Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;UNITATIVO NAZIONALE DI ARTHRITIS e MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES (R01AR069653 a Zhang LJ) e presso gli Istituti Nazionali di Sostegno alla Salute (5T32AR062496-03 a CA).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali UCSD. 1. Isolamento e coltura primaria del KC del mouse dalla pelle neonatale <ol><li> Sacrifica il giorno dopo-natalizio 0-2 neonati del ceppo C57B / 6 del mouse selvatico da decapitazione con forbici. Tagliare gli arti appena sopra le articolazioni del polso e della caviglia, poi tagliare completamente la coda, lasciando un piccolo foro. </li><li> Per sbucciare tutta la pelle, prima inserire forbici affilate attraverso il foro alla coda e tagliare la pelle lungo la linea mediana dorsale del corpo fino all&#39;apertura sul collo. Quindi, utilizzare una pinza per afferrare il corpo esposto e l&#39;altra pinza per afferrare la pelle e sbucciare delicatamente tutta la pelle dal corpo e sopra le gambe delle gambe con un solo movimento continuo. <ol><li> Scorri la pelle come un pezzo intatto e fai attenzione a non rompere la pelle in pezzi, in quanto ciò comporterà perdite di cellule durante la fase di dispersione. </li></ol></li> &lt;Li&gt; Sciacquare la pelle pelata con 15 ml di PBS sterile in un piatto di Petri da 10 cm e quindi posizionare la pelle da ogni cucciolo in un tubo da 2 ml riempito con tampone di digestione di dispersione a ghiaccio a ghiaccio, che contiene 4 mg / ml di dispersa nel mezzo di crescita KC (KC mezzo basale trovi 0.06 mM CaCl 2, DG e antibiotici / antimicotici). NOTA: Gli isolati di pelle multipli possono essere combinati e incubati in un tubo da 15 ml (fino a 5 pelli per tubo) contenenti 12 ml di soluzione di dispersione. Incubare il tubo della pelle durante la notte in un frigorifero di 4 ° C su un rotatore. <ol><li> Assicurarsi che la pelle non sia piegata nel tubo poiché ciò comporterà un&#39;esposizione insufficiente della regione piegata alla soluzione di dispersione. </li></ol></li><li> Il giorno successivo (dopo 12-18 h in dispersione), trasferire la pelle insieme alla soluzione di dispersione in un piatto di Petri. Trasferire ogni pezzo di tessuto a un nuovo piatto di Petri con 15 ml di sterile PBS per lavare l&#39;eccesso di dispersione. </li><li> Utilizzando due coppie di pinze, afferrare la pelle da PBS,Sollevare la pelle e trasferirsi in un nuovo piatto di Petri con il lato epidermico verso il basso e il lato del derma verso l&#39;alto. Stendere con attenzione la piega della pelle in modo che sia completamente estesa sul piatto di Petri. </li><li> Porre 500 μL di una soluzione di digestione a base di tripsina per ogni pelle in un nuovo piatto di Petri. Usando le pinze, lentamente sollevate il derma e lontano dall&#39;epidermide, tenendo l&#39;epidermide verso il basso. Smaltire il derma come materiale biochimico. Trasferire l&#39;epidermide separata e fluttuare su ogni goccia di soluzione di tripsina con lo strato basale verso il basso. <ol><li> Se l&#39;epidermide è piegato sulla soluzione della tripsina, rimuovere le pieghe usando le pinze per assicurare una digestione efficiente di KC basali dall&#39;epitelio. </li></ol></li><li> Incubare la pelle su un piatto di Petri nella soluzione di trysina a temperatura ambiente (con coperchio coperto) su un agitatore orizzontale con agitazione leggera per 20 minuti. </li><li> Aggiungere 2 ml di supporto di crescita KC supplementare per epidermide (circa 1 pollice per dimensione perEpidermide) al piatto di Petri. Afferrare l&#39;epidermide usando le pinze, e strofinare con forza l&#39;epidermide avanti e indietro per rilasciare singole cellule dal foglio epidermico. <ol><li> Osservare il mezzo girare sempre più torbido come le cellule sono staccati dall&#39;epidermide. Inclinare il piatto di Petri per raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo lasciando il foglio epidermico rimanente sul piatto. </li></ol></li><li> Ripetere ancora due volte lo sfregamento del foglio epidermico dopo aver aggiunto 2 ml di mezzo di crescita KC e combinare le sospensioni cellulari nello stesso tubo. </li><li> Pipettare la soluzione cellulare sollevandola dolcemente e brevemente per rompere qualsiasi grumo cellulare utilizzando la pipetta serologica appropriata, quindi passare attraverso un filtro da 100 μm ad un nuovo tubo centrifuga da 50 ml. </li><li> Centrifugare le cellule filtrate per 5 min a 180 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e riposizionare delicatamente il pellet di cellula in 1 ml di freddo medium di crescita KC / epidermide. </li><li> Conte le cellule da un emocitometro. <br/&gt; NOTA: i KCs possono differenziarsi spontaneamente in sospensione, per cui le cellule devono essere placcate il più presto possibile dopo l&#39;isolamento per garantire le prestazioni ottimali delle cellule. Si consiglia di posizionare le celle sul ghiaccio mentre contando in quanto ciò ridurrà la velocità di differenziazione spontanea di KC. </li><li> Seme le cellule ad una densità di 5 x 10 4 / cm 2 in mezzo di crescita KC in piatti di coltura pre-rivestiti con un prodotto di matrice extracellulare (ECM) che promuove l&#39;attaccamento cellulare. NOTA: Utilizziamo un prodotto commerciale disponibile (ad es. Fattore di attacco, che è un materiale di rivestimento a base di gelatina (cfr. La tabella dei materiali per dettagli). Le cellule sono state coltivate in incubatore umidificato con 5% CO 2 a 37 ° C Rifornito ogni altro giorno. <ol><li> Per il rivestimento, rivestire i piatti di coltura con il materiale di rivestimento di fissaggio cellulare riscaldato a temperatura ambiente per 10 minuti fino a 2 ore prima della chiusura delle cellule. Rimuovere il fattore di attacco poco primaAggiungendo la sospensione cellulare. </li></ol></li><li> Cambiare il supporto 24 ore dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non collegate e modificare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle non raggiungono la confluenza desiderata prima dell&#39;esperimento. </li></ol> 2. Isolamento primario del mouse KC dalla pelle adulta della coda <ol><li> Sacrificare un adulto C57BL / 6 mouse (preferibilmente tra 6 e 15 settimane di età, sia maschile che femminile) secondo le norme sulla struttura degli animali. Tagliare la coda dal corpo dalla base della coda e tagliare ~ 2 mm della punta della coda in modo che vi sia un foro visibile alla punta. </li><li> Per sbucciare la pelle della coda, utilizzare prima una lama tagliente per tagliare la pelle della coda dalla base alla punta della coda. Successivamente, utilizzare una pinza per afferrare l&#39;osso della coda esposto e l&#39;altra pinza per afferrare la pelle e sbucciare delicatamente la pelle della coda dall&#39;osso con un movimento continuo. Tagliare la pelle pelata dalla linea mediana in modo che ogni pezzo sia inferiore a 2-3 cm. </li><li> Sciacquare la pelle sbucciataH 15 ml di PBS sterile in un piatto di Petri da 10 cm, quindi posizionare la pelle da ciascuna coda in un tubo da 2 ml riempito con tampone di digestione di dispersione a freddo di ghiaccio (4 mg / ml di dispersione nel mezzo di crescita KC). NOTA: È possibile combinare più pezze di pelle e incubare in un tubo da 15 ml (fino a 5 code per tubo) contenenti 12 ml di soluzione di dispersione. <ol><li> Incubare il tubo della pelle durante la notte in un frigorifero di 4 ° C su un rotatore. </li></ol></li><li> Eseguire le operazioni da 1.4 a 1.13 per isolare la sospensione a singola cellula dall&#39;epidermide della coda. </li><li> Seed le cellule adulte ad una densità di 10 x 10 4 / cm 2 (contato da un ematocitometro) in mezzo di crescita KC in piatti di coltura pre-rivestiti con collagene. NOTA: Utilizziamo un kit di rivestimento a base collagene disponibile sul mercato (vedere la tabella dei materiali per i dettagli). Le cellule sono state coltivate in incubatore umidificato con 5% di CO 2 a 37 ° C, e il mezzo fresco è stato rifornito ogni altro giorno. In generale, la cI piatti di ulture devono essere rivestiti con collageno per 30 minuti a 1 ora prima della semina delle cellule. Osserviamo che esiste un significativo aumento dell&#39;adesione adulti KC al piatto quando ricoperto di collagene rispetto al fattore di attacco, che è un materiale di rivestimento a base di gelatina. </li><li> Cambiare il supporto 24 ore dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non collegate e modificare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle non raggiungono la confluenza desiderata prima dell&#39;esperimento. </li></ol> 3. In vitro differenziazione di KC da High Calcium <ol><li> Per indurre il differenziamento terminale, aggiungere CaCl 2 a 0,2 mm nel terreno di coltura. </li><li> In alternativa, affamati i KC coltivati ​​durante la notte senza aggiunta di integratori di crescita in bassi bassi KC a basso contenuto di calcio prima dell&#39;aggiunta di alto calcio. NOTA: La fame di crescita del fattore di crescita migliorerà l&#39;impegno delle cellule alla differenziazione precoce e l&#39;induzione di marcatori di differenziazione precoce, come K10 5 </sup&gt;. </li></ol> 4. Irradiazione UVB Morte cellulare mediata e rilascio TNFa da KC <ol><li> Coltivare il mouse KCs nel mezzo di crescita KC (in incubatore umidificato con 5% di CO 2 a 37 ° C) con il cambio medio giornaliero fino a quando le cellule raggiungono confluenza. Immediatamente prima dell&#39;irraggiamento UVB, rimuovere il mezzo di crescita e sostituire con 500 μL di PBS. Quindi sottoporre le cellule a 25 mJ / cm 2 UVB o controllo falso (no UVB). NOTA: L&#39;irraggiamento UVB viene eseguito utilizzando lampade UVB portatili con due lampadine da 8 W (312 nm) come descritto in precedenza 10 . Dopo l&#39;irraggiamento UVB, PBS viene aspirato e viene aggiunto il mezzo fresco. </li><li> Misurare e quantificare la vitalità cellulare mediante il test di vitalità della cellula CCK-8 a 6, 8 e 24 h post-trattamento UVB seguendo l&#39;istruzione del produttore 11 . </li><li> Raccogliere il mezzo condizionato dai KC trattati con UVB nei punti di tempo desiderati e misurare la TNFa rilasciataNel mezzo condizionato dal kit Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA seguendo le istruzioni del produttore 7 , 12 . </li></ol>

<ol>
	<li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2++and+K++gradients+in+murine+epidermis:+quantitative+measurement+using+PIXE.">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li><li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis:+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry.">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li><li>Elias, P. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes.">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li><li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+cell+cycle+exit,+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes:+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals.">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li><li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;epidermide della pelle funziona come una barriera critica per separare e proteggere il corpo dall&#39;ambiente esterno e danneggiare la perdita di acqua, gli agenti patogeni, il calore e l&#39;irradiazione UV. I KC sono la linea di cellule predominante dell&#39;epidermide e la coltura primaria dei KC epidermici è uno strumento utile per studiare e comprendere i processi biologici della formazione delle barriere e la risposta di KC a insulti ambientali in vitro . Qui descrivia...

La pelle è l&#39;organo più grande del corpo con l&#39;epidermide come lo strato più esterno. L&#39;epidermide svolge un ruolo fondamentale nella formazione di una barriera epidermica intatta per separare il corpo dall&#39;ambiente, impedendo così la perdita di acqua e protegge dagli insulti ambientali, come gli allergeni, gli agenti patogeni e l&#39;esposizione UVB. L&#39;epidermide si sviluppa da un unico strato di cheratinociti basali (KCs) indifferenziati in un epitelio stratificato multistrato costituito da uno strato basale seguito da uno strato spinoso, uno strato granulare e uno strato corneo. I KC basali, costituiti da cellule staminali epidermiche e cellule di transito-amplificazione, sono proliferative e indifferenziate. Poiché i KC basali usciranno dal ciclo cellulare, le cellule si impegnano a differenziarsi e gradualmente migrare verso la superficie dell&#39;epidermide, accompagnate dalla maturazione delle giunzioni delle cellule cellulari e alla formazione di una barriera permeabilità epidermica (EPB). I KC nello strato spinoso esprimono la differenziazione precoceMarcatori ioni come Keratin 10 (K10); Mentre i KC migrano allo strato granulare, le cellule esprimono marcatori di differenziazione tardiva come Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). Allo strato corneo, i KCs diventano terminali corneociti differenziati, che vengono infine sparati attraverso la desquamazione quando le nuove cellule li sostituiscono. Il calcio è considerato l&#39;agente più fisiologico nell&#39;epidermide e provoca la differenziazione in vitro e in vivo in modo simile. Nell&#39;epidermide della pelle normale, gli ioni di calcio formano un caratteristico &quot;gradiente di concentrazione&quot;, aumentando la concentrazione verso la superficie della pelle 1 , 2 , 3 . La concentrazione di calcio sale da bassi livelli nei sottosuperfici più bassi (basi e spinosi) ad un picco dello strato granulare superiore e poi scende a livelli trascurabili nello strato più superficiale (strato corneo).<html> Il gradiente di calcio si sviluppa coincidente anche con l&#39;emergere di una barriera di permeabilità del componente, che sostiene che la segnalazione di calcio svolge un ruolo fondamentale della differenziazione del KC. In vitro , il basso contenuto di calcio (0,02-0,1 mM) mantiene la proliferazione dei KC basali come monostrato, mentre alto contenuto di calcio (&gt; 0,1 mM) induce un impegno rapido e irreversibile delle cellule alla differenziazione dei terminali come dimostrato dalla formazione di stretti giunti e dall&#39;induzione Di LOR e INV su un trattamento di calcio alto ai KC basali 4 , 5 . Oltre alla formazione di barriera, i KC epidermici sono anche una componente importante del sistema immunitario innato della pelle. In risposta agli agenti patogeni o agli schemi molecolari associati danneggiati (DAMP) rilasciati all&#39;irraggiamento o lesioni UVB, i KCs possono produrre grandi quantità di citochine infiammatorie, quali TNFα, IL6 e IFNβ, che portano all&#39;attivazione del sistema immunitario&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . Sebbene sia necessaria una corretta indicazione infiammatoria da KC per la clearance del patogeno, la risposta infiammatoria incontrollata può innescare lo sviluppo di malattie cutanee auto-infiammatorie, come la psoriasi e la rosacea 6 , 8 . Nel complesso, i KC svolgono un ruolo fondamentale nel mantenere la barriera cutanea intatta e iniziare una risposta immunitaria su invasione degli agenti patogeni o insulti ambientali. Pertanto, la cultura primaria di KC epidermici è una tecnica utile per studiare la biologia epiteliale, la differenziazione del KC, così come le risposte immunitarie innate di KC. L&#39;isolamento e la cultura di KC epidermici del mouse primario possono essere un processo impegnativo dovuto alla suscettibilità e alla sensibilità di KC a vari stimolanti esterni. Qui descriviamo un metodo per isolare e coltivare KC da una pelle al neonato o da un topoPelle adulta della coda del mouse. Per l&#39;isolamento adulto di KC non usiamo la pelle dorsale del mouse perché isolare quantità sufficienti di KC vitali da questo tessuto può essere difficile per i seguenti motivi: In primo luogo, la pelle dorsale adulta alla fase di riposo del ciclo dei capelli (telogen) è costituita da un Sottile epidermide con solo 1-2 strati di cellule, portando ad un rendimento a bassa cella e alla separazione inefficiente dell&#39;epidermide dal derma, che è il passo fondamentale per l&#39;isolamento di successo di KC. In secondo luogo, l&#39;elevata densità dei follicoli dei capelli presenti sulla pelle dorsale adulta contribuisce ulteriormente alla difficoltà di separare l&#39;epidermide dal derma. Al contrario, utilizziamo abitualmente la pelle della coda come sorgente per i topi adulti del KC, poiché questo epitelio è più spesso con 3-5 strati di KC epidermici. Ha anche una densità inferiore dei follicoli dei capelli, che non interferisce con la separazione epidermica, consentendo quindi l&#39;isolamento di KC da qualsiasi pelle adulta del cervello per adulti, indipendentemente dall&#39;età e dalla fase di ciclismo dei capelli del mouse. La neona isolataTal KCs vengono seminati a piatti di coltura rivestiti in gelatina, mentre i piatti rivestiti con collagene vengono impiegati per seminare KC adulti isolati a causa della capacità compromessa delle cellule adulte ad aderire rispetto alle loro controparti neonatali. Per la coltivazione del KCs del topo, il medium basico a basso contenuto di calcio è integrato con dGS, che contiene il fattore di crescita epidermico (EGF), il transferrin bovino, il fattore di crescita di insulina-like (IGF1), il prostaglandina E2 (PGE2), l&#39;albumina del siero bovino (BSA) e l&#39;idrocortisone. Tra 2-4 giorni dopo la placcatura iniziale, la maggior parte dei KC differenziati può essere lavata durante i cambiamenti medi giornalieri e le restanti cellule aderenti mostrano la tipica morbologia dei ciottoli 4 , si proliferano e non esprimono il marker di differenziazione precoce K10.

<table width="633">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="width:171px;height:100px;">C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td>
			<td style="width:177px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td style="width:167px;">Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">KC basal medium (EpiLife)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">MEPICF500</td>
			<td style="width:167px;">basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">Defined Growth Supplement (dGS)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S0125</td>
			<td style="width:167px;">defined growth supplements for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Dispase powder</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;">enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S006100</td>
			<td style="width:167px;">gelatin-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Coating Matrix</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">R011K</td>
			<td style="width:167px;">Collagen-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="width:171px;height:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">12604-013</td>
			<td style="width:167px;">A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">100 &#956;m Cell Strainer Nylon mesh</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">CCK-8 cell viability Kit</td>
			<td style="width:177px;">Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td>
			<td style="width:119px;">CK04-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:119px;">555268</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Corded Hand-Held UV Lamps</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">EB-280C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">8-watt UV tubes</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">BLE-8T312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Light Inverted Microscope for cell culture</td>
			<td style="width:177px;">ZEISS, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Axio Observer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX41</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

Il keratinocyte (KC) è il tipo di cellula predominante nell&#39;epidermide, lo strato più esterno della pelle. I KC epidermici svolgono un ruolo fondamentale nel fornire la difesa della pelle, formando una barriera cutanea intatta contro gli insulti ambientali, come l&#39;irradiazione UVB o gli agenti patogeni e anche avviando una risposta infiammatoria su tali insulti. Qui descriviamo metodi per isolare i KC dalla cute del neonato e dalla pelle adulta di coda del mouse. Descriviamo anche le condizioni di coltura usando gli integratori di crescita definiti (dGS) in confronto al siero bovino fetale chelexed (cFBS). Funzionalmente, dimostriamo che sia KC neonatali che adulti sono altamente reattivi per l&#39;alta calcio-indotta della differenziazione dei terminali, alla stretta formazione di giunzione e stratificazione. Inoltre, i KC adulti coltivati ​​sono suscettibili di morte cellulare causata da UVB e possono rilasciare grandi quantità di TNF dopo l&#39;irraggiamento UVB. Insieme, i metodi qui descritti saranno utili ai ricercatori per la messa a punto del modello in vitroS per studiare la biologia epidermica nel mouse neonatale e / o nel mouse adulto.

Elevata differenziazione terminale indotta da calcio di KC neonatali e adulti. Epidermico principale del mouse KC placcato e mantenuta a 0,06 mM CaCl 2 cresciuto come un monostrato, e singole celle aveva una forma poligonale con spazio intercellulare distinto, che mostra un aspetto di ciottoli quando confluenti (Figura 1A e Figura 2A). Aumento del CaCl 2 a 0,2 mM ha indotto un rapido cambia...

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell&#39;ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l&#39;isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell&#39;adulto, e l&#39;induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

isolation-culture-primary-mouse-keratinocytes-from-neonatal-adult

Research

JoVE Journal

Biology

30.4K Views.  UC San Diego.  I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l'isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell'adulto, e l'induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti. 

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...