Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti da Imperiale Istituto nazionale per salute ricerca (NIHR) Biomedical Research Centre (BRC), NIHR salute protezione Research Unit (HPRU) nelle infezioni respiratorie dell'Imperial College di Londra in partenariato con sanità pubblica inglese (PHE) e il centro di ricerca traslazionale NIHR imperiale sicurezza del paziente. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle di NHS, la NIHR, il dipartimento della salute o sanità pubblica inglese.

Le tecniche utilizzate nel protocollo seguente sono state approvate dal comitato etico West London ricerca (numero di riferimento 15/lO/0444).
1. assorbimento nasale (NA)
<ol><li>
Preparazione prima del campionamento di NA
	<ol>
<li>Quando effettuano NA, prima lavarsi le mani e indossare guanti, preferibilmente davanti il paziente.</li>
		<li>Ispezionare la cavità nasale utilizzando una torcia e hanno il clinico utilizzare loro pollice non dominante per ritrarre il naso del paziente per visualizzare la cavità nasale. Nota: Uno speculum nasale non è generalmente necessario.</li>
		<li>Visualizzare la cavità nasale e turbinato prima del campionamento inferiore. Nota: Le narici (narici) non sono rotonde in sezione trasversale e vanno dritto all'indietro. Generalmente, il turbinato inferiore può essere visto come un rigonfiamento o rientranza sulla parete laterale della narice, con setto nasale formando la parete liscia, piatta mediale. Vogliamo che per esempio da questo inferiore dei turbinati, poiché l'epitelio sottostante è un semplice epitelio ciliato delle vie respiratorie44.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Campionamento di NA
	<ol>
<li>Durante il campionamento, passare il SAM NA delicatamente il lumen della narice, orientando per essere piatta contro il turbinato inferiore.</li>
		<li>Chiedere il donatore utilizzare un dito indice per premere il SAM sulla mucosa nasale. NA può causare un lieve solletico, con possibile occhio irrigazione, come la FML è assorbito. Nota: Negli adulti, eseguiamo generalmente NA per 60 s.</li>
		<li>Dopo l'assorbimento della FML, rimuovere il dispositivo di NA dalla narice e rimettere il tubo originale.</li>
		<li>Trattare i campioni immediatamente in laboratorio o congelarli, come descritto in dettaglio più avanti in questo protocollo. Nota: NA sta studianda in una varietà di modelli di mucosa nasale di sfida e anche in malattie diverse vie aeree. Tuttavia, convalida contro altri metodi di campionamento respiratoria deve essere eseguita per ciascuna popolazione di studio e paziente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. assorbimento bronchiale (BA)
<ol><li>
Preparazione prima del campionamento di BA Nota: BA è eseguita da personale specializzato in una suite di broncoscopia.<ol>
<li>Prima dell'immissione BA giù il catetere, verifica che il SAM è d'espulsione e ritiro indietro nel catetere.</li>
		<li>Prima di svolgere BA su un paziente, condurre un finto BA su un simulatore di broncoscopia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Campionamento di BA
	<ol>
<li>Passare il broncoscopio giù la trachea e del bronco principale destro al livello del Bronco intermedius, appena prossimale alla divisione in lobi più basso di destra e centrale di destra. Nota: Abbiamo in genere campione dal Bronco intermedius, anche se altri siti all'interno delle vie respiratorie possono essere campionati. Quando si osserva il catetere e SAM, non si può vedere la punta del broncoscopio. Osserviamo i seguenti semplici passi per BA, una volta che il broncoscopio ha raggiunto il sito di campionamento desiderata.</li>
		<li>CATETERE giù: Inserire il catetere BA attraverso il canale operativo del broncoscopio fino a quando la punta bianca è appena visibile nelle vie respiratorie, ad un massimo di 1 cm distalmente alla fine del broncoscopio. Mantenere il broncoscopio e catetere punta al centro del lume delle vie aeree. Fare attenzione a ridurre al minimo il contatto tra la punta del catetere e la mucosa bronchiale per ridurre il rischio di abrasione della mucosa.</li>
		<li>SAM OUT: Premere la maniglia del dispositivo BA in modo che il SAM viene estruso nel lume delle vie aeree del lobo inferiore destro o centrale di destra. Sotto visione diretta, piegare la punta del broncoscopio per garantire che il SAM è entrare in contatto con la FML sulla parete delle vie aeree. Lasciare il SAM all'interno delle vie respiratorie, piatto alla parete della mucosa per 30 s.</li>
		<li>IN SAM: Guardare attraverso il broncoscopio per garantire che la sonda di SAM umida è lineare e non piegati indietro sopra l'estremità del catetere. Se richiesto, la punta del catetere e broncoscopio possa essere portata indietro per raddrizzare il SAM. Sotto visione diretta, ritrarre il SAM dritto delicatamente indietro nel catetere. Nota: Se c'è difficoltà ritraendo il SAM indietro nel catetere, ritirare l'intero dispositivo con SAM estruso indietro fuori le vie respiratorie.</li>
		<li>CATETERE fino: Ritirare il catetere intero dal canale operativo del broncoscopio.</li>
		<li>CUT OFF SAM: Il SAM è tagliare con forbici sterili e viene poi messo in un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA sul ghiaccio. Questi campioni possono essere elaborati con metodi diversi, come descritto in dettaglio più avanti in questo protocollo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. elaborazione di NA e BA campioni
Nota: Ci sono numerose opzioni per l'elaborazione di laboratorio di campioni derivanti da NA e BA. Questi protocolli cercano di conservare i campioni per un uso successivo e per eluire il campione MLF da SAM.
<ol><li>
Opzioni per la gestione immediata di campioni NA e BA
	<ol>
<li>Opzione 1: Memorizzare il SAM umido sul ghiaccio per un paio d'ore prima di un'ulteriore elaborazione.</li>
		<li>Opzione 2: Immediatamente deep freeze NA SAMs nell'insieme tubo. Allo stesso modo, congelare BA SAMs in fiale criogenici dopo la rimozione, con le forbici, dal dispositivo di campionamento.</li>
		<li>Opzione 3: Posizionare il SAM distaccato in tampone di eluizione (300 µ l) prima della sua elaborazione direttamente o profondità di congelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opzioni di tampone di eluizione per campioni NA e BA Nota: La scelta di tampone di eluizione dipende da ciò che sta per essere analizzati nel campione MLF e suggeriamo quattro alternative principali:<ol>
<li>Utilizzare un tampone di dosaggio pre-preparato adatto per procedure di immunoanalisi. Tale buffer deve contenere una piccola quantità di detersivo (0,05%) così come proteina, per esempio, albumina di siero bovino (BSA) all'1%.</li>
		<li>In alternativa, utilizzare un buffer che contiene una maggiore quantità di detersivo, in modo che lisi cellulare si verifica. Nota: Usiamo il buffer contenente Triton-X o NP40 a 1% di concentrazione. Buffer di lisi delle cellule abilitare citochine intracellulari ed extracellulari essere eluite da SAM e generalmente provocare i livelli elevati di citochine e chemochine. Questi buffer devono inoltre contenere proteine e sono realizzati con BSA all'1%.</li>
		<li>Per misurazioni di RNA, come la PCR quantitativa del RNA virale o misura del RNA di host, è necessario aggiungere tampone di estrazione di RNA direttamente al SAM umida. Nota: Buffer di estrazione RNA caotropici contengono guanidinium che denatura le proteine. Un'alternativa consiste nell'aggiungere il tampone di estrazione di RNA al fluido di MLF eluiti contenute nel buffer di lisi di immunoassay o cella.</li>
		<li>Utilizzare solventi organici, come l'acido trifluoroacetico, per l'estrazione dei lipidi e dei metaboliti, per la valutazione tramite spettrometria di massa. Nota: Dettagli di tutti i reagenti sono inclusi nella sezione materiali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tecnica di eluizione
	<ol>
<li>Per tutte le tecniche di eluizione sopra, inserire il SAM in una provetta da 2 mL micro-centrifuga, insieme con il tampone di estrazione desiderata.</li>
		<li>Vortice mescolare il campione per 30 s a lavare il SAM di fluidi senza bloccare allegati e biomolecole.</li>
		<li>Per garantire il recupero del campione completo, eseguire centrifugo eluizione aggiungendo il SAM umido a una mini-colonna di filtro spin che inserisce lo stesso tubo del micro-centrifuga 2 mL utilizzato per il lavaggio. Nota: Due tipi di mini-colonna di filtro spin possono essere utilizzati. Il primo contiene solo una maglia di plastica, che tiene il SAM sul posto, permettendo la completa eluizione dei fluidi. In alternativa, se lavora con materiale infetto, è possibile utilizzare filtri spin con un diametro dei pori da 0,22 µm. Questi filtri si sterilizzare campioni e sono adatti per i campioni con sospetta infezione micobatterica. Tuttavia, questi filtri vanno pre-incubati con buffer, per minimizzare l'associazione dei mediatori al filtro da interazioni non specifiche.</li>
		<li>Utilizzare forcipe sterilizzato per trasferire il SAM umido al filtro spin. Cambiare il forcipe tra campioni per prevenire la contaminazione.</li>
		<li>Centrifugare i campioni per 20 min a 16.000 x g in una mini-centrifuga raffreddata a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocollo di esempio Sommario
	<ol>
<li>In laboratorio, etichetta mL 2 micro-provette per la raccolta del campione e aggiungere il volume di tampone di eluizione (tipicamente 300 µ l per NA; 100 µ l per BA). Guarnizione coperchio e metterli su ghiaccio.</li>
		<li>Seguendo il SAM di campionamento (immediatamente o in laboratorio) è rimosso dall'impugnatura usando il forcipe e inserito nel buffer contenente tubo di raccolta (prodotto nel passaggio precedente). Assicurare il tappo del tubo del microcentrifuge è chiuso saldamente e trasferire i campioni, il ghiaccio, al laboratorio per un'ulteriore elaborazione.</li>
		<li>Rimuovere le provette contenenti il buffer di SAM ed eluizione da loro mix di contenitore e vortice di trasferimento per 30 s.</li>
		<li>Utilizzando pinze sterili, rimuovere SAM e collocare in una colonna di rotazione (con o senza filtro di acetato di cellulosa 0,22 µm).</li>
		<li>Raccogliere il tampone di eluizione dal tubo di raccolta e conservare.</li>
		<li>Posizionare la colonna di spin, con SAM, nel tubo di raccolta originale (o uno nuovo se il filtro sterile campioni) e aggiungere tampone di raccolta per far girare la colonna. In questo modo, il fluido di lavaggio passa attraverso la colonna di spin nuovamente dentro il tubo di raccolta, contribuendo a eluire il campione da SAM.</li>
		<li>Centrifugare i campioni con coperchi sigillati (16.000 x g, 20 min, 4 ° C).</li>
		<li>Rimuovere i campioni dalla centrifuga e collocare in un rack.</li>
		<li>Aprire il coperchio sigillato dei tubi e rimuovere la colonna contenente il SAM. Smaltire colonna SAM e spin in un apposito contenitore per rifiuti.</li>
		<li>Attentamente l'eluato contenuta all'interno del tubo in etichettati criogenico aliquota tubi. Registrare il volume e il volume totale di eluato in ciascuna aliquota.</li>
		<li>Trasferire le provette sigillate criogeniche a un congelatore a-80 ° C e conservare in posizione verticale fino all'utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Risultati da tecniche di campionamento delle vie respiratorie esistenti sono considerare come altamente variabile; tecniche di campionamento alternativi sono necessari per standardizzare la ricerca all'interno di questo campo5. NA e BA consentono il campionamento della FML in maniera non invasiva e hanno potenziale emozionante per misurare le risposte immunitarie nelle vie aeree di sani e malati. Queste tecniche offrono numerosi potenziali vantaggi rispetto alle tecniche esistenti, tra cui maggiore tollerabilità, la capacità di ripetere frequentemente il campionamento, la velocità di campionamento bassa variabilità inter-utente e diminuito la diluizione di mediatori immuni5 . La durata dell'assorbimento e della tecnica di lavorazione utilizzata dovrebbe essere ottimizzata per ogni studio e rigorosamente mantenuta tra gli eventi di campionamento. Inoltre, nel caso di BA, il sito di campionamento all'interno delle vie respiratorie deve essere attentamente replicato tra gli individui.
NA e in particolare BA, sono ancora relativamente nuove tecniche per la ricerca clinica. Tuttavia, i benefici di queste tecniche hanno portato nel loro uso in numerosi studi, tra cui attenta convalida rispetto a tecniche alternative5. Questi dispositivi sono ora disponibili come dispositivi di marcatura pronto per l'uso molto diffuso nella ricerca delle vie respiratorie. Mentre NA e BA provocare molto più piccoli volumi di campione rispetto alle tecniche di campionamento alternativi, le più alte concentrazioni ottenute possono provocare una maggiore sensibilità per mediatori immuni abbondanza bassa.
A seconda delle applicazioni a valle desiderate, NA e BA campioni possono essere congelati direttamente per la successiva elaborazione, studio di fattibilità in un ambiente di ricerca clinica di miglioramento. Il protocollo per la gestione dei campioni possa anche essere adattato alle particolari applicazioni a valle. Le tecniche di lavorazione suggerito possono essere utilizzate per la raccolta di proteine o di mediatori immuni del lipido o di acidi nucleici, ma dovrebbero essere ottimizzate per ogni studio. In particolare, FML possono essere eluiti con diversi buffer. In primo luogo, immunoassay buffer può essere utilizzato per misurare la mucosa citochine, chemochine e anticorpi6,45. Buffer con i livelli elevati di detersivo è utilizzabile anche per garantire la lisi cellulare si verifica, permettendo l'inclusione delle citochine intra-cellulare. Estrazione di RNA caotropici buffer deve essere utilizzato per la determinazione dell'infezione virale, viral carico, ospitare mRNA e il microbioma. In alternativa, i solventi organici possono essere utilizzati per lipidomica e spettrometria di massa.
In conclusione, assorbimento diretto della FML da superfici mucose è una tecnica entusiasmante con potenziale impiego in malattie mucose respiratorie, gastro-intestinale, urogenitale e altre. Tuttavia, queste promettenti tecniche di assorbimento richiederà precisa convalida di campionamento e di elaborazione tecnica per singoli saggi (biomarkers) in ogni ambiente di malattia. Inoltre, queste tecniche di campionamento della mucosa romanzo precisione richiede convalida contro campioni convenzionali, come da sangue, respiro ed espettorato. Con queste tecniche, FML può essere utilizzato per misurare i microbi, citochine, chemochine, prostanoidi e anticorpi.

La maggior parte delle malattie respiratorie causano una risposta infiammatoria, e c'è un urgente bisogno di campionamento dalla superficie della mucosa respiratoria nella rinite allergica, infezioni virali e fungine, tubercolosi, asma, malattia polmonare ostruttiva cronica, polmonare cancro del polmone e fibrosi 1. Aspirato nasofaringeo (NPA), lavaggio nasale e lavaggio broncoalveolare (BAL) sono tecniche comuni per le vie respiratorie superiori e inferiori di campionamento. Tuttavia, queste tecniche presentano notevoli problemi tra cui la scarsa tollerabilità, diluizione dei mediatori infiammatori e l'impossibilità di ripetere frequentemente il campionamento2. Un'alternativa al campionamento NPA è l'uso di tamponi, o nylon "floccati", cotone, o rayon3,4, ma questi inoltre hanno dei limiti, poiché causano disagio e danni all'epitelio nasale e in qualche legame irreversibile di casi di mediatori infiammatori5. Queste tecniche generalmente non possono essere ripetute in serie più di un'ora, e tecniche alternative possono essere più efficaci per il rilevamento di abbondanza bassa citochine e chemochine5,6. Inoltre, la variabilità di utente connessa con queste tecniche potrebbe generare incoerenze nei dati, risultanti nel requisito di più grandi gruppi di pazienti.
In alternativa, tecniche di assorbimento utilizzando spugne naturali e sintetici sono stati utilizzati per raccogliere FML da superfici mucose. Oftalmiche spugne composto di cellulosa naturale (ad es., Weck-cel) sono stati usati per esempio saliva, cervicale e le secrezioni vaginali7. Inoltre, spugne sintetiche effettuata in alcol polivinilico (PVA) e acetato di polivinile idrossilato (HPVA) sono stati utilizzati8. Sette diversi materiali fonoassorbenti sono stati confrontati per campionamento fluido orale prima della misura gli anticorpi9, mentre il mini-spugne in poliuretano sono stati utilizzati per raccogliere le lacrime umane10.
Carta da filtro costituito da cellulosa naturale dalla pianta del cotone è stato ampiamente usato per assorbire le secrezioni nasali dal libro pionieristico di Alam e colleghi nel 199211,12,13,14, 15,16,17. Dischi di carta da filtro sono state prodotte da schede di filtro (ad esempio Shandon) e sono stati utilizzati per misurare le istamine e citochine dopo aver controllato le sfide nasale allergene e con allergene naturale esposizione18,19 ,20,21. Tuttavia, diversi lotti di carta da filtro variano nel loro grado di legame con le proteine e alcuni non riescono a rilascio di citochine. Metodi utilizzando una matrice sintetica assorbente (SAM) sono quindi stati sviluppati2,22,23. SAMs sono generalmente utilizzate per ottenere MLF nasale di na Questi materiali assorbenti sono comodi da utilizzare e consente di ottenere MLF anche dal naso infiammato a intervalli frequenti su lunghi periodi di tempo.
Assorbimento nasale è una forma di campionamento della mucosa precisione utilizzando una SAM per il campionamento della FML in vie respiratorie superiori. NA dispositivi sono fabbricati come dispositivi medici recanti la marcatura CE dei materiali grado medicale con camere pulite e sono privi di polvere e allergeni. Il campionatore di NA è costituito da un manico e SAM in una sterile stoccaggio provette criogenia. Il SAM è costituito da polimeri, in genere fibre, ma è anche disponibile come schiuma, e questi sono selezionati per essere morbido e assorbente, con rapido wicking per raccolta del campione. SAMs hanno legame proteico minimo per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite. NA è una tecnica molto delicata, non invasiva che può essere eseguita su donatori di tutte le età. Inoltre, campionamento di serie, anche ogni pochi minuti, è possibile. NA è stata convalidata contro esistenti delle vie respiratorie superiore5 di tecniche di campionamento e campionamento ripetitivo ha permesso la generazione di dati cinetici seguendo la sfida delle vie respiratorie con allergene23,24,25, endotossina batterica26 e agonisti TLR di tipo virale (GAI, a. et al., manoscritto in preparazione). NA è stato utilizzato anche nei neonati per indagare la storia naturale di atopia27,28,29 e Bronchiolite virale30.
Microcampionamento bronchoscopic (BMS) è una procedura per la raccolta della FML nelle vie respiratorie inferiori che sono stata sviluppata da Olympus31,32,33. Purtroppo, questo sistema BMS è concesso in licenza solo in Giappone. Olympus fornire due sistemi BMS: uno con un poliestere idrossilati fibroso (FHPE) sonda34,35,36,37, e uno con un cotone sonda33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. un ostacolo principale è stato che la sonda BMS utilizzata in pazienti con asma causata contatto mucoso, sanguinamento, con la metà di tutti i campioni contaminati da sangue. Gli autori hanno concluso che non era fattibile per esempio MLF usando questo sistema BMS da airways periferici in pazienti di asma43.
In alternativa, abbiamo sviluppato utilizzando una morbida SAM che possono essere eseguite durante l'indagine bronchoscopic su basse vie respiratorie, anche a seguito di infezione sperimentale in soggetti asmatici con rhinovirus6BA. Il dispositivo di BA è costituito da: un catetere cavo esterno, un manipolo che sull'attivazione estrude il SAM e un filo di guida plastica centrale che ha il SAM sulla sua fine. Per quanto riguarda NA, BA kit sono fabbricati con materiali di grado medico utilizzando le camere sono pulite e sono privi di polvere e allergeni. Inoltre, i dispositivi sono marchiati CE e sono forniti di gamma-irradiati. La striscia di SAM è morbido, assorbente e ha wicking rapido per raccolta del campione. Ha anche un legame con le proteine minimo per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite. Il dispositivo può adattarsi attraverso il canale operativo di un broncoscopio e può essere utilizzato per rapidamente e con precisione assaggiare FML in siti specifici di interesse all'interno delle vie respiratorie. A differenza di BAL o BMS, BA non causare sanguinamento contatto o dopo la procedura ulteriore disagio per il paziente.
Un'attenta considerazione dovrebbe essere data al trattamento dei campioni di NA e BA. I campioni possono essere direttamente congelati e trasformati in lotti o possono essere elaborati immediatamente. Il tipo di elaborazione può essere adattato verso alcune applicazioni a valle, tra cui test immunodiagnostici per citochine, chemochine e immunoglobuline o eluizioni di virali, batteriche, e cellula ospite associato RNA. Vi presentiamo la raccolta clinica e laboratorio di tecniche di elaborazione associati con NA e BA come una guida per ricercatori clinici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1562">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Nasosorption (adult, 7mm width)</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">NSFL-FXI-11</td>
			<td style="width:1061px;">Different sizes are available for different patient groups/ages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Bronchosorption</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">BSFL-FXI-11</td>
			<td>Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (without membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS9301-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (0.22um membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS8160-24EA</td>
			<td>For sterilisation of samples with infection risk.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Assay (elution) buffer</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:140px;">AB-33k</td>
			<td>Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">NP-40 Cell lysis buffer</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">FNN0021</td>
			<td>Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Buffer RLT (RNA extraction)</td>
			<td style="width:108px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:140px;">79216</td>
			<td>Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">302031-100ML-M</td>
			<td>For elution of samples to be used in HPLC applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">2.0ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:140px;">3213</td>
			<td>2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorption of nasal and bronchial fluids: precision sampling of the human respiratory mucosa and laboratory processing of samples

I metodi di assorbimento nasale (NA) e assorbimento bronchiale (BA) utilizzano matrici assorbenti sintetici (SAM) per assorbire il liquido di rivestimento mucoso (MLF) dell'apparato respiratorio umano. NA è una tecnica non invasiva che assorbe il liquido dal Turbinato inferiore e provoca disagio minimo. NA ha dato risultati riproducibili con la capacità di ripetere frequentemente il campionamento delle vie aeree superiori.
In confronto, metodi alternativi di campionamento la mucosa respiratoria, come aspirazione rinofaringeo (NPA) e scovolatura convenzionali, sono più invasivi e possono provocare una maggiore variabilità dei dati. Altri metodi hanno dei limiti, per esempio, biopsie e procedure bronchiale sono invasive, espettorato contiene molti morti e morendo le cellule e richiede la liquefazione, respiro esalato condensato (EBC) contiene acqua e saliva e campioni di lavaggio sono diluiti e variabile.
BA può essere eseguita attraverso il canale operativo di un broncoscopio in clinica. Campionamento è ben tollerato e può essere condotta a più siti nelle vie respiratorie. BA si traduce in campioni MLF essendo meno diluito rispetto a campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL).
Questo articolo viene illustrato le tecniche di NA e BA, così come il laboratorio di lavorazione dei campioni risultanti, che può essere su misura per il biomarcatore a valle desiderato da misurare. Queste tecniche di assorbimento sono un'utile alternativa per le tecniche di campionamento convenzionali utilizzate nella ricerca clinica respiratoria.

NA è stata utilizzata in una serie di studi a facilmente e non invadente misura l'infiammazione della mucosa. Dopo la somministrazione dell'allergene al naso, livelli di prostaglandina-D2 (PGD2) possono essere osservati a salire e scendere in minuti (Figura 1), in linea con degranulazione delle cellule di albero (Thwaites et al., manoscritto in preparazione). Inoltre, mediatori di infiammazione di tipo II, quali IL-5 (Figura 2, ristampato con il permesso da 24), possono essere misurati nelle ore successive nasale allergene sfida23,24. Nell'infezione sperimentale di asmatici allergici e controlli sani, NA serviva a misurare un panel di mediatori, compreso interferone-gamma (IFN-γ), nel corso di 7 giorni (Figura 3, ristampato con il permesso da 6). Inoltre, nell'infezione naturale virus respiratorio sinciziale (RSV) degli infanti, NA dimostrato RSV per essere associato con i livelli elevati di citochine infiammatorie, quali IFN-γ, rispetto al non-RSV infanti con bronchiolite e controlli sani ( Figura 4, ristampato con il permesso di 30). Interessante, questa discriminazione tra non-RSV bronchiolitis e RSV non era significativa in pari tempo di campioni NPA (Figura 4).
BA è stato anche utilizzato durante l'infezione sperimentale di asmatici allergici con rhinovirus. Al giorno 4 dell'infezione del rhinovirus, livelli di IFN-γ, CXCL11, IL-10 e IL-5 sono stati elevati dal basale (Figura 5; A, B, C e D, rispettivamente). Inoltre, questa tecnica ha dimostrato i livelli elevati di IL-5 nelle vie respiratorie inferiori degli asmatici allergici durante l'infezione del rhinovirus, rispetto a controlli sani (Figura 5) (Figura 5 ristampato con il permesso da 6).
Questi risultati rappresentativi sono stati generati da campioni eluiti mediante tampone contenente 0.05% Tween-20 e 1% BSA (Vedi Tabella materiali).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Figura 1 : Generazione veloce e clearance di prostaglandina-D2 seguendo la sfida dell'allergene nasale. I livelli di prostaglandina-D2 (PGD2) misurati da eluati di assorbimento nasale in campioni di serie seguendo la sfida dell'allergene nasale con polline dell'erba Timothy (n = 5). Ogni riga rappresenta i dati da un individuo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Figura 2 : Misurazione cinetica di IL-5 dopo la sfida dell'allergene nasale. Produzione di IL-5 in campioni seriali assorbimento nasale seguendo la sfida dell'allergene nasale. Ripetere i tre sono stati condotti studi di sfida di allergene, con i partecipanti (n = 19) che ricevono il placebo (blu), a bassa dose (10 mg) di prednisone orale (arancione), o prednisone orale della dose elevata (25 mg) (rosso) un'ora prima della somministrazione dell'allergene. Linee denotano media geometrica e barre di errore sono gli intervalli di confidenza del 95% di tutti i partecipanti. (Figura ristampato con il permesso dal Leaker et al., immunologia delle mucose, 2017). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Figura 3 : Induzione di interferone-γ durante l'infezione del rhinovirus. Durante la sfida di infezione di adulti sani (n = 11, blu) e gli asmatici allergici (n = 28, rosso) con il rhinovirus-16, campionamento di assorbimento nasale è stato usato per misurare i livelli di interferone-γ (IFN-γ). I dati sono rappresentati come trame di spaghetti A) crudo degli individui e dei livelli di B) mediani con barre di errore che indica il range interquartile. (Figura ristampato con il permesso da Hansel et al. 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Figura 4 : Nasosorption discrimina elevati interferone-γ associata con l'infezione RSV degli infanti. Assorbimento nasale e rinofaringeo aspirazione (NPA) sono stati usati per misurare i livelli di interferone-γ in infanti con il bronchiolitis connessi con l'infezione del virus respiratorio sinciziale (RSV) (rosso, n = 12), un agente patogeno respiratorio non-RSV (verde, n = 12) e sano controlli (blu, n = 9). I dati sono stati analizzati utilizzando un test di Kruskall-Wallis con Dunns correzione per i confronti multipli (* * *p< 0,001). Linee denota valori mediani e barre di errore sono intervalli interquartile. (Figura per volta con il permesso di Thwaites et al. 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Figura 5 : Mediatori infiammatori nei campioni di assorbimento bronchiale durante l'infezione del rhinovirus. Dopo l'infezione del rhinovirus-16 dei comandi sani (n = 10, blu) e volontari asmatici allergici (n = 23, rosso), assorbimento bronchiale è stato usato per misurare i livelli di A) IFN-γ, CXCL11 B), C) IL-10 e IL-5 D) al basale e il giorno 4 di infezione. Dati analizzati di Wilcoxon firmarono prova rigogliosa (campioni abbinati) e test di Mann-Whitney (campioni senza eguali). Figura ristampato con il permesso da Hansel et al. 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples at JoVE.com

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Questo manoscritto descrive l'uso di tecniche di assorbimento nasali e bronchiali, in particolare utilizzando matrici assorbenti sintetici (SAM) per assaggiare il liquido di rivestimento mucoso (MLF) delle vie respiratorie superiori e inferiori. Questi metodi forniscono maggiore standardizzazione e tollerabilità rispetto alle tecniche respiratorie campionamento esistenti.

Assorbimento di liquidi nasali e bronchiali: precisione campionamento della Mucosa respiratoria umana e laboratorio di lavorazione dei campioni

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

absorption-nasal-bronchial-fluids-precision-sampling-human

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

29.2K Views.  St Mary's Hospital. Questo manoscritto descrive l'uso di tecniche di assorbimento nasali e bronchiali, in particolare utilizzando matrici assorbenti sintetici (SAM) per assaggiare il liquido di rivestimento mucoso (MLF) delle vie respiratorie superiori e inferiori. Questi metodi forniscono maggiore standardizzazione e tollerabilità rispetto alle tecniche respiratorie campionamento esistenti.

Video: Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Ricerca

Medicina

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodologia per l'induzione dell'espettorato e laboratorio di lavorazione

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Strategie di campionamento e trattamento dei campioni di tessuto Biobank Porcine modelli biomedicale

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a multitude of issues ranging from transportation, access, facilities, equipment, and communication to provider training. To address this need, we have developed an innovative, scalable, logistics-enhanced, mobile, laboratory facility for emergencies and epidemics in resource-constrained global settings. Utilizing a background in clinical operations as an academic medical center, we designed a rapidly-deployable, modular BSL-2 and BSL-3 facility with user-friendly software for tracking and management of drugs and supplies in remote regions during epidemics and outbreaks. Here, we present our intermodal, mobile, expandable shipping-container laboratory units. The design of the laboratory facilitates off-grid usage by minimizing power consumption and allowing alternate water sources. The unit's information communication technology (ICT) platform provides (i) user-friendly tablet-based documentation, (ii) enhanced tracking of patients and supplies, and (iii) integrated communication onsite with built-in telehealth capabilities. To ensure quality in remote environments, we have developed a checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for respiratory viral diagnosis using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). As described, this innovative and comprehensive approach allows for the provision of laboratory capability in resource-limited global environments.

A rapidly-deployable, off-grid laboratory has been designed and built for remote, resource-constrained global settings. The features and critical aspects of the logistically-enhanced, expandable, multifunctional laboratory modules are explored. A checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for a respiratory viral diagnostic test are developed and presented.

Laboratorio remoto gestione: Diagnostica Virus respiratorio

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Coltura e imaging di organoidi epiteliali nasali umani

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Raccolta, espansione e differenziazione di modelli primari di cellule epiteliali nasali umane per la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

A Traditional Chinese Medicine Characteristic Therapy for Bronchial Asthma: Moxibustion

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest tightness, or cough, as a result of increased airway reactivity. With high diurnal variation, these symptoms often occur or worsen at night or in the morning. By burning and roasting the Chinese medica above human acupoints, moxibustion is a type of treatment that stimulates the activity of the human meridians through drugs and heat stimulation to prevent and treat diseases. According to the principle of syndrome differentiation and treatment of traditional Chinese medicine, acupoints are selected on the corresponding parts, which has a definite effect. It is regarded as a characteristic traditional Chinese medicine therapy for bronchial asthma. This protocol elaborates the methods and steps of patient management, material preparation, selection of acupoints, operation, and postoperative nursing to ensure safe and effective moxibustion treatment to significantly improve the clinical symptoms and quality of life of patients with bronchial asthma.

This protocol presents a curative procedure of moxibustion in treating patients with bronchial asthma.

Una terapia caratteristica della medicina tradizionale cinese per l'asma bronchiale: la moxibustione

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest ...

Acquisizione di campioni di tessuto orale di fibrosi sottomucosa per l'analisi spazio-omica

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autore in primo piano: Svelare i misteri delle neoplasie maligne orali 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolamento di cellule con informazioni morfologiche e spaziali da campioni di fibrosi sottomucosa orale mediante microdissezione a cattura laser

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...