Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sui telomeri, come il lievito telomerico non coding RNA TERRA localizzazione, e posso insistere sul fatto che è telomero di origine o in trans, un diverso cromes-mants Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai ricercatori di visualizzare le molecole TERRA espresso da un singolo telomero nelle cellule viventi. A dimostrare la procedura saranno Claudio Oss Pegorar e Nicole Bettin, due studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare a far crescere le celle AGS in base al protocollo di testo.
Quindi, quando le celle raggiungono il 50-60% di confluenza, trasspettarle con il vettore di espressione sgRNA Cas9 e la cassetta MS2. Il giorno dopo sostituire il mezzo di coltura con mezzo contenente neomicina. Dopo questo aggiungere 10 microlitri dello 0,25% Tripsyn ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozzi.
Utilizzando un microscopio e un marcatore, contrassegnare la posizione di ogni clone visibile nel piatto. Sostituire il mezzo di coltivazione della neomicina con abbastanza PBS da formare una sottile pellicola di liquido sui cloni. Utilizzando una pipetta da 10 microlitri contenente cinque microlitri di tripina, rilasciare lentamente la tripina sulla colonia.
Lasciare che la tripina scollega le celle per un minuto. Raschiare la colonia con la punta e succhiarla nella punta. Dopo questo, trasferire le cellule dalla colonia in un pozzo della piastra del pozzo 96.
Incubare il piatto per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi riempire il pozzo con 150 microlitri di mezzo selettivo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di gelatina ad ogni pozzo di tre 96 piastre di pozzo.
Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare le piastre con PBS due volte. Dopo che i cloni raggiungono il 90% di confluenza, aspirare il mezzo da ogni pozzo della piastra e lavare la piastra con PBS. Quindi aggiungere 30 microlitri di triptina ad ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Successivamente, aggiungere 70 microlitri di mezzo selettivo a ciascuno dei pozzi. Interrompere le cellule tubazioni su e giù. Trasferire 30 microlitri della miscela nel pozzo della piastra di DNA gelatinizzata contenente 120 microlitri di mezzo selettivo.
Quindi trasferire 30 microlitri della miscela alla piastra di congelamento gelatinizzata contenente 50 microlitri di mezzo. Posizionare il DNA nell'incubatrice e consentire alle cellule di crescere a 37 gradi Celsius fino a raggiungere il 90% di confluenza. Dopo questo, aggiungere 80 microlitri di mezzo di congelamento a freddo ghiacciato ad ogni pozzo della piastra di congelamento.
Sigillare la piastra con parafilm, sostituire il coperchio e avvolgere la piastra in un foglio di alluminio. Quindi mantenere le piastre di congelamento a 80 gradi Celsius. Dopo che i cloni nella piastra del DNA raggiungono il 90% di confluenza, lavare la piastra con PBS due volte.
Quindi lisciviare le cellule con 50 microlitri di tampone di lisi. Coprire la piastra con parafilm, sostituire il coperchio e avvolgere la piastra in un involucro saran. Dopo questo, incubare il piatto a 37 gradi celsius durante la notte.
Il giorno successivo aggiungere 100 microlitri di soluzione di cloruro di sodio etanolo ad ogni pozzo e consentire la precipitazione del DNA per sei ore o durante la notte a temperatura ambiente. Quindi invertire la piastra e lavarla tre volte con 200 microlitri di etanolo 70% per pozzo. Aggiungere 20 microlitri di RNasi Una soluzione ad ogni pozzo della piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.
Successivamente, utilizzare tre microlitri di DNA genomico per l'amplificazione PCR e configurare la macchina PCR. Far crescere i cloni positivi PCR in sei piastre di pozzo secondo il protocollo di testo. Una volta che i cloni raggiungono il 90% di confluenza, lavare le cellule con PBS e aggiungere 250 microlitri di tampone di Lysis con proteinasi K ad ogni pozzo.
Utilizzare un raschietto per celle per raschiare le cellule e trasferire il lisato in un tubo da 1,5 millilitri. Incubare il lisato a 37 gradi Celsius per 16 ore. Aggiungere un millilitro di etanolo al Lysate e agitare vigorosamente.
Consenti ai cloni di crescere in mezzo F-12K secondo il protocollo di testo. Quindi aggiungere l'adenovirus cre-espresso alle cellule una volta raggiunta la confluenza del 70%. 48 ore dopo l'infezione, dividere le cellule in tre piatti di 10 centimetri.
Quindi coltura i primi piatti per il congelamento cellulare e l'estrazione dell'RNA. In primo luogo, placcare i cloni TERRA-MS2 e le cellule AGS di tipo selvaggio in piatti di fondo in vetro. Quindi aggiungere polybrene e MS2-GFP esprimendo retrovirus al mezzo.
Dopo 24 ore scartare il mezzo contenente il retrovirus e aggiungere un mezzo fresco senza fenolo rosso alle cellule. Infine, utilizzando un microscopio invertito e una fotocamera sensibile, immagini le celle con l'obiettivo e l'apertura appropriati. In questo protocollo sono stati creati e creati cloni di cellule tumorali contenenti un tag di sequenza MS2 in un singolo sottotelomero.
I cloni resistenti alla neomicina sono stati schermati utilizzando pcr. I cloni positivi sono stati coltivati per l'estrazione genomica del DNA e l'analisi delle macchie del Sud. I cloni positivi all'analisi pcr e southern blot sono stati infettati dal CRE-GFP che esprimeva Adenovirus al fine di rimuovere il gene neomicina presente nella cassetta MS2.
Una volta confermata l'eliminazione del gene di resistenza alla neomicina, l'RNA estratto dai cloni è stato testato per l'espressione delle trascrizioni TERRA-MS2. Al fine di visualizzare le trascrizioni TERRA-MS2 nelle cellule viventi mediante microscopia confocale, i cloni selezionati sono stati infettati da un retrovirus che esprime una proteina di fusione MS2-GFP. Le trascrizioni e i telomeri TERRA-MS2 sono stati simultaneamente visualizzati nelle cellule viventi tramite microscopia confocale co-esprimere la proteina di fusione MS2-GFP e una proteina di legame telomero fusa mCherry, TRF2, nei cloni selezionati.
Quando si tenta questa procedura è importante fare ogni sforzo per selezionare un singolo clone anziché una popolazione mista di cloni. Seguendo questa procedura, altri metodi come un DNA FISH sui cromosomi si diffondono, possono essere utilizzati al fine di visualizzare l'integrazione della cassetta MS2 in cellule fisse. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può spianare la strada ai ricercatori nel campo dei telomeri per esplorare la localizzazione cellulare di singole molecole di telomero TERRA nelle cellule umane viventi.
Non dimenticare che lavorare con vettori virali e materiali radioattivi può essere estremamente incerto. E le precauzioni, come indossare cappotti da laboratorio, guanti e usare scudi in plexiglass per ridurre al minimo le radiazioni, devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
