the probe just above the plane of the slice, 200 micrometers short of the final target position along the x-axis, leaving at least one channel outside of the area of tissue being recorded. Slowly, insert the probe into the slice along its longitudinal axis.
To minimize damage to the tissue, only advance the probe to the extent that the sharp tips are just visible below the tissue surface. Switch experimental ACSF source to bagged control solution, and identify the fluorescently labeled cell for targeted patch-clamp recording. Restrict the aperture to the smallest diameter, and engage the high-power water-immersion objective, taking care to avoid contact between the multichannel probe and objective lens. Bring the tissue into focus.
Center the light over an area of tissue adjacent to, but not overlapping the multi-channel probe. Engage the appropriate filter set to allow imaging of cells expressing the Cre-dependent fluorescent marker. Raise the objective lens to create ample space for lowering a patch pipette.
Load a patch pipette with internal solution and mounted on the electrode holder. Use a one-milliliter syringe to apply positive pressure corresponding to approximately 0.1 milliliter air. Lower the patch pipette into the solution, bringing the tip into focus under visual guidance, and obtain whole-cell recording from the targeted cell.