Gli autori vorrebbero riconoscere Vertex Pharmaceuticals e il Premio Innovazione Ricerca Fibrosi Cistica per il finanziamento R. Quinn e il NIH / NIAID per concedere finanziamenti 1 U01 AI124316-01, un approccio di biologia dei sistemi per il trattamento di patogeni resistenti a più farmaci. Vorremmo anche ringraziare il Dipartimento di Meccanica e Ingegneria Aerospaziale presso corso di design di alto livello di ingegneria meccanica di laurea della UCSD per facilitare la collaborazione con gli aspetti ingegneristici di questo lavoro.

1. Preparazione delle scorte per i mezzi di sputum artificiali <ol><li> Crea una soluzione al 5% di mucina. Aggiungere 1,0 g di mucina dello stomaco di suino disidratato a 20 ml di acqua deionizzata. Autoclave la soluzione risultante. NOTA: la sterilizzazione della mucina distruggerà la sua struttura inerente; Altri metodi per sterilizzare la mucina nella sua forma asciutta includono sterilizzazione UV e irraggiamento. Questi metodi non sono stati ampiamente utilizzati per il sistema WinCF tuttavia. </li><li> Aggiungere 2,2 g di KCl a 50 ml di acqua deionizzata e permettere la dissoluzione. Aggiungere 5,0 g di NaCl a 50 ml di acqua deionizzata e permettere la dissoluzione. Autoclave queste due soluzioni. </li><li> Aggiungere 100 mg di DNA sperma di salmone a 10 ml di acqua sterile deionizzata. Scaldare questa soluzione a circa 85 ° C in un bagno d&#39;acqua per alcune ore per assicurare la dissoluzione. </li><li> Aggiungere 5,0 mg di ferritina a 5,0 ml di acqua sterile deionizzata. </li></ol> 2. Preparazione del mezzo di espettorato artificiale <ol><li> combinareI seguenti componenti: 16 ml di soluzione di mucina, 2,0 ml di soluzione di KCl, 2,0 ml di soluzione di NaCl, 200 μL di emulsione di tuorlo d&#39;uovo, 5,6 ml di soluzione di DNA, 120 μL di soluzione di ferritina, 5,78 ml di essenziali La soluzione amminoacidica, 5,78 ml di soluzione aminoacido non essenziale e 2,44 ml di acqua sterile. <ol><li> Se appaiono piccole quantità di sedimento, agitare dolcemente per mescolare. </li><li> Pipettare 5,0 ml di supporti in otto centrifughe sterili da 15 ml. NOTA: Le condizioni chimiche di ogni tubo possono essere manipolate come desiderato. Ad esempio, a ciascun tubo possono essere aggiunte soluzioni tampone e indicatori di pH allo scopo di confrontare il comportamento microbico a livelli distinti del pH. Una dimostrazione di questo è mostrata nella sezione dei risultati rappresentativi con 8 livelli di pH distinti, da 5,0 a 8,5 in 0,5 incrementi di pH. </li></ol></li><li> Una volta che le condizioni chimiche dei supporti sono manipolate con successo, congelare per un utilizzo successivo. I media resteranno stabilizen a -20 ° C per diversi mesi. Vortex su di scongelamento. </li></ol> 3. Preparazione di un comando di marcia del Provette capillari <ol><li> In un biohood sterile, riempire otto tubi microcentrifuga sterili con 250 microlitri di media ciascuno. </li><li> Acquisire otto sterili 15 provette per centrifuga ml, ogni tubo corrispondente ad una provetta indicato nel passaggio 3.1. <ol><li> Sterilizzare un tovagliolo di carta con una soluzione di etanolo al 70% e lasciare asciugare. Una volta asciutto, strappare la spugna a pezzetti di circa quattro pollici quadrati ciascuno, e rovinarli ogni pezzo sul fondo di una provetta da centrifuga 15. Per i tubi aggiuntivi, spray e asciutti asciugamani di carta aggiuntivi, se necessario. </li><li> Con un ciuffo di carta sul fondo di ogni provetta, inumidire leggermente ogni ciuffo carta con circa 1,0 mL di acqua sterile per creare un ambiente umido. </li></ol></li><li> Ottenere tre tubi capillari di vetro per ogni provetta preparata nella fase 3.1 e un blocco di tubo capillare mastice sealant. </li><li> Per ogni provetta, riempire tre tubi capillari con i media di circa 5 mm di distanza dal marcatore blu vicino alla parte superiore del tubo. <ol><li> Riempire tenendo un&#39;estremità del tubo nella provetta e inclinando verso l&#39;orientamento orizzontale, consentendo un&#39;azione capillare per guidare il mezzo nel tubo (vedere Figura 1). </li><li> Interrompere il riempimento inserendo delicatamente un dito guantato sopra l&#39;estremità aperta del tubo, e quindi sigillare l&#39;altra estremità del tubo premendolo nel blocco sigillante. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Figura 1: Esempio pH Pendenza, Riempire Tubo capillare con artificiale espettorato Medium. Il mezzo viene aggiunto inserendo un&#39;estremità del tubo nel liquido e inclinando per facilitare l&#39;azione capillare. La colorazione media in questo esempio è dovuto indicatore di pH aggiunto per aiutare demoneStrati i potenziali cambiamenti nell&#39;acidità dopo l&#39;incubazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="5"><li> Posizionare ogni set di tre tubi capillari in tubi di centrifuga da 15 ml riempiti di asciugamani di carta completamente inumiditi con acqua sterile, rivestiti lateralmente. Bloccare il tubo e l&#39;etichetta. Questi tre capillari sono per la replica di ogni condizione di controllo. </li><li> Quando tutti i tubi di centrifuga da 15 ml vengono riempiti con i loro tubi capillari designati, posizionare i tubi in un rack di contenimento. Mettere il rack in modo tale che i tubi saranno incubati orizzontalmente (per catturare le bolle di gas) (vedi figura 2 ). Incubare i tubi capillari all&#39;interno dei tubi di centrifuga (contenenti i grumi di carta inumiditi) a 37 ° C per 48 ore. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Figura 2: Grado di pH dell&#39;esempio, tubi capillari pronti per l&#39;incubazione. Una volta che tre tubi capillari sono stati riempiti e sigillati, vengono collocati in un tubo di centrifuga con un tovagliolo di carta umido nella parte inferiore. Questo tubo viene quindi chiuso e messo in un rack. Il rack deve essere orientato lateralmente durante l&#39;incubazione, come qui illustrato, in modo che la produzione di gas possa essere osservata una volta completata l&#39;incubazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 4. Imaging dei tubi capillari di controllo dopo l&#39;incubazione <ol><li> Rimuovere il rack di tubi di centrifuga dall&#39;incubatore, assicurandosi di mantenere i tubi orizzontali. Spostare con cautela i tubi capillari dai tubi di centrifuga, mantenendo ogni set di tre separati da altri set. </li><li> Disporre i tubi capillari uno accanto all&#39;altro su una lightbox, tutti allineati in modo che il contenuto dei tubi sia visOttima e illuminata. Lasciare un vuoto ogni tre tubi per separare le diverse condizioni chimiche. </li><li> Con i tubi allineati e la lightbox accesa, foto direttamente sopra. (Vedi figura 3 ) </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Figura 3: Grado di pH dell&#39;esempio, Run di controllo, Preincubazione, Nessun sputum aggiunto. Medio sputato artificiale dopo essere stato aggiunto a tubi capillari in set di tre, aumentando il pH da sinistra a destra. La combinazione di indicatori aggiunti al mezzo provoca più tubi acidi che appaiono più gialli, mentre i tubi meno acidi diventano più porpora. I tubi sono disposti orizzontalmente e sono illuminati da sotto, fotografati dall&#39;alto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> Smaltire ilMateriali di controllo nei rifiuti biologici. </li></ol> 5. Inoculare i tubi capillari WinCF con un campione di sputum <ol><li> In una bioina sterile, riempire otto tubi di microcentrifuga sterili con 225 μL di supporti ciascuno. </li><li> Homogenizzare il campione di sputo ritirando e espellendo lo sputo ripetutamente con una siringa da 3 ml (una siringa di plastica senza ago). Fai questo fino a quando l&#39;espettorato è di consistenza liscia. </li><li> Aggiungere 25 μl di espettorato omogeneizzato a ciascun tubo di microcentrifuga (diluizione 1/10 nei supporti ASM) preparato nel punto 5.1. Poi vortex i tubi per 30 s per mescolare in modo sufficientemente. </li><li> Aggiungere i supporti ai tubi capillari seguendo la stessa procedura dei passi da 3.2 a 3.5. </li></ol> 6. Imaging dei tubi a capillare campione dopo l&#39;incubazione <ol><li> Dopo il tempo di incubazione di 48 ore, rimuovere e ricavare i tubi capillari seguendo la stessa procedura dei passi da 4.1 a 4.3. </li><li> Se le bolle sono presenti nei tubi, faiche le fotografie scattate chiaramente raffigurano la delimitazione tra le bolle e dei media nei tubi. Se biofilm è presente, assicurarsi che le fotografie possono rappresentare in modo chiaro la sua presenza pure. </li></ol> 7. La rimozione dei supporti per applicazioni a valle <ol><li> Per semplificare l&#39;analisi a valle, rimuovere i supporti dai tubi capillari dopo imaging. Le possibili applicazioni includono la coltura e il DNA / RNA sequenziamento e profilazione metabolomica. Attenzione: I tubi capillari di vetro riempiti con agenti patogeni sono un rischio biologico significativo, in tal modo, questi passaggi deve essere fatto con molta attenzione con attrezzature specifiche. Se tubi capillari si rompono, smaltire in contenitori per materiali pericolosi taglienti. </li><li> Utilizzare contundenti aghi ended di calibro 25 e 0,5 pollici di lunghezza per rimuovere il supporto. Inserire l&#39;ago ended smussato nella estremità chiusa del tubo per rompere il sigillo. </li><li> Dopo la rottura del sigillo, ruotare il tubo capillare capovolta e dei media gocciolare dalla porzione superiore. ioI supporti non esauriscono facilmente, utilizzare una pipetta con una punta da 200 μl ed espellere il supporto fuori dal tubo premendo sullo stantuffo della pipetta quando viene inserito nell&#39;estremità del tubo capillare. Raccogliere il supporto tubo espulso in un contenitore appropriato (tubo da centrifuga da 1,5 ml). NOTA: per analisi trascrizionale o altri RNA, i media possono essere espulsi direttamente in buffer stabilizzanti RNA. </li></ol> 8. Il sistema WinCC FLUD NOTA: Il sistema WinCC Fluid Loading Utility Device (FLUD) è una suite opzionale di dispositivi complementari progettati per ottimizzare il throughput del WinCF System. Il sistema WinCC FLUD è principalmente costituito da materiali stampabili 3D. La produzione stampata 3D consente una sostituzione rapida e semplice dei materiali per garantire tempi di inattività minimi per i ricercatori e requisiti minimi di produzione. I disegni, i file stl, le istruzioni per la stampa 3D e il manuale WinCF FLUD sono disponibili nel sito onlinent. <ol><li> Preparazione di supporti per il carico del tubo capillare <ol><li> In una bioina sterile, riempire otto tubi sterilizzatori di microcentrifuga da 2 ml con 900 μL di ciascuno. </li><li> Omogeneizzare tutti i campioni di sputo ritirando e espellendo lo sputo ripetutamente con una siringa da 3 ml (una siringa di plastica senza ago). Fai questo fino a quando l&#39;espettorato è di consistenza liscia. </li><li> Aggiungere 100 μl di espettorato omogeneizzato a ciascun tubo di microcentrifuga (diluizione 1/10 in mezzo) preparato al punto 8.1.1. Poi vortex i tubi per 30 s per mescolare in modo sufficientemente. </li><li> Fissare i tubi di microcentrifuga riempiti e aperti nel supporto del tubo del rotatore orientato in modo che i tubi siano verticali. </li></ol></li><li> Posa di tubi capillari <ol><li> Recuperare tre tubi capillari per ogni tubo di microcentrifuga nel punto 8.1. </li><li> Inserire tre tubi nella base di gomma in modo che siano allineati con i tubi di microcentrifuga all&#39;altra estremità dell&#39;apparecchio.Assicurarsi che le estremità contrassegnate dei tubi siano lontane dai tubi di microcentrifuga. Inserire correttamente i tre fori sulla base della culla sopra i tre prigionieri sul supporto per culla. </li><li> Con i tubi capillari collocati nei loro canali di guida sull&#39;apparecchiatura, posizionare saldamente il tampone di gomma sopra le loro medie sezioni per evitare lo spostamento. (Vedi figura 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Figura 4: Il sistema FLUD completamente caricato con i tubi capillari assicurati dal Tamp Rubber Tampone sulle loro Midsections. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="3"><li> Caricamento dei supporti nei tubi capillari <ol><li> Usare con cautela una mano per afferrare l&#39;estremità dell&#39;apparato dove sono presenti i tubi capillariADED, e utilizzare l&#39;altra mano per tenere la cremagliera rotatore in cui vengono caricate le provette da microcentrifuga. </li><li> Delicatamente ruotare il rack microcentrifuga modo che i tubi da microcentrifuga sono quasi orizzontale e procedere a spingere lentamente la cremagliera verso i tubi capillari. (Vedi Figura 5) </li><li> Quando le estremità dei tubi capillari entrano in contatto con i media nei tubi microcentrifuga, affinché l&#39;azione capillare inizia immediatamente riempimento dei tubi capillari. Per regolare tasso di riempimento e il livello di riempimento, ruotare delicatamente l&#39;apparecchio nel suo complesso. Nel fare questo, fare attenzione a non versare i media fuori dei tubi microcentrifuga. (Vedere Figura 6) </li><li> Quando i tubi capillari sono riempiti ai livelli desiderati, posizionare il livello apparecchio su una superficie e accuratamente ancora estrarre rapidamente il rack di provette da microcentrifuga le estremità dei tubi capillari per cessare di riempimento. I tubi microcentrifuga possono essere retratti fino in posizione verticale e chiusi. </li><li> Sigillare le estremità sporgenti dei tubi capillari premendo un blocco sigillante su ciascun set triplice, sigillando un set alla volta finché tutti i set sono sigillati. Per ridurre il rischio di contaminazione, premere una parte diversa del blocco sigillante su ciascuna serie triplicata (vedi Figura 7 ). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Figura 5: Il sistema FLUD con tubi medi, distribuiti ad orientamento orizzontale, pronti a realizzare contatti con i tubi capillari. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Figura 6: Il sistema FLUD con tubi capillari Caricamento con i mezzi mediante azione capillare. </strOng&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Figura 7: Tenuta dei tubi capillari riempiti sul sistema FLUD Un triplicato impostato alla volta utilizzando un blocco di tenuta. Questo blocco sigillante aveva plastica lungo i bordi che erano stati tagliati per impedire il contatto con i set trippati vicini durante la sigillatura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> incubazione <ol><li> Togliere il tampone di gomma sopra i midsections del tubo e sollevare la base di gomma dall&#39;apparato principale. Questo dovrebbe prendere con sé tutti i tubi capillari. Ora regolare la base e i tubi che si trovano sul rack di imaging. Questo raCk ha tre mozziconi che si inseriscono nella base, così come piccoli canali di guida per impostare i tubi. </li><li> Impostare il rack dell&#39;immagine nel suo complesso nella scatola di incubazione in plastica trasparente. Immergere piccole quantità di asciugamani sterili in acqua sterile e collocare lungo i due lati più corti della scatola per fornire l&#39;umidità durante l&#39;incubazione. (Vedi figura 8 ) </li><li> Chiudere completamente la scatola e impostare all&#39;interno di un incubatore a 37 ° C, assicurandosi di mantenere i tubi orizzontali. Incubare per 48 h. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Figura 8: Tubi capillari in culla di gomma Trasferiti dal sistema FLUD ad un rack di imaging, che è stato collocato in una scatola di incubazione trasparente accanto a asciugamani di carta umida per fornire umidità. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di th</a>è figura. <ol start="5"><li> Imaging ed estrazione <ol><li> Rimuovere il rack di imaging passo i tubi dalla casella di incubazione e collocarlo su una lightbox, illuminato dal basso. Con i tubi già nel rack di imaging, gli insiemi triplicato saranno opportunamente distanziati e pronte per l&#39;immediato. </li><li> Mettere a fuoco sui tubi in modo tale che tutti sono visibili nel campo visivo e la luce dalla casella di luce fornisce un sufficiente contrasto e visualizzazione del colore nei coloranti tubo. Fotografia da direttamente sopra. </li><li> Per estrarre il contenuto dei tubi, togliere i tubi capillari dalla gomma culla una serie di triplicati in un momento. sollevare delicatamente i tubi e fuori della culla o scivolare fuori. </li><li> Per ciascun gruppo di triplicato, seguire la procedura di estrazione descritto nei passaggi da 7.1 a 7.3. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il trucco microbiologica di un polmone con CF contiene una grande varietà di organismi, ma le condizioni all&#39;interno del polmone probabilmente un&#39;influenza significativa su quali tipi di microbi possono sopravvivere e prosperare 13, 15. specifici meccanismi attraverso i quali queste condizioni cambiano e gli effetti precisi che hanno sul microbioma polmone sono in genere poco chiaro al momento. In questo metodo sperimentale, presentiamo un&#39;analisi d...

Il metodo descritto in questo manoscritto è chiamato il sistema WinCF 1 . L&#39;obiettivo generale di WinCF è quello di fornire una configurazione sperimentale in grado di simulare l&#39;ambiente di un bronchiolo polmonare pieno di muco. Ciò consentirà un sistema tracciato per studiare patogeni microbici delle malattie polmonari con un fenotipo di ipersecrezione del muco, tra cui la fibrosi cistica (CF), la malattia polmonare cronica ostruttiva (COPD), l&#39;asma e altri. La procedura è stata progettata appositamente per lo studio del CF, caratterizzato da mutazioni che causano la secrezione polmonare divenuta spessa e difficile da eliminare, eventualmente riempendo bronchioli e altri piccoli passaggi con muco 2 . Tali blocchi nel polmone inibiscono lo scambio di gas perché l&#39;aria inalatoria non è più in grado di raggiungere molti alveoli e fornisce anche un habitat per la colonizzazione batterica 3 , 4 . L&#39;incapacità di prevenire la crescita microbica nelIl muco polmonare eccessivo porta infine allo sviluppo di infezioni croniche complesse della via aerea. Queste comunità contengono una varietà di organismi, inclusi virus, funghi e batteri come Pseudomonas aeruginosa , interagenti tra loro 5 , 6 , 7 , 8 . Si ritiene che l&#39;attività del microbiolo del polmone CF sia coinvolta in flare dei sintomi chiamati exacerbazioni polmonari 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF consente di studiare il comportamento della comunità microbica attorno a queste esacerbazioni ed è ora ampliato per agire come sistema sperimentale di base per studiare l&#39;ecologia microbica del polmone. Tradizionalmente, le esacerbazioni sono state studiate attraverso l&#39;analisi diretta di campioni prelevati dal polmone. Molti fattori confondenti fanno un&#39;analisi diretta del microbiale behavior nei polmoni impegnative, con il sistema WinCF, molti di questi fattori vengono rimossi e il comportamento del microbiome polmone può essere studiato più direttamente, per consentire analisi più fine di attività batterica in un bronchiolo muco-collegato. Il sistema WinCF fornisce un metodo per crescere e analizzare i batteri in un modo che simula efficacemente l&#39;ambiente polmone. I metodi tradizionali per la coltivazione di batteri polmonari campioni di coltura spesso coinvolti su piastre di agar tradizionali. Questi metodi lasciano i campioni aperti all&#39;ossigeno atmosferico, trascurando per tenere conto del ipossico e condizioni anossiche spesso disponibili a bronchioli polmonari tappati con muco 12, 13. Coltura su agar in condizioni aerobiche è niente come l&#39;ambiente del polmone CF e può trarre in inganno medici e ricercatori sul comportamento degli agenti patogeni che stanno cercando di trattare. Inoltre, le sostanze nutritive disponibili ai batteri su piastre di agarSono dissimili a quelli disponibili nello sputo effettivo, che è rappresentato in WinCF utilizzando l&#39;espansione artificiale (ASM). Come mostrato dalle colture di Pseudomonas in Sriramulu et al. 14 , ASM include un insieme specifico di componenti che imita le risorse disponibili per espellere i microbi e replica anche la consistenza fisica dello sputo. Poiché un polmone malato ha un microbioma specifico, lo studio di tali microrganismi dovrebbe essere idealmente avvenuto anche nelle condizioni specifiche del polmone. Il sistema WinCF consente un&#39;analisi rapida e una facile manipolazione delle condizioni sperimentali per osservare i cambiamenti microbici simili a come si verificherebbero in un efficace bronchiolo polmonare. Questa tecnica consente l&#39;inoculazione di una miriade di tipi di campioni correlati tra cui sputum, saliva, altre secrezioni corporee e colture batteriche pure o miste. La natura dell&#39;installazione sperimentale consente un&#39;immediata interpretazione visiva diIl comportamento della comunità microbica ed è progettato per consentire una facile applicazione a valle di una moltitudine di procedure microbiologiche e omiche. Tali studi sono importanti perché i cambiamenti della composizione della comunità batterica si basano sulle condizioni fisico-chimiche del loro ambiente. Con WinCF le condizioni chimiche dei media possono essere manipolate per analizzare gli effetti sull&#39;attività batterica. Ad esempio, l&#39;acidità dei supporti può essere modificata prima dell&#39;inoculazione con un campione. Dopo l&#39;incubazione, l&#39;attività batterica in ognuna di queste condizioni può essere confrontata direttamente e si possono trarre conclusioni su come i batteri in questi campioni di sputo si comportino in risposta al pH variabile. Qui descriviamo le procedure per l&#39;applicazione del sistema WinCF e gli esempi di come la chimica dei media può essere manipolata per studiare gli effetti sul microbioma polmonare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Color-Coded Capillary Tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-260943</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cha-seal Tube Sealing Compound</td>
			<td style="width:93px;">Kimble-Chase</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mucin from porcine stomach</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferritin, cationized from horse spleen</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)</td>
			<td style="width:93px;">AppliChem Panreac</td>
			<td>A2159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Egg Yolk Emulsion, 50%</td>
			<td style="width:93px;">Dalynn Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">VE30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P2157500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.0mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the wincf model - an inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections

Molte malattie croniche delle vie respiratorie comportano un attacco muco delle vie aeree. I polmoni di un individuo con fibrosi cistica sono un caso esemplare in cui i loro bronchioli collegati a muco creano un habitat favorevole alla colonizzazione microbica. Vari agenti patogeni prosperano in questo ambiente che interagiscono tra loro e guidano molti dei sintomi associati alla malattia di CF. Come tutte le comunità microbiche, le condizioni chimiche del loro habitat hanno un impatto significativo sulla struttura e sulla dinamica della comunità. Ad esempio, diversi microrganismi crescono in livelli diversi di ossigeno o di altre concentrazioni di soluto. Questo è anche vero nel polmone CF, in cui si ritiene che le concentrazioni di ossigeno possano guidare la fisiologia e la struttura comunitaria. I metodi qui descritti sono progettati per simulare l&#39;ambiente polmonare e sviluppare patogeni in un modo più simile a quello da cui provocano malattie. La manipolazione dell&#39;ambiente chimico di questi microbi è poi usata per studiare come i chemiStriato delle infezioni polmonari regola la sua ecologia microbica. Il metodo, chiamato sistema WinCF, si basa su un mezzo artificiale di espettorato e da tubi capillari stretti intesi a fornire un gradiente di ossigeno simile a quello che esiste nei bronchioli a muco. La manipolazione di condizioni chimiche, come il pH media dello spettro o la pressione degli antibiotici, consente di visualizzare le differenze microbiologiche in quei campioni usando indicatori colorati, osservando la produzione di gas o biofilm, oppure estraendo e sequenziando i contenuti dell&#39;acido nucleico di ciascun campione.

crescita microbiologica attraverso le diverse condizioni chimiche indotte nei campioni variato drammaticamente in alcuni casi e più sottile in altri. Molti cambiamenti nell&#39;attività erano a carattere visivo, essendo facilmente evidente non appena il periodo di incubazione è conclusa. Nell&#39;esempio di manipolazione pH, i campioni attraverso lo spettro pH varia notevolmente come dimostrato da diversi fattori che sono diventate evidenti dopo incubazione. Quando non campioni di esp...

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The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Le vie respiratorie del flusso mucoso di fibrosi cistica (CF) sono un ambiente ideale per i patogeni microbici a prosperare. Il manoscritto descrive un nuovo metodo per studiare il microbioma polmonare CF in un ambiente che imita dove provocano malattie e come le alterazioni delle condizioni chimiche possano guidare la dinamica microbica.

Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

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9.0K Views.  University of California, San Diego.  Le vie respiratorie del flusso mucoso di fibrosi cistica (CF) sono un ambiente ideale per i patogeni microbici a prosperare. Il manoscritto descrive un nuovo metodo per studiare il microbioma polmonare CF in un ambiente che imita dove provocano malattie e come le alterazioni delle condizioni chimiche possano guidare la dinamica microbica. 

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l&#39;antigene alle cellule T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Metodologia per lo studio del orizzontale Gene Transfer in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...