이 연구는 내과학 연구소 (R01AR069653 to Zhang LJ)와 국립 보건원 (National Institute of Health Support) (5T32AR062496-03 to CA)에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 실험은 UCSD 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 신생아 피부로부터의 일차 마우스 KC 분리 및 배양 <ol><li> C57B / 6 wildtype 마우스의 출생 후의 0-2 신생아를 가위로 목을 베고 희생시킵니다. 손목과 발목 관절 바로 위의 팔다리를 잘라 낸 다음 작은 구멍을 남기고 꼬리를 완전히 잘라냅니다. </li><li> 전체 피부를 벗기기 위해서는 먼저 날카로운 가위를 꼬리 부분의 구멍을 통해 삽입하고 몸의 등쪽 중간 선을 따라 피부를 목에있는 구멍으로 자릅니다. 다음으로, 한 포셉을 사용하여 노출 된 몸체와 다른 포셉을 잡고 피부를 잡아 당기고 몸 전체의 피부를 부드럽게 껍질을 벗기고 다리 운동을하면서 하나의 연속 동작으로 껍질을 벗깁니다. <ol><li> 손상되지 않은 부분으로 피부를 떼어 내고 피부를 부러지지 않도록주의하십시오. 그러면 디스펜스 단계에서 세포가 손실 될 수 있습니다. </li></ol></li> &lt;li&gt; 10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML로 벗겨 피부를 씻어 다음 KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase를 포함 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼로 가득 2 ML 튜브에 각 강아지의 피부를 놓으십시오 (KC 기초 배지는 0.06 mM의 CaCl2를, DGS, 및 항생제 / 항진균제를 갖는다). 참고 : 다중 피부 분리 물을 혼합하여 12 mL 디스펜스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 스킨)에서 배양 할 수 있습니다. 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어. <ol><li> 피부가 접히지 않도록주의하십시오. 접힌 부위가 dispase 용액에 충분히 노출되지 않습니다. </li></ol></li><li> 다음날 (12-18 시간 후) 디스 페아 제 용액과 함께 피부를 페트리 접시에 옮기십시오. 여분의 dispase 멀리 씻어 15 ML 멸균 PBS와 새로운 페트리 접시에 각 조직 조각을 전송하십시오. </li><li> 포셉의 두 쌍을 사용하여, PBS에서 피부를 파악,피부를 들어 올리고 표피면을 아래로하고 진피면을 위로하여 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 조심 스레 피부 주름을 스트레치하여 페트리 접시에서 완전히 확장되도록하십시오. </li><li> 새로운 페트리 접시에 각 피부에 대한 트립신 기반 소화 솔루션 500 μL를 놓으십시오. 겸자를 사용하여 천천히 표피를 아래로 들어 올리면서 표피를 들어 올리십시오. 진피를 생물학적 위험 물질로 폐기하십시오. 분리 된 표피를 옮기고 기본 층이 아래쪽에있는 트립신 용액의 각 방울에 부유시킨다. <ol><li> 표피가 트립신 솔루션에 접혀 있다면, 상피에서 기본 KCs의 효율적인 소화를 보장하기 위해 집게를 사용하여 모든 주름을 제거합니다. </li></ol></li><li> 20 분 동안 온화한 교반과 수평 쉐이크에 실온 (뚜껑을 덮은 상태로) 트립신 솔루션의 페트리 접시에 피부를 품어. </li><li> 표피 당 보충 된 KC 성장 배지 2 mL를 첨가한다.표피)를 배양 접시에 첨가 하였다. 겸자를 사용하여 표피를 잡고 앞뒤로 활발히 표피를 문질러 표피 시트에서 단일 세포를 릴리스하십시오. <ol><li> 세포가 표피에서 분리되면 서서히 흐려지는 것을보십시오. 페트리 접시를 기울여 접시에 남아있는 표피 시트를 떠나는 새로운 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 전송하십시오. </li></ol></li><li> 2 ML KC 성장 매체를 추가 한 후 표피 시트의 마찰을 두 번 더 반복하고 같은 튜브에 세포 suspensions를 결합. </li><li> 적절한 혈청 피펫을 사용하여 세포 덩어리를 깰 수 있도록 세포 솔루션을 부드럽게 몇 번 피펫 쳐서 새로운 50 mL 원심 튜브에 100 μm 필터를 통과시킵니다. </li><li> 180 X g에서 5 분 동안 여과 된 세포를 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는에서 대기음과 부드럽게 1 ML 차가운 KC 성장 매체 / 표피에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> hemocytometer로 세포를 센다. <br/&gt; 참고 : KC는 자연히 현탁액에서 분화 할 수 있으므로 세포가 최적의 성능을 발휘할 수 있도록 격리 후 가능한 한 빨리 세포를 플레이 팅해야합니다. 우리는 KC 자발 분화 속도를 줄이기 위해 셀을 얼음 위에 놓는 것이 좋습니다. </li><li> 세포 부착을 촉진 세포 외 매트릭스 (ECM) 제품으로 미리 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체 5 X 10 4 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗. 주 : 우리는 ()를 참조 물질의 표를 참조 젤라틴 계 도료는 상용 가능한 (예를 들어 부착 요소를 사용하여 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 배양기에서 배양하고, 새로운 배지이었다. 격일로 보충했다. <ol><li> 코팅을 위해, 세포 시딩 이전에 10 분 내지 2 시간 동안 실온으로 가온 된 세포 부착 코팅 물질로 배양 접시를 코팅한다. 직전에 부착 요소를 제거하십시오.세포 현탁액을 추가. </li></ol></li><li> 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오. </li></ol> 2. 성인 꼬리 가죽으로부터의 일차 마우스 KC 격리 <ol><li> 동물 시설 규정에 따라 성인 C57BL / 6 마우스 (바람직하게는 6 ~ 15 주 사이, 남성 또는 여성)를 희생하십시오. 꼬리 받침에서 몸통의 꼬리를 잘라내어 꼬리 끝 부분에 가시 구멍이 생길 수 있도록 꼬리 끝의 ~ 2mm를 자릅니다. </li><li> 꼬리 가죽을 벗겨 내려면 먼저 날카로운 날을 사용하여 꼬리 선단을 꼬리 끝 부분까지 자릅니다. 다음, 하나의 포셉을 사용하여 노출 된 꼬리뼈와 다른 포셉을 잡아서 피부를 잡아 당기고 꼬리뼈를 부드럽게 하나의 연속 동작으로 껍질에서 벗겨냅니다. 껍질을 벗긴 피부를 밋밋 라인에서 잘라내어 각 조각의 길이가 2-3cm 미만이되도록하십시오. </li><li> 껍질을 벗긴 피부를 헹구십시오.10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML의 다음 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼 (KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase) 가득한 2 ML 튜브에 각 꼬리에서 피부를 놓으십시오. 참고 : 여러 개의 피부 조각을 결합하여 12 mL의 디스 페스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 꼬리)에 배양 할 수 있습니다. <ol><li> 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어. </li></ol></li><li> 꼬리 표피에서 단일 세포 현탁액을 분리하기 위해 1.4에서 1.13 단계를 수행하십시오. </li><li> 콜라겐으로 사전 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체에서 10 x 10 4 / cm 2 (hematocytometer로 계산)의 밀도로 성인 세포를 씨앗. 참고 : 우리는 시판되는 콜라겐 기반 코팅 키트를 사용합니다 (자세한 내용은 표 참조). 세포를 5 % CO 2 , 37 ℃의 가습 된 배양기에서 배양하고, 매일 새로운 배지를 보충 하였다. 일반적으로 c궁극적 인 요리는 세포 파종 전에 30 분 ~ 1 시간 동안 콜라겐으로 코팅해야합니다. 우리는 젤라틴 기반의 코팅 물질 인 부착 인자와 비교하여 콜라겐으로 코팅 된 경우 요리에 성인 KC 부착이 유의하게 증가한다는 것을 관찰했다. </li><li> 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오. </li></ol> 3. 고 칼슘에 의한 KCs의 체외 분화 <ol><li> 말단 분화를 유도하기 위해, 배지에 0.2 mM의 CaCl2를 추가. </li><li> 또는 높은 칼슘을 첨가하기 전에 저칼슘 KC 기저 배지에서 성장 보조제없이 일일 배양 된 KC를 굶기십시오. 참고 : 성장 인자 기아는 초기 분화 및 K10 5 와 같은 조기 분화 마커의 유도에 대한 세포 투입을 향상시킬 것입니다 </sup&gt;. </li></ol> 4. UVB 조사에 의한 KC로부터의 세포 사멸 및 TNFα 방출 <ol><li> 세포가 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체 변화와 KC 성장 매체 (37 % C 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서)에서 마우스 KCs를 문화. UVB 조사 직전, 성장 매체를 제거하고 PBS 500 μL로 교체하십시오. 그런 다음 세포를 25 mJ / cm 2 UVB 또는 모의 컨트롤 (UVB 없음)으로 처 리하십시오. 주 : UVB 조사는 이전 10 바와 같이 8 개의 W 전구 (312 ㎚)와 휴대용 UVB 램프를 사용하여 수행된다. UVB 조사 후 PBS를 흡인하고 새로운 배지를 첨가한다. </li><li> 측정 및 6, 8의 CCK-8 세포 생존 분석으로 세포 생존율을 정량화하고, 제조자의 지시 11 다음 24 시간 후 UVB 치료. </li><li> 원하는 시점에서 UVB로 치료 KCs에서 조건 미디어를 수집하고 TNFα 릴리스를 측정제조사의 지시에 따라 마우스 TNF (Mono / Mono) ELISA kit에 의한 조건 매질에서 7 , 12 . </li></ol>

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피부 표피는 몸을 외부 환경으로부터 분리 및 보호하고 수분 손실, 병원체, 열 및 자외선 조사로 인한 손상을 방지하는 중요한 장벽으로 작용합니다. KC는 표피의 주된 세포 계통이며 표피 KC의 일차 배양은 장벽 형성의 생물학적 과정과 in vitro에서의 환경 모욕 에 대한 KCs의 반응을 연구하고 이해하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피...

피부는 신체에서 가장 큰 기관이며 표피는 바깥쪽에 가장 많이 있습니다. 표피는 신체와 환경을 분리하기 위해 손상되지 않은 표피 장벽을 형성하는데 결정적인 역할을하므로 물 손실을 방지하고 알레르기 항원, 병원체 및 UVB 노출과 같은 환경 모욕으로부터 보호합니다. 표피는 미분화 된 기저 각질 세포 (KCs)의 단일 층에서부터 기저층, 가시 돌기 층, 과립층 및 각질층으로 구성된 다층 층상 상피로 발전한다. 표피 줄기 세포와 중계 증폭 세포로 구성된 기초 KC는 증식 성이 있고 미분화되어있다. 기초 KC가 세포주기를 빠져 나감에 따라, 세포는 분화를 결정하고 세포 - 세포 접합의 성숙과 표피 투과성 장벽 (epidermal permeability barrier, EPB)의 형성과 함께 표피 표면을 향해 서서히 이동한다. 가시 광선 층의 KC는 초기 별 차이를 표현합니다.케라틴 10 (K10)과 같은 이온 마커; KCs가 세분화 된 층으로 이동함에 따라 세포는 Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) 및 Involucrin (INV)과 같은 후기 분화 마커를 발현합니다. 각질층에서 KC는 말단 분화 된 각질 세포가되어 새로운 세포가 그들을 대체 할 때 결국 박리를 통해 흘러 나온다. 칼슘은 표피에서 가장 생리적 인 작용제로 간주 되며 in vitro 및 in vivo 에서 유사한 방식으로 분화 를 유발합니다. 정상 피부 표피에서는 칼슘 이온이 피부 표면을 향한 농도가 증가하는 특징적인 &quot;농도 구배&quot;를 형성합니다 1 , 2 , 3 . 칼슘 농도는 가장 낮은 층 (기저부 및 가시 돌기)의 낮은 수준에서 상부의 과립층의 첨단으로 상승한 다음 가장 표면적인 층 (각질층)에서는 무시할 수있는 수준으로 떨어집니다.<html> 칼슘 구배는 성분 투과성 장벽의 출현과 동시에 발생하며 칼슘 신호 전달이 KC 분화의 중요한 역할을한다는 것을지지합니다. 시험 관내 에서 낮은 칼슘 (0.02-0.1 mM)은 단일 층으로서 기저부 KCs의 증식을 유지하지만, 높은 칼슘 (&gt; 0.1 mM)은 단단 - 접합 형성 및 유도에 의해 입증 된 바와 같이 말단 분화에 대한 세포의 신속하고 돌이킬 수없는 공약을 유도한다 기초 칼슘 4 , 5 에 대한 높은 칼슘 처리시 LOR 및 INV 장벽 형성 외에도 표피 KC는 피부의 타고난 면역계의 중요한 구성 요소입니다. UVB 조사 또는 손상시 방출되는 병원균 또는 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)에 대한 반응으로 KC는 TNFα, IL6 및 IFNβ와 같은 염증성 사이토 카인을 대량 생산하여 면역계 활성화를 유도합니다&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . 병원균 제거를 위해서는 KC로부터의 적절한 염증 신호가 필요하지만 통제되지 않은 염증 반응은 건선이나 주사와 같은자가 염증성 피부 질환의 발병을 유발할 수 있습니다 6 , 8 . 전반적으로, KC는 손상되지 않은 피부 장벽을 유지하고 병원균 침입 또는 환경 모욕시 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을합니다. 그러므로 상피 세포의 일차 배양은 상피 생물학, KC 분화 및 KC 자극에 의한 타고난 면역 반응을 연구하는데 유용한 기술이다. 주요 마우스 표피 KC의 분리 및 배양은 KC의 다양한 자각 감수성 및 감수성으로 인해 어려운 과정이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 신생아 마우스 피부에서 KCs를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다성인 마우스 꼬리 피부. 성인 KC 격리의 경우, 우리는 다음과 같은 이유로이 조직에서 생존 가능한 KC를 충분히 분리하기가 어려울 수 있으므로 마우스 등쪽 피부를 사용하지 않습니다. 첫째, 모발주기 (휴지기)의 휴지기에있는 성인의 지느러미 피부는 얇은 표피는 단지 1-2 층의 세포로 이루어지기 때문에 낮은 세포 수율과 표피와 진피의 비효율적 인 분리가 이루어 지는데, 이것은 성공적인 KC 격리를위한 중요한 단계입니다. 둘째로, 성인의 지느러미 피부에 존재하는 높은 모낭 밀도는 진피에서 표피를 분리하는 어려움에 더 기여합니다. 대신, 우리는 일상적으로 꼬리 피부를 성인 마우스 KCs의 공급원으로 사용합니다.이 상피는 표피 KC 3-5 층으로 두껍습니다. 또한 모낭의 밀도가 낮아 표피 분리를 방해하지 않으므로 마우스의 나이와 머리카락 순환 단계에 관계없이 성인 마우스 꼬리 피부와 KC 격리가 가능합니다. 고립 된 신비탈크 KC는 젤라틴 코팅 배양 접시에 뿌리는 반면, 콜라겐 코팅 배양 접시는 성숙한 세포가 신생아 대응 물과 비교할 때 손상된 능력 때문에 분리 된 성인 KC를 배양하는데 사용됩니다. 마우스 KC를 배양하기 위해 저칼슘 기저 배지에는 표피 성장 인자 (EGF), 소 트랜스페린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 소 혈청 알부민 (BSA) 및 하이드로 코르티손이 포함 된 dGS가 보충된다. 초기 도금 후 2-4 일 사이에 대부분의 분화 된 KC는 매일 중간 배양 중에 씻겨 나갈 수 있고 나머지 접착 세포는 전형적인 조약돌 형태 4를 나타내며 증식하고 초기 분화 마커 K10을 발현하지 않습니다.

<table width="633">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="width:171px;height:100px;">C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td>
			<td style="width:177px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td style="width:167px;">Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">KC basal medium (EpiLife)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">MEPICF500</td>
			<td style="width:167px;">basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">Defined Growth Supplement (dGS)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S0125</td>
			<td style="width:167px;">defined growth supplements for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Dispase powder</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;">enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S006100</td>
			<td style="width:167px;">gelatin-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Coating Matrix</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">R011K</td>
			<td style="width:167px;">Collagen-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="width:171px;height:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">12604-013</td>
			<td style="width:167px;">A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">100 &#956;m Cell Strainer Nylon mesh</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">CCK-8 cell viability Kit</td>
			<td style="width:177px;">Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td>
			<td style="width:119px;">CK04-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:119px;">555268</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Corded Hand-Held UV Lamps</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">EB-280C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">8-watt UV tubes</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">BLE-8T312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Light Inverted Microscope for cell culture</td>
			<td style="width:177px;">ZEISS, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Axio Observer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX41</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

keratinocyte (KC)는 피부의 가장 바깥 쪽 레이어 인 표피의 주된 세포 타입입니다. 표피 KCs는 UVB 조사 또는 병원체와 같은 환경 모욕에 대하여 온전한 피부 장벽을 형성하고 또한 그 모욕에 염증 반응을 개시해서 피부 방위를 제공에있는 긴요 한 역할을한다. 여기에서는 신생아 마우스 피부 및 성인 마우스 꼬리 피부에서 KC를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 cheleed 태아 소 혈청 (cFBS)에 비해 정의 성장 보조제 (dGS)를 사용하여 culturing 조건을 설명합니다. 기능적으로, 우리는 신생아 및 성인 KC 모두가 높은 칼슘 - 유도 된 말단 분화, 단단한 접합 형성 및 층화에 매우 반응한다는 것을 보여준다. 또한, 배양 된 성인 KC는 UVB에 의해 유발 된 세포 사멸에 민감하며 UVB 조사시 다량의 TNF를 방출 할 수 있습니다. 함께 여기에 설명 된 방법 은 체외 모델의 설정에 대한 연구자에게 유용 할 것입니다신생아 마우스 및 / 또는 성인 마우스에서 표피 생물학을 연구합니다.

신생아 및 성인의 KCs의 높은 칼슘 유도 된 말단 분화. 관세청 도금 및 0.06 mM의 CaCl2를 유지 일차 마우스 상피 세포는 단층으로 성장하고, 각 셀은 조약돌 모양을 나타내는, 구별 간 공간 다각형했을 때 합류 (도 1a 및도 2a). CaCl2를 행 0.2mM의 승강은 세포의 급격한 형태 변화를 유도. 높은 칼슘 스위치 ?...

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.4K 조회수.  UC San Diego.  표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다. 

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...