우리는 조언과 지원을 위한 Huse 실험실의 구성원 감사. 미국 국립 보건원 (R01-AI087644 수소) 및 P30-CA008748 기념 슬로 안-Kettering 암 센터에 의해 지원.

1입니다. 물질로 유리 표면 준비
<ol><li>Biotinylated 폴 리-L-리 신 (바이오-PLL)와 코트 8 잘 연 발 coverglass 희석 증류수, 이온을 제거 된 물 (ddH2O) 1: 500. 실 온 (RT)에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>H2o. 세척</li>
	<li>실시간에서 2 시간 건조</li>
	<li>블록 바이오-PLL 실시간에서 30 분 동안 차단 버퍼 (HEPES 버퍼링 염 분 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], 2 %BSA)와 표면 코팅<ol>
<li>폴 리-L-리 신 hydrobromide 10mm NaPO4, pH 8.5의 1 ml에서의 5 mg을 디졸브.</li>
		<li>(에서 DMSO에 100mg/mL 주식) NHS-비오 틴의 125 μmol (0.55 밀리 그램)를 추가 하 고 반응의 pH를 확인. PH 8.5이 하 있는 경우에, pH 8.5와 9.5 사이 그것을 인상 4 N NaOH의 2 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 소용돌이입니다.</li>
		<li>20 mM Tris pH 8.0에에서 녹아 100mm 글리신의 50 μ와 반응을 끄다.</li>
		<li>10 분에 대 한 전체 전력에서 회전 시키십시오 그리고 새로운 튜브에는 상쾌한 전송. 참고: 바이오-PLL 품질은 일반적으로에 비해 이전 준비 직렬 2 배 희석 96-잘 ELISA 접시에 재료의 코팅 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 가진 외피 streptavidin 결합 후 biotin 콘텐츠 측정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>블로킹 버퍼를 제거 합니다. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다. Streptavidin (블로킹 버퍼에서 100 µ g/mL)를 추가 합니다. 1 h 4 ° c.에 품 어</li>
	<li>HBS에 씻어. 와 반전 챔버 슬라이드 웰 스 4-5 번, 우물에서 HBS를 제거. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>표면에 biotinylated pMHC ligands 및 접착 분자를 추가 합니다. 참고: MCC 및 OVA 수 직교-nitrobenzyl를 추가 하 여 photocaged 기반 키 lysines의 ε 아미노 그룹을 보호 그룹 (예: nitrophenylethyl (NPE) 또는 nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) (고객 센터, OVA에서 k 7에에서 K12). Photocaged 고객 센터 및 OVA 상업용 공급 업체에서 얻을 수 있습니다. 수성 버퍼에서 재구성, 후 bacterially 표현된-Ek 와 h 2 Kb 설립된 접근11,12를 사용 하 여 refolded 있습니다 그들은.</li>
	<li>Photoactivatable 고객 센터 또는 OVA 펩타이드의 유효성 검사<ol>
<li>휴대용 UV 램프와 UV 해 여 NVOC 보호 펩 티 드 decage ( 재료의 표참조) 실시간에서 20 분</li>
		<li>펄스 1.0 x 105 APCs nonstimulatory 펩 티 드 (부정적인 컨트롤, 예를 들면 Hb)의 1 개의 µ M를 1 시간에 대 한 조사 photoactivatable 펩 티 드, 펩 티 드 photoactivatable 그리고 주 작동 근 펩 티 드 (긍정적인 통제, 예를 들어, 고객 센터) unirradiated 37 ° c.에서 하룻밤</li>
		<li>5 c.를 표현 하는 T 세포를 자극 하 C7/2B4/앤 TCR, CH12 또는 CH27 B 세포를 사용 합니다. OT1 T 세포를 자극, RMA s 또는 EL4 thymoma 셀을 사용 합니다.</li>
		<li>T 세포에의 동등한 수와 함께 펄스 APCs를 혼합 96-200의 최종 볼륨 하단 플레이트 라운드 잘 µ L. 12-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>각 우물에서는 supernatants 복구와 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 색도계 검출 ELISA에 의해 일리노이-2를 분석 합니다. 참고: 모든 펩 티 드 MHC 복합물으로 refolding 전에 분무 질량 분석에 의해 배우면 자격의 확인이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>폴딩 및 빛에 노출을 최소화 하기 위하여 MHC의 정화를 수행 합니다. 예를 들어 포장 알루미늄 호 일에 반응을 접는 고 오프 UV 램프와 젤 여과 크로마토그래피를 실시. 참고: 그것은 그 photoactivatable 고객 센터-난-Ek 를 발견 되었으며 OVA-H2-Kb 불완전 한 기능 고른다면으로 인해 높은 밀도에서 UV 독립 T 세포 활성화를 유도 합니다. 따라서, photoactivatable pMHC nonstimulatory pMHC (예: -Ek 헤모글로빈64-76 펩 티 드 (Hb) 포함)의 10-30 x 초과로 동원 정지 단계 희석은. 이 신호 대 잡음 비 후속 이미징 실험의 향상.</li>
	<li>Photoactivate CD4+ T 총칭 biotinylated Hb-난-Ek (3 µ g/mL), biotinylated photoactivatable 고객 센터-난-Ek (0.1 µ g/mL), 및 biotinylated 클래스에 대 한 항 체의 혼합물을 사용 하는 세포, MHC H2-Kk I (0.5 µ g / mL). 안티-H2-Kk 항 체 장려 5 c. C7/2B4/와 T 세포 H2-Kk, 정품 인증을 진행 하지 않고 유리 표면에 확산을 표현.</li>
	<li>CD8에 대 한+ T 세포, biotinylated h 2 Db 펩 티 드 KAVYDFATL 베어링의 혼합 사용 (1 µ g/mL), biotinylated photoactivatable OVA-H2-Kb (0.1 µ g/mL), 및 접착 분자 ICAM-1의 세포 외 도메인 (2 µ g/mL 곤충 세포 문화13생산). ICAM-1 T 세포 표면에서 LFA1 integrin 참여 하 여 가까운 접촉 형성을 장려 한다.</li>
	<li>RT에 1 시간 또는 2 시간 이상 4 ° c.에 외피 다음 블로킹 버퍼에 모든 단백질 혼합물을 적용 참고: 수 µ m2 당 8000 ~ 이런이 종류의 표면에 분자 밀도 이전 결정된6되었습니다. Photoactivatable pMHC ~1/30 대표는일 biotinylated 단백질 표면에, 그것의 밀도의 µ m2, decaging 이전 당 ~ 267 분자를 될 것입니다.</li>
	<li>1.6 단계에서 세척 하 고 사용 하 여 준비까지 HBS에 두고.</li>
	<li>200000 CD4 추가+ 또는 CD8+ T 세포 각 우물에 적절 한 TCR을 표현 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 준수 하는 셀. 일단 세포는에 연결 하 고 표면에 확산, 그들은 photoactivation 및 이미징에 대 한 준비가 되었습니다. 참고: 효과 기 T 세포 형광 이미징 프로브와 Retroviral 변환 세부 elswhere6,7에 설명 되어 있습니다. 칼슘 신호 수 있습니다 또한 공부 될 칼슘 민감한 염료 Fluo-46로드 untransduced T 세포를 사용 하 여. 비율 염료 Fura-2 decaging photoactivatable pMHC의 유도 또한 UV 범위에서 여기 필요 하기 때문에 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>2. 이미지 수집
<ol><li>거꾸로 TIRF 현미경 이미지 수집을 위한 UV 호환 150 X 객관적 렌즈와 복을 사용 합니다. UV 100 W 수은 램프 (HBO)에 연결 된 디지털 다이어 프 램 시스템을 사용 하 여 사용자 정의 영역을 비추는. UV 400 nm 긴 패스 미러를 사용 하 여 샘플에이 램프에서 빛을 직접.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 지역화 된 photoactivation 및 시간 경과 수집에 대 한. 대부분 실험에서 모두는 녹색 및 빨강 채널에서 488를 사용 하 여 프로브를 모니터링 및 561 nm 여기 레이저, 각각. 레이저 빛은 또한 UV 범위 (decaging 사용)에서 전송 듀얼 대역 통과 dichroic 거울을 사용 하 여 샘플에 지시 된다. 현미경 구성에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 와 그림 6 을 참조 하십시오.</li>
	<li>T 세포를 포함 하는 챔버 슬라이드를 장착, TIRF 또는 epifluorescence 조명, 필요에 따라 얻기 위해 설정을 조정 합니다. 라이브 모드로 형광 probe(s)을 표현 하는 셀의 필드를 선택 합니다. 소프트웨어 제어를 사용 하 여 개별 셀 아래 photoactivation 미크론 단위 영역을 설정 합니다.</li>
	<li>시간 경과 수집을 시작 합니다. 일반적으로, 5의 간격 80 timepoints 인수는 각 시간 포인트 사이 s. 이것은 순차적 488에 대 한 더 충분 한 시간 및 듀얼 컬러 실험의 경우 563 nm 노출.</li>
	<li>10 timepoints, photoactivate 디지털 다이어 프 램을 열어서 선택된 영역 1-1.5 s 셔터 후</li>
	<li>시간 경과 후 셀의 새 필드를 선택 하 고 과정을 반복.</li>
</ol>3. 데이터 분석
참고: 고정된 ligands의 지역화 된 photoactivation 신호 응답 cytoskeletal 개장 이벤트의 정량 분석을 위해 사용 될 수 있는 잘 정의 된, 고정 된 물질로 영역을 만듭니다. 프로토콜은 일반적으로 조사 지역 내에서 형광 강도 측정 하거나 위치 끝점으로 거리 측정을 위한 조사 영역을 사용 하 여 포함 하는 분석 (예. 분극에 centrosome의 평가 조사 지역)입니다. 두 분석 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다. 강도 및 거리 측정, 다음 추가 처리 및 분석에 대 한 출력 수 있는 다양 한 대화형 이미지 분석 프로그램을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>
형광 강도
	<ol>
<li>셀 (FIb) 밖에 배경 영역의 형광 강도 (FI)를 결정 합니다. 이 배경 보정을 위해 사용 됩니다.<ol>
<li>셀 외부 미크론 크기의 사각형 영역을 그릴 하 고 마스크. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다. 참고: 절차 세부 정보 (예: 3.1.1.1) Slidebook 소프트웨어를 참조 하십시오 ( 재료의 표참조). 다른 소프트웨어 패키지를 사용 하 여이 프로토콜의 구현 (예., 피지) 약간 다를 수 것입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 시간 지점에 대 한 photoactivated 지역 내에서 인터넷을 결정 합니다.<ol>
<li>마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택 합니다. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>배경을 FI 지역 내에서 측정된 된 FI 값에서 뺍니다. 그런 다음 평균으로 나누어 수정된 FI 측정 표준화, 배경 수정 photoactivation 전에 처음 9 프레임의 FI. Δ/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). 참고: 그래프 δ/F 시간의 기능으로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
거리
	<ol>
<li>X 및 y 좌표는 photoactivated 지역의 중심의.<ol>
<li>X 및 y를 확인 하려면 photoactivated 지역의 중심의 좌표 마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택. Photoactivation의 지역 강조 되 면 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.</li>
		</ol>
</li>
		<li>X 및 y 결정 각 시간 지점에 대 한 관심의 형광 프로브에 대 한 좌표. 이것은 수동 또는 자동 입자 추적을 통해 일반적으로 달성 된다.<ol>
<li>X 및 y를 확인 관심, 형광 프로브의 좌표 수동 입자 추적 을 선택 하 고 시간이 지남에 따라 관심의 형광 프로브에 클릭. 일단 모든 시간 포인트 추적 된 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.</li>
		</ol>
</li>
		<li>관심사의 형광 단백질 및 방정식을 사용 하 여 각 시간 지점에 photoactivated 지역의 중심 사이의 거리를 계산: 거리 = √ ((2x x-1)2+ (y2y-1)2), x2 와 y는2 에 관심과 x1 과 y1 의 형광 단백질의 좌표는 photoactivated 지역의 중심의 좌표.</li>
		<li>시간의 기능으로 거리 그래프입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. 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E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. 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저자는 공개 없다.

최근 몇 년 동안, 라이트는 세포질 과정의 spatiotemporally 제어 활성화를 위한 훌륭한 도구로 떠오르고 있다. 다양 한 방법론 개발 되었습니다, 각각 관련 장점과 단점. 고정, extracellular ligands의 decaging에, 기반으로, 여기에 설명 된 시스템은 급속 한, subcellular, 편광 신호 응답의 분석에 대 한 이상적으로 적합 합니다. 이 방법은 위에서 설명한 T 세포에는 대형 검사에 적용 되었습니다. 또한, 다른 수용 ?...

T 림프 톨 (T 세포) 항 원 펩 티 드의 세포 표면 MHC 컨텍스트에서 표시를 인식 하 여 세포 면역에 중심 역할을 재생 합니다. TCR에 의해 중재 되는 항 원 인식, naïve T 세포의 분화를 구동 하 고 이펙터 인구에 의해 cytolytic와 의사 소통 응답의 납품을 촉진. TCR 참여는 또한 세포질 구조에 극적인 변화를 유도 한다. 분 이내에, T 세포 면역학 시 냅 스 (IS)1,2로 알려진 편광된 인터페이스를 형성 하는 항 원 제시 세포 (APC)의 측에 gloms. IS cytokines의, 또는 세포 독성 T 세포 (Ctl), 송출 파괴 용균성 단백질의 경우 방향 릴리스를 사용 하 여 T 세포 효과 기 응답을 potentiates.
PMHC에 의해 TCR 참여 활성화의 T 세포 (위도), 궁극적으로 시 냅 스 골격2의 강력한 리 모델링 추진에 대 한 링커를 포함 한 여러 다운스트림 어댑터 분자의 급속 한 인 산화를 유도 한다. 대뇌 피 질의 filamentous 말라 (F-말라) T 세포 APC 표면 확산을 다음 IS 주변 및 중앙에서 고갈에 F-말라 축적으로 특징 고리 모양의 구조를 확인 한다. F-말라 반지 형성 인터페이스의 중심 바로 아래 위치에 microtubule 조직 센터 (MTOC, T 세포에서는 centrosome 라고도)의 재교육에 밀접 하 게 결합 이다. 두 이벤트는 초기 항 원 인식의 분 이내 발생 하 고 후속 활성화 이벤트와 이펙터 응답 발생 건축 컨텍스트 설정.
공부 하 고는 형성, 다양 한 실험실 접근 송출 고정된 TCR ligands를 포함 하거나 지원 자체 ligands3,4를 포함 하는 지질 bilayer 유리 표면에 의해 대체 됩니다 개발 했습니다. T 세포는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRF) 또는 confocal 현미경 검사 법, 초기 T 세포 활성화 및 IS 형성의 고해상도 연구를 활성화 하 여 몇 군데 수 있습니다이 표면에 IS 같은 연락처를 형성 합니다.
하지만이 방법을 완벽 하 게 조립된 IS의 뛰어난 시각화에 대 한 허용, 신호 다음 TCR:pMHC 결 찰의 많은 초 이내에, TCR 활성화를 정확 하 게 다음 사건의 순서를 결정 하는 노력을 복잡 하 게 발생 . 이 문제를 우회 하는 photoactivation 방식 개발 되었습니다, TCR 활성화5,,67의 spatiotemporal 제어를 달성 하기 위해 사용 되는 photoactivatable pMHC. 이 시스템에서 T 세포는 비 물질로 TCR까지 자외선 (UV)을 조사 하는 photoactivatable pMHC를 포함 하는 유리 표면에 부착 됩니다. UV 방사선의 T 세포 아래 표면 미크론 크기의 지역 T 세포에 의해 인식 될 수 있는 물질로 영역을 만드는 photocage를 제거 합니다. 이후 신호 이벤트와 cytoskeletal 개장 다음 유전자 인코딩된 형광 기자를 사용 하 여 모니터링 됩니다. 항 원 펩 티 드, 엄 시 토 크롬 c88-103 (MCC)와 ovalbumin257-264 (OVA), 선물 된다 II MHC-Ek 클래스와 클래스의 맥락에서 나 MHC H2-Kb, 각각의 2 개의 photoactivatable 버전 되었습니다 (그림 1)를 개발 했다. 그러면 두 CD4의 분석+ T 세포 (표현 5 C. 고객 센터-난-Ek 에 대 한 특정 C7, 2B4, 또는 모양과 TCRs)와 CD8+ T 세포 OVA-H2-Kb (OT1 TCR 표현)에 대 한 특정.
지난 10 년간, TCR photoactivation 및 이미징 접근은 이용 되어 신호 단계 초기 TCR의 정확한 활동을 설정 하 고 또한 편광된 cytoskeletal 개장5, 를 경 세 하는 분자 경로 식별 하 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 예를 들어 분석 결과 그 centrosome 결정에서 쓸모 있었다 송출 쪽으로 재교육 가운데는 IS에 지질 두 번째 메신저 diacylglycerol의 지역화 된 그라데이션에 의해 중재입니다. 이 방법론의 T 세포 기능 고해상도 이미징 분석을 요구 하는 응용 프로그램에 대 한 가치가 있을 나갈 것입니다 예상 된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

T 림프 톨 급속 하 고, 편광 신호에 종사 하는 TCR 활성화 다음 분 이내 발생. 이 면역 시 냅 스, T 세포 활성화를 조절 하 고 이펙터 응답을 대상으로 하는 진부한 셀 교차로의 형성을 유도 합니다. 이러한 프로세스를 효과적으로 공부 하기 빠르고, 편광 응답 캡처에 맞춤화 된 이미징 접근 필요 하다. 이 프로토콜 기반으로 photoactivatable 펩 티 드-주요 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)는 자외선에 노출 될 때까지 비 물질로 이러한 시스템을 설명 합니다. Videomicroscopy 실험 동안 타겟 decaging이 시 약의 TCR 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 및 고해상도 이미징 총 내부 반사 (TIRF) 이후 세포 응답의 모니터링 수 있습니다. 이 방법은 또한 유전과 약리 섭 동 전략와 호환 됩니다. 면역학 시 냅 스의 기반이 되는 편광 cytoskeletal 구조의 형성에 TCR 신호를 연결 하는 잘 정의 된 분자 통로의 어셈블리에 대 한 수 있습니다.

Photoactivation 및 이미징 접근 관찰과 급속 하 고, 편광 신호 응답의 손쉬운 정량화 할 수 있습니다. 복제의 기능을 설명 하기 위해 여기 TCR 유도 DAG 축적과 centrosome 재교육 사이 spatiotemporal 상관 관계를 조사 하는 실험 이다. 5 C. C7 T 셀 폭발 했다 2 명의 형광 기자 불리고 retrovirally: 단백질 키 니 아 제 C θ에서에서 탠덤 C1 도메인 포함 된 DAG 바이오 센서는 centrosome 모니터링 GFP (...

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.1K 조회수.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

비디오: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

연구

면역학 및 감염병학

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...