Ringraziamo i membri del laboratorio Huse per consulenza e assistenza. Supportato da l'US National Institutes of Health (R01-AI087644 di M.H.) e P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. preparazione delle superfici di vetro stimolatore
<ol><li>Coprioggetto cappotto otto pozzetti camerata con biotinilati poli-L-lisina (Bio-PLL) diluito 1: 500 in acqua distillata e deionizzata (ddH2O). Incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Lavare con H2O.</li>
	<li>A secco per 2 h a RT.</li>
	<li>Blocco di Bio-PLL rivestito superfici con tampone bloccante (tamponata HEPES salino [10 mM HEPES a pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) per 30 minuti a TA.<ol>
<li>Sciogliere 5 mg di poli-L-lisina hydrobromide in 1 mL di 10 mM NaPO4, pH 8.5.</li>
		<li>Aggiungere 125 μmol (0,55 mg) di NHS-biotina (da uno stock di 100 mg/mL in DMSO) e controllare il pH della reazione. Se il pH è inferiore a 8,5, aggiungere 2 μL di 4 N NaOH per elevarlo a tra pH 8.5 e 9.5.</li>
		<li>Vortexare per 30 min.</li>
		<li>Placare la reazione con 50 µ l di 100 mM glicina disciolta in 20 millimetri Tris pH 8.0.</li>
		<li>Gira alla massima potenza per 10 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Nota: Qualità Bio-PLL è in genere rispetto al precedente preparazioni del rivestimento diluizioni seriali del materiale su una piastra a 96 pozzetti ELISA e quantificare il contenuto in biotina dopo incubazione con fosfatasi alcalina accoppiato streptavidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il tampone di bloccaggio. Non lasciare asciugare pozzetti. Aggiungere streptavidina (100 µ g/mL in tampone bloccante). Incubare per 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare HBS. Riempire e invertire pozzi diapositiva camera 4 - 5 volte, rimozione di HBS dai pozzi. Non lasciare asciugare pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere il biotinilati pMHC ligandi e molecole di adesione alla superficie. Nota: MCC e ovuli possono essere photocaged con l'aggiunta di ortho-nitrobenzyl basato su gruppi di protezione (ad es., nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) per il gruppo ε-amminico di Lisine chiave (K12 in MCC, K7 in ovuli). Photocaged MCC e ovuli possono essere ottenuti da produttori commerciali. Dopo la ricostituzione in tampone acquoso, essi sono ripiegati in batterico espressa-Ek e H2-Kb utilizzando gli approcci stabiliti11,12.</li>
	<li>Convalida del peptide MCC o ovuli fuse<ol>
<li>Decage peptidi NVOC protetto UV irradiando con una lampada UV portatile (Vedi Tabella materiali) per 20 minuti a TA.</li>
		<li>Torio impulso 1.0 x 105 APC con 1 µM del peptide nonstimulatory (controllo negativo, ad esempio Hb), fuse peptide, peptide irradiati fuse e peptide agonista (controllo positivo, per esempio, MCC) per 1 h a durante la notte a 37 ° C.</li>
		<li>Per stimolare le cellule T che esprimono il 5C. C7/2B4/AND TCR, utilizzare celle CH12 o CH27 B. Per stimolare le cellule T OT1, utilizzare EL4 thymoma cellule o RMA-s.</li>
		<li>Mescolare le APCs pulsato con un numero uguale di cellule T nel 96 pozzetti tondo piastre inferiori ad un volume finale di 200 µ l. Incubare a 37 ° C per 12-24 h.</li>
		<li>Recuperare i surnatanti da ciascun pozzetto e analizzare il-2 da ELISA con rilevazione colorimetrica di streptavidina-rafano perossidasi. Nota: Conferma dello status ingabbiamento di tutti i peptidi mediante spettrometria di massa electrospray prima del ripiegamento in complessi MHC, è fortemente raccomandato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la piegatura e la purificazione di MHC in modo da minimizzare l'esposizione alla luce. Ad esempio, avvolgere pieghevole reazioni nella carta stagnola e svolgere cromatografia di gel filtrazione con la lampada UV. Nota: È stato trovato quel fuse MCC-I-Ek e OVA - H2-Kb indurre attivazione indipendente delle cellule di T UV ad alta densità, probabilmente a causa di ingabbiamento funzionale incompleta. Quindi, il pMHC di fuse è diluito in un eccesso di x di 10-30 di nonstimulatory pMHC (per esempio -Ek contenente il peptide di64-76 di emoglobina (Hb)) durante la fase di immobilizzazione. Questo migliora il rapporto segnale-rumore del successivo esperimento di formazione immagine.</li>
	<li>A photoactivate CD4+ T cellule, collettivamente utilizzare una miscela di biotinylated Hb-I-Ek (3 µ g/mL), biotinylated fuse MCC-I-Ek (0.1 µ g/mL) e anticorpi biotinilati contro la classe I di MHC H2-Kk (0,5 µ g / mL). incoraggia l'anticorpo anti-H2-Kk 5 C. C7/2B4/AND T cellule, che esprimono H2-Kk, di diffondere sulla superficie di vetro senza in fase di attivazione.</li>
	<li>Per CD8+ T cellule, utilizzare una miscela di biotinylated H2-Db recanti il peptide KAVYDFATL (1 µ g/mL), fuse biotinilati OVA-H2-Kb (0,1 µ g/mL) e il dominio extracellulare della molecola di adesione ICAM-1 (2 µ g/mL prodotto da cellule di insetto cultura13). L'ICAM-1 incoraggia stretto contatto formazione coinvolgendo l'integrina LFA1 sulla superficie delle cellule T.</li>
	<li>Applicare tutte le miscele della proteina in tampone bloccante, seguita da incubazione per 1h a RT o almeno 2 ore a 4 ° C. Nota: La densità molecolare su superfici di questo tipo per essere ~ 8000 a µm2 è stata determinata in precedenza6. Dato che fuse pMHC rappresenta ~1/30th della proteina biotinilato sulla superficie, la sua densità sarà ~ 267 molecole al µm2, prima del decaging.</li>
	<li>Lavare come al punto 1.6 e lasciare in HBS fino all'uso.</li>
	<li>Aggiungere 200.000 CD4+ o CD8+ T cellule che esprimono TCR appropriato in ogni pozzetto e permettono alle cellule di aderire a 37 ° C per 15 min. Una volta che le cellule hanno attaccato al e distribuire sulla superficie, sono pronti per fotoattivazione e imaging. Nota: Retroviral trasduzione di cellule T effettrici con imaging sonde fluorescenti è descritto in dettaglio altrove6,7. Segnalazione del calcio possono essere studiate anche utilizzando cellule di T untransduced caricate con il colorante sensibile del calcio Fluo-46. Il colorante raziometrici Fura-2 non è raccomandato perché richiede eccitazione nella gamma UV, che induce anche la decaging della pMHC di fuse.</li>
</ol>2. acquisizione immagini
<ol><li>Usare un microscopio rovesciato di TIRF provvisti di un UV compatibile 150 X obiettivo obiettivo per acquisizione di immagini. UV irradiare regioni definite dall'utente utilizzando un sistema a membrana digitale collegato ad una lampada a mercurio 100 W (HBO). Diretta UV luce da questa lampada sul campione utilizzando un mirror di passaggio lungo 400 nm.</li>
	<li>Utilizzare software di analisi di immagine per fotoattivazione localizzata e l'acquisizione di time-lapse. Nella maggior parte degli esperimenti, monitorare le sonde in entrambi i canali, verde e rossi, utilizzando 488 nm e laser di eccitazione 561 nm, rispettivamente. Luce laser è diretto sul campione utilizzando uno specchio dicroico dual-banda passante che trasmette anche nella gamma UV (per abilitare decaging). Per ulteriori informazioni sulla configurazione del microscopio, vedere la Tabella dei materiali e la Figura 6 .</li>
	<li>Dopo aver montato la diapositiva di camera che contiene le cellule di T, regolare le impostazioni per ottenere illuminazione TIRF o epifluorescenza, come necessario. In modalità live, selezionare un campo di cellule che esprimono il sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni di micron-scala per fotoattivazione sotto singole celle utilizzando software di controllo.</li>
	<li>Iniziare l'acquisizione di time-lapse. In genere, 80 punti temporali vengono acquisiti, con un intervallo di 5 s tra ogni punto del tempo. Questo lascia più di abbastanza tempo per sequenziale 488 nm e 563 nm esposizioni, nel caso di esperimenti di doppio colore.</li>
	<li>Dopo 10 punti temporali, photoactivate le regioni selezionate aprendo il diaframma digitale dell'otturatore per 1-1,5 s.</li>
	<li>Dopo aver completato il lasso di tempo, selezionare un nuovo campo di cellule e ripetere il processo.</li>
</ol>3. analisi dei dati
Nota: Localizzata fotoattivazione di ligandi immobilizzati crea una regione ben definita, stazionaria stimolatore che può essere utilizzata per l'analisi quantitativa di segnalazione eventi rimodellamento del citoscheletro e risposte. Analisi protocolli tipicamente coinvolgono o quantificare l'intensità di fluorescenza all'interno della regione irradiata o utilizzando la regione irradiata come endpoint posizionale per misurazioni della distanza (ad es. per la valutazione della polarizzazione del centrosoma per la irradiati regione). Entrambi i protocolli di analisi sono descritti di seguito. Vari programmi di analisi di immagine interattiva consente di rendere intensità e misurazioni della distanza, che possono poi essere uscita per ulteriore elaborazione e analisi.
<ol><li>
Intensità di fluorescenza
	<ol>
<li>Determinare l'intensità di fluorescenza (FI) di una regione di sfondo all'esterno della cella (FIb). Verrà utilizzato per la correzione di fondo.<ol>
<li>Disegnare un'area quadrata micron imprese fuori della cellula e fare una maschera. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori. Nota: Dettagli procedurali (ad es. 3.1.1.1) fare riferimento al software Slidebook (Vedi Tabella materiali). Attuazione del presente protocollo utilizzando altri pacchetti software (ad es., FIJI) sarà leggermente diverso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinare il FI all'interno della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo.<ol>
<li>Selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sottrarre lo sfondo FI dai valori misurati FI all'interno della regione. Quindi, normalizzare le misure FI corrette dividendo per la media, sfondo corretto FI dei primi 9 fotogrammi prima di fotoattivazione. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Nota: Il grafico ΔF/F in funzione del tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distanza
	<ol>
<li>Ottenere la x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.<ol>
<li>Per determinare gli assi x e y le coordinate del centro della regione fotoattivazione, selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinare gli assi x e y coordinate per la sonda fluorescente di interesse per ogni punto di tempo. Questo è tipicamente realizzato attraverso manuali o automatizzate delle particelle di rilevamento.<ol>
<li>Per determinare gli assi x e y coordinate della sonda fluorescente di interesse, selezionare Manuale Particle Tracking e cliccare sulla sonda fluorescente di interesse nel corso del tempo. Una volta che sono stati monitorati tutti i punti di tempo, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcolare la distanza tra la proteina fluorescente di interesse e il centro della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo usando l'equazione: distanza = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), in cui x2 e y2 sono le coordinate della proteina fluorescente di interesse e x1 e1 di y sono le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.</li>
		<li>Grafico della distanza in funzione del tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. 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J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. 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Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Negli ultimi anni, la luce è emerso come un ottimo strumento per l'attivazione spatiotemporally controllata dei processi cellulari. Sono state sviluppate varie metodologie, ciascuno con associati vantaggi e svantaggi. Il sistema descritto qui, che è basato su decaging di ligandi extracellulari, immobilizzati, è ideale per l'analisi delle risposte di segnalazione rapide, subcellulare, polarizzate. Questo approccio è stato applicato per esaminare è formazione in cellule di T, come descritto in precedenza. Inoltre, son...

Linfociti T (cellule T) gioca un ruolo centrale nell'immunità cellulare riconoscendo peptidi antigenici visualizzate nel contesto della superficie cellulare MHC. Riconoscimento dell'antigene, che è mediata dal TCR, spinge la differenziazione delle cellule T naive e promuove la consegna delle risposte citolitiche e comunicative di effettori. Impegno di TCR inoltre induce cambiamenti drammatici nell'architettura cellulare. In pochi minuti, le cellule T gloms sul lato della cella presentanti l'antigene (APC), formando un'interfaccia polarizzata, conosciuta come la sinapsi immunologica (IS)1,2. L'IS rafforza le risposte delle cellule T effettrici abilitando il direzionale rilascio di citochine o, nel caso dei linfociti T citotossici (CTL), proteine litiche che distruggono l'APC.
Impegno di TCR di pMHC induce la fosforilazione rapida di più molecole di adattatore a valle, compreso il Linker per le celle di attivazione di T (LAT), che in definitiva promuove robusto rimodellamento del citoscheletro sinaptica2. Corticale actina filamentosa (F-actina) unità delle cellule di T di diffusione sopra la superficie APC e poi si risolve in una struttura anulare caratterizzata da accumulo di F-actina alla periferia IS e svuotamento dal centro. Formazione di anello di F-actina è strettamente per il riorientamento del centro organizzatore dei microtubuli (MTOC, chiamato anche il centrosoma in cellule di T) ad una posizione appena sotto il centro dell'interfaccia. Entrambi gli eventi si verificano all'interno di minuti di riconoscimento iniziale dell'antigene e stabilire il contesto architettonico in cui gli eventi di attivazione successiva ed effettrici si ottiene una risposta.
Per studiare la formazione di IS, vari laboratori hanno sviluppato approcci in cui la APC è sostituito da una superficie di vetro che contiene immobilizzato TCR ligandi o supporta un bilayer del lipido che a sua volta contiene i ligandi3,4. T cellule formano IS-come contatti su queste superfici che possono essere imaged di microscopio a fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) o microscopia confocale, permettendo studi ad alta risoluzione di attivazione delle cellule T iniziale e la formazione di IS.
Sebbene questi approcci hanno permesso per visualizzazione eccellente del è completamente assemblato, gran parte della legatura TCR:pMHC seguente segnalazione si verifica in pochi secondi, che complica gli sforzi per determinare la sequenza degli eventi che seguono l'attivazione TCR con precisione . Per ovviare a questo problema, è stato sviluppato un approccio di fotoattivazione, in cui fuse pMHC viene utilizzato per realizzare il controllo spazio-temporale di TCR attivazione5,6,7. In questo sistema, le cellule T sono attaccate alle superfici di vetro contenente pMHC di fuse che è non-stimolatori per il TCR, fino a quando irradiato con luce ultravioletta (UV). Irradiazione UV di una regione di graduate micron della superficie sotto la cellula T rimuove il photocage creando una zona di stimolatorio che possa essere riconosciuta dalle cellule T. Eventi successivi di segnalazione e il rimodellamento del citoscheletro sono quindi monitorati utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificato. Due versioni di fuse di peptidi antigenici, lepidottero del citocromo c88-103 (MCC) e ovoalbumina257-264 (OVA), che vengono presentati nel contesto della classe II MHC-Ek e la classe I di MHC H2-Kb, rispettivamente, sono stati sviluppato (Figura 1). Questo permette l'analisi di entrambi CD4+ T cellule specifiche per MCC-I-Ek (esprimendo il 5 C. C7, 2B4, o AND TCR) e CD8+ T cellule specifiche per OVA-H2-Kb (che esprimono TCR OT1).
Nell'ultimo decennio, l'approccio di fotoattivazione e formazione immagine di TCR è stata utilizzata per stabilire la precisa cinetica di TCR primi passi di segnalazione e anche per identificare i meccanismi molecolari che regolano polarizzata in rimodellamento del citoscheletro5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ad esempio, il dosaggio è stato strumentale nel determinare tale centrosoma riorientamento verso l'APC è mediato da una sfumatura localizzata del lipido secondo messaggero diacilglicerolo centrato presso l'IS. Si prevede che questa metodologia continuerà ad essere prezioso per applicazioni che richiedono analisi di imaging ad alta risoluzione della funzione delle cellule T.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Will be used to biotinylate proteins</td></tr><tr><td>Biotinylated Hb I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-MCC I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &amp;alpha;H2-K&lt;sup&gt;k&lt;/sup&gt; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-OVA H2-K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-D&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Hand held UV lamp</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Lamp is held &amp;lt; 1 cm from the sample.&amp;nbsp; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Additional information about the imaging system can be found in &lt;strong class=&quot;xfig&quot;&gt;Figure 6&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mosaic digital diaphragm</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

Linfociti T impegnano nella segnalazione rapida, polarizzati, che si verificano pochi minuti dopo l'attivazione del TCR. Ciò induce la formazione di sinapsi immunologica, una giunzione cellulare stereotipato che regola l'attivazione delle cellule T e direzionalmente gli obiettivi le risposte effettrici. Per studiare questi processi in modo efficace, è necessario un approccio imaging che è su misura per catturare le risposte veloci, polarizzate. Questo protocollo descrive tale sistema, che si basa su un fuse peptide-major istocompatibilità (pMHC) che è non-stimolatore fino a quando è esposto a luce ultravioletta. Decaging mirati di questo reagente durante gli esperimenti di videomicroscopia consente controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione di TCR e monitoraggio ad alta risoluzione delle successive risposte cellulari di riflessione interna totale (TIRF) imaging. Questo approccio è anche compatibile con le strategie di perturbazione genetici e farmacologici. In questo modo per il montaggio delle vie molecolari ben definite che collegano TCR segnalazione alla formazione delle strutture citoscheletriche polarizzate che sottendono la sinapsi immunologica.

L'approccio di fotoattivazione e imaging consente per l'osservazione e facile quantificazione delle risposte di segnalazione rapide, polarizzate. Per illustrare le sue capacità, riprodotta qui è un esperimento esaminando la spatiotemporal correlazione tra accumulo di TCR-indotta DAG e centrosoma riorientamento. 5 C. Gli scoppi di cella C7 T retrovirally sono state trasdotte con due reporter fluorescenti: un biosensore DAG contenente i domini di C1 tandem da chinasi di proteina C-θ coll...

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K Views.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

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Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Ricerca

Bioingegneria

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Genetica

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Immunologia e infezioni

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biologia

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Neuroscienze

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

Uso della tecnologia di MHC di singola catena di indagare Co-agonismo in umano CD8 + attivazione delle cellule T

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain unanswered. One requirement for advancements in our understanding of the underlying disease mechanisms and cellular dynamics is the precise coupling of the microanatomical location of cell subsets with downstream molecular or functional analyses; a goal that has traditionally been difficult to achieve. The development of stable photoactivatable biological fluorophores and their integration into reporter strains has recently enabled precise microanatomical labeling and tracking of cellular subsets in murine models. Here, we describe how the ability to analyze autoreactive lymphocytes from single germinal centers may help to provide novel insights into autoimmunity, using the combination of a novel chimeric model of autoimmunity with a photoactivatable reporter as an example. We demonstrate a procedure for generating mixed chimeras with spontaneous autoreactive germinal centers populated by lymphocytes carrying a photoactivatable green fluorescent protein reporter. Using in vivo labeling strategies, single germinal centers can be visualized in explanted lymphoid tissues and their cellular constituents photoactivated by two-photon microscopy. Photoactivated lymphocytes from single germinal centers can then be analyzed or sorted flow cytometrically, as single cells or in bulk, and may be subjected to additional downstream molecular and functional analyses. This approach may directly be applied to provide renewed insights in the field of autoimmunity, but the procedure for generating bone marrow chimeras and the photoactivation procedure may additionally find broad application in studies of infectious diseases and tumor metastases.

This protocol describes the generation of mixed murine bone marrow chimeras with spontaneous autoimmune germinal centers, in which autoreactive lymphocytes carry a photoactivatable green fluorescent protein (PA-GFP) reporter. This provides the ability to link cellular location in tissues with downstream molecular and functional analyses.

Interrogando i centri germinali autoreattive individuali di fotoattivazione in un modello misto chimerico dell'autoimmunità

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

<meta charset="utf8"></head><body>Controllo optogenetico dell'attività enzimatica mediante interruttore allosterico regolato dalla luce

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most optogenetic approaches often face significant challenges in integrating multiple capabilities in a single tool applicable to a wide range of target proteins. Achieving precise control over ON/OFF kinetics, ensuring minimum leakiness in the dark, and demonstrating efficient performance in mammalian cells with subcellular precision are some of the most common challenges faced in this field. A promising solution lies in the application of rationally designed light-sensitive domains to allosterically control protein activity. Using that strategy, we generated an optogenetic method combining all the desired features. The approach involves the incorporation of the Light-regulated allosteric switch module (LightR) in the target protein to regulate enzyme activity using blue (465 nm) light. The LightR domain is generated by linking two Vivid (VVD) photoreceptor domains, creating a light-sensitive clamp that can be incorporated into a small flexible loop within the catalytic domain of an enzyme. In its dark state, LightR clamp is open, thus distorting the enzyme&#39;s catalytic domain and inactivating it. Upon exposure to blue light, the LightR domain closes and restores the catalytic domain&#39;s structure and enzyme activity. In this manuscript, we discuss design strategies&#160;to generate a light-regulated protein kinase and demonstrate its control by blue light, reversibility, kinetics, and precise regulation at the subcellular level, enabling tight spatiotemporal precision. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, we showcase a protocol for effectively regulating LightR-Src kinase activity. We also demonstrate LightR applicability across different enzyme classes, expanding the utility of the tool system in addressing mechanistic questions of signaling pathways in different diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

This protocol describes the application of an engineered blue-light-activated allosteric switch (LightR) domain for reversible spatiotemporal control of protein activity. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, this study offers an elaborate protocol for developing and characterizing light-regulated Src (LightR-Src). It demonstrates the versatility of this approach across enzyme classes.

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Riepilogo

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Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine associate segnalazione

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Uso della tecnologia di MHC di singola catena di indagare Co-agonismo in umano CD8 + attivazione delle cellule T

Interrogando i centri germinali autoreattive individuali di fotoattivazione in un modello misto chimerico dell'autoimmunità

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

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Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

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Uso della tecnologia di MHC di singola catena di indagare Co-agonismo in umano CD8 + attivazione delle cellule T

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Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine associate segnalazione