Questo lavoro è stato supportato da grant GM117446 NIH di A.B.

1. preparazione delle cellule per flusso Cytometry ordinamento
<ol><li>Inoculare provette da 15 mL contenente 8 mL di brodo YEPD tale che le culture raggiungono una densità di 5 x 106 a 1,5 x 107 cellule per mL dopo crescita durante la notte (vedi discussione Nota 1).</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule di lievito (1.400 x g, a temperatura ambiente o a 4 ° C) in una provetta da centrifuga da 15 mL tappo a vite per 5 min, risospendere le cellule in 1,5 mL di etanolo al 70% e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,6 mL, lasciando questo sedersi per 1 h a temperatura ambiente o almeno 3 h sul ghiaccio ( possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ° C) (Vedi punto di discussione (2)).</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule di lievito in microfuge (14.000 x g, 4 ° C) per 1 min, risospendere in 1 mL 50 millimetri citrato di sodio, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C) per 1 min, aspirare il surnatante e risospendere in 1 mL 50 millimetri citrato di sodio, pH 7,2 , contenente 0,25 mg/mL soluzione di RNAsi per 1 h a 50 ° C o una notte a 37 ° C in bagno di acqua o blocco di calore.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di proteinasi K (20 mg/mL risospesi in 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 2mm CaCl2, 50% in peso di glicerolo di volume) e incubare per 1 h a 50 ° C.</li>
	<li>Rotazione verso il basso delle cellule (14.000 x g, 4 ° C), risospendere le cellule in 1 mL 50 millimetri di citrato di sodio, pH 7,2, rotazione verso il basso (14.000 x g, 4 ° C), aspirare il surnatante con vuoto, risospendere in 1 mL 1 µM verde acido nucleico ceppo risospeso in citrato di sodio 50 mM , pH 7.2 ed incubare al buio per 1 h a temperatura ambiente, Sonicare x 2 per 2 s ciascuno (2 watt di potenza di uscita).</li>
</ol>2. cella ordinamento
<ol><li>Usando un Classificatore celle, ordinare le celle in base al contenuto di DNA in fasi G1, S, "primi G2" e "fine G2", raccolta di cellule aploidi almeno 1,6 milioni da ogni fase del ciclo cellulare come in Figura 1 (Vedi punto di discussione (3)).</li>
	<li>Trasferire le cellule microfuge provette e spin giù cellule per 20 min a 14.000 x g a 4 ° C nel microfuge e aspirare il surnatante con vuoto (il pellet può essere conservato congelati a-20 ° C a tempo indeterminato; veda discussione punto (4)).</li>
</ol>3. DNA estrazione e preparazione di sequenziamento librerie
Nota: La procedura seguente si basata su "protocollo I" nell'estrazione del DNA genomico di lievito Kit (Vedi Tabella materiali).
<ol><li>Aggiungere 120 µ l di "Buffer di digestione," un buffer proprietario che consente degli enzimi litici di lievito a digerire la parete cellulare e 5 µ l di enzima litico lievito, risospendere nel vortex e incubare a 37 ° C per 40-60 min.</li>
	<li>Aggiungere 120 µ l di tampone di Lisi"," un buffer proprietario che contiene detergente e vortice dura per 10-20 s.</li>
	<li>Aggiungi 250 cloroformio µ l - Mescolare accuratamente per 1 min.</li>
	<li>Girare alla massima velocità in un microfuge per 2 min.</li>
	<li>Caricare il surnatante nella colonna associazione DNA e centrifugare in un microfuge alla massima velocità per 1 min.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ l di "DNA lavaggio Buffer," un buffer proprietario che contiene etanolo e centrifugare per 1 min in un microfuge alla massima velocità. Scartare il flusso attraverso, aggiungere 300 µ l di tampone di lavaggio di DNA e ripetere il processo di lavaggio.</li>
	<li>Trasferire la colonna di spin in una provetta di microfuge fresco, aggiungere 60 µ l di acqua (non TE) - attendere 1-3 min e poi Centrifugare per 10 s per eluire il DNA.</li>
	<li>Misurare la concentrazione aggiungendo 5 µ l di DNA a 195 µ l di reagente di dsDNA ad alta sensibilità che è stato diluito 1: 200 in buffer di dsDNA ad alta sensibilità e quindi misura fluorescenza in un fluorimetro, utilizzando 10 µ l di dotazione standard per la calibrazione; si aspettano tra 10 e 50 ng di rendimento totale del DNA.</li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni (picco incidente potenza 450, fattore di utilizzo del 30%, cicli al Burst 200, trattamento tempo 60 s, livello acqua 6) per spezzare il DNA in frammenti di 250-350 bp.</li>
	<li>Preparare una libreria utilizzando il kit di preparazione del campione del DNA e la sequenza è (almeno 10 milioni di 50 bp singolo fine letture) dello strumento di sequenziamento del DNA in modalità rapida (vedi discussione nota (5)).</li>
</ol>4. analisi di sequenziamento dati e generazione di replica profili
<ol><li>Allineare sequenze di genoma di Saccharomyces cerevisiae sacCer3 utilizzando Gsnap12 (Vedi nota di discussione (6)).</li>
	<li>Determinare a base pair leggi di profondità utilizzando "genomeCoverageBed" software13 degli Bedtools.</li>
	<li>Se presente, rimuovere punte artefactual nelle profondità di lettura, (vedi discussione nota (7)).</li>
	<li>Liscio leggere profondità dal cromosoma utilizzando mediane in un 20kb scorrevoli finestra utilizzando la funzione "runMean" in R pacchetto "caTools" (vedi discussione nota (8)).</li>
	<li>Trama leggere profondità in fase S, G2 presto e tardi G2 come percentuale della profondità di lettura completamente replicata (Vedi nota di discussione (9)).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mentre questa tecnica è robusta e relativamente dritto in avanti, particolare attenzione deve essere rivolta al seguente:
(1) si consiglia che culture crescono per almeno 12 ore prima che raggiungano la fase di log, poiché le differenze si manifestano nel ciclo cellulare distribuzioni se culture vengono vendemmiate, dopo aver raggiunto la densità desiderata solo 4 h dopo l'inoculazione. La nostra ipotesi sono che una distribuzione del ciclo cellulare che ha raggiunto un equilibrio relativam...

In più siti discreti, chiamati origini di replicazione, da cui la replica forcelle procedere in entrambe le direzioni (rivisto in Fragkos et al., 20151) viene avviata la replica del genoma eucariotico. Origini variano nella loro tempistica e l'efficienza di cottura, e sono state sviluppate diverse tecniche per monitorare l'attività di origine di replica e delucidare le cause di questa variazione. L'attività delle singole origini può essere dedotto dai livelli di single-stranded DNA2, che si forma intorno origini attivi, o utilizzando 2D elettroforesi del gel per monitorare specifiche replica intermedi3, entrambi i quali possono essere rilevati con sonde radioattive. Entrambe queste tecniche sono più facilmente applicate in S. cerevisiae rispetto in cellule di mammifero, perché origini sono limitati a specifiche sequenze conosciute nel precedente. Con l'avvento dei microarray, è diventato possibile valutare origine sparando a livello globale. Questo è stato fatto prima di etichettatura del DNA con gli isotopi pesanti, rilasciando le cellule da un blocco di G1 in medi contenenti isotopi leggeri e monitoraggio quindi la formazione di pesante-leggero ibrido DNA attraverso il genoma4. L'introduzione di sequenziamento ad alta permesso simili genoma monitoraggio dell'attività di origine senza l'obbligo di etichettatura isotopica costosi. Le cellule sono state ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA e il loro DNA sottoposti a sequenziamento profondo. Perché copertura sequenza procede da 1x a 2x nel corso della fase S, tempo di replicazione relativa può essere valutata confrontando la lettura profondità delle cellule in fase S a quelli in G1 o G25,6. Queste tecniche, in particolare applicate ai lieviti, ha portato ad una più profonda comprensione di come sequenza di DNA, struttura della cromatina e DNA replica proteine regolano la efficienza e la tempistica di origine.
L'inizio non solo successo della replicazione del DNA, che si svolge alle origini, ma anche il completamento della replica, che si verifica dove si incontrano le forcelle replica richiede fedele trasmissione dell'informazione genetica durante la proliferazione cellulare. Come l'inizio della replica, i tempi di completamento della replica variano in tutto il genoma con alcune regioni restanti non replicate anche tardi nel ciclo cellulare. Tali regioni possono essere particolarmente distante dalle origini di replicazione attiva o possono contenere sequenze o strutture di cromatina che ostacolano la polimerasi del DNA. Replica ritardata regioni possa manifestarsi come siti fragili, che sono associate con rottura cromosomica e più elevati tassi di mutazione e sono stati implicati nel cancro e invecchiamento7,8,9. Tuttavia, nonostante l'importanza del corretto completamento della replica del DNA nel mantenimento della stabilità del genoma, la nostra comprensione di come e dove questo avviene è rimasta lontano dietro quella dell'iniziazione di replica. E mentre singoli geni cui replica tarda è stata associata con la malattia sono stati studiati con, ad esempio, qPCR10globali studi rivolti a chiarire le posizioni e cause di ritardo replica sono mancati. Qui descriviamo una tecnica che ci si riferisce a come "G2 seq" in cui uniamo la citometria a flusso con sequenziamento ad alta per far luce sul completamento della replicazione del genoma in lievito11. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere adattato a tutte le celle che possono essere ordinato flusso in base al contenuto di DNA.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomic DNA kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM sodium citrate, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase solution (0.25 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&amp;deg;</td></tr><tr><td>proteinase K solution (20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III columns</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 instrument</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap alignment software</td><td>open source software / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

Numerose tecniche sono state sviluppate per seguire l'avanzamento della replica del DNA attraverso la fase S del ciclo cellulare. La maggior parte di queste tecniche sono state dirette verso delucidazione della posizione e la tempistica di apertura di duplicazione del genoma piuttosto che il suo completamento. Tuttavia, è fondamentale che capiamo regioni del genoma che sono ultima per completare la replica, perché queste regioni soffrono i livelli elevati di rottura cromosomica e mutazione, e sono stati associati con la malattia e invecchiamento. Qui descriviamo come siamo ad una tecnica che è stata utilizzata per monitorare l'inizio di replica per invece identificare quelle regioni del genoma Ultima replica completa. Questo approccio si basa su una combinazione di citometria a flusso e sequenziamento ad alta. Anche se la relazione si concentra sull'applicazione di questa tecnica di lievito, l'approccio può essere utilizzato con tutte le celle che possono essere ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA.

Abbiamo utilizzato la procedura descritta sopra per identificare siti tardi replicanti in lievito. Questo approccio utilizzando una regione conosciuta di replicante tardiva su un cromosoma artificiale di test hanno dimostrato che la tecnica per essere precisi e affidabili. I nostri risultati hanno dimostrato anche l'importanza biologica di tempestivo completamento della replica mostrando che una tardiva replicante regione sul cromosoma 7, che abbiamo identificato come fine la replica in b...

Watch this Scientific Journal Video about G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome at JoVE.com

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

Descriviamo una tecnica per combinare la citometria a flusso e sequenziamento ad alta per identificare regioni tarda replicazione del genoma.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

5.8K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. Descriviamo una tecnica per combinare la citometria a flusso e sequenziamento ad alta per identificare regioni tarda replicazione del genoma.

Video: G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Ricerca

Genetica

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Elettroforesi su gel 2D per l'analisi della replicazione del DNA e degli eventi di stallo della forcella

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Caratterizzazione della replicazione del DNA delle ripetizioni patogene per scoprire i meccanismi di stallo ed espansione della forcella di

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Bioingegneria

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Biologia

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l&#39;analisi della sequenza intera<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

Riepilogo

Esplora Altri Video

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera