Grazie sono dovuti a Genia Brodsky per la figura grafica; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman per la consulenza tecnica e assistenza con i due fotoni uncaging; Maayan tahor e Suliman Elsadin di assistenza tecnica; Uwe Strahle per la gentile fornitura della linea neurogenin1 reporter e Amos Gutnick dei commenti a questo manoscritto. La ricerca in laboratorio Levkowitz è supportato dal tedesco-israeliano Foundation (codice di autorizzazione 183/2007); Israel Science Foundation (codice di autorizzazione 928/08) e la Harriet &amp; Marcel Dekker Foundation. GL è un operatore della Cattedra Career Development Tauro nella ricerca biomedica.

Descriviamo un protocollo di etichettatura delle cellule utilizzando fluoresceina in gabbia, però, altre foto-attivabili coloranti e proteine ​​possono essere utilizzate allo stesso modo. 1. L&#39;iniezione di fluorescina Caged <ol><li> Preparare soluzione madre 5% (5 mg in gabbia-fluoresceina / 100 microlitri KCl 0,2 M) di destrano coniugato 4,5-dimetossi-2-nitrobenzyl (DMNB) in gabbia fluoresceina (10.000 MW destrano, anionici, Invitrogen, sonde molecolari, Carlsbad, CA , cat. no. D-3310). Aliquota e conservare in -20 ° C. Si noti che DMNB-gabbia fluoresceina è sensibile alla luce e dovrebbe essere tenuto al buio. </li><li> Preparare un trogolo di iniezione fatti di 1% agarosio (Sigma, St. Louis, MO, cat. No. A9539), come descritto in &quot;Il libro zebrafish&quot; 1. </li><li> Preparare 2 litri di media E3 diluendo un 100 x E3 soluzione madre. </li><li> La sera prima dell&#39;iniezione, preparare gabbie accoppiamento separazione del maschio (s) dalla femmina (s) della linea desiderata transgenici che esprimono un punto di riferimento visibile fluorescente (GFP, RFP, ecc) utilizzati per localizzare le cellule bersaglio per fotoattivazione. </li><li> Preparare aghi da iniezione capillare (a parete sottile vetro Capillari con filamento, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, cat. No. TW100F-6) con un estrattore micropipetta (strumento Sutter, Novato, CA, P-97). </li><li> Scongelare una aliquota del 5% in gabbia fluorescina sul ghiaccio. </li><li> Diluire il 5% in gabbia soluzione madre fluoresceina in KCl 0,2 M ad una concentrazione finale di 1%, e tenere in ghiaccio. Evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Accoppiamento installazione attraversa preparato al punto 4. </li><li> Raccogliere le uova fecondate non appena sono previste. Orientare cellule di embrioni in fase di stampo ad iniezione agarosio rivestì E3 1. </li><li> Utilizzando una punta microloader (Eppendorf, Amburgo, Germania, cat. No. 956,003 5242) riempimento un ago da iniezione con ~ 1 ml di 1% in gabbia soluzione fluoresceina. </li><li> Luogo carico ago in un micromanipolatore collegato a un alimentati a gas microinjector (pneumatico picopump, World Strumenti di precisione, Sarasota, FL, PV820). </li><li> Regolare il volume di iniezione di 2-3NL e iniettare il gabbia-fluoresceina direttamente nel citoplasma della cellula. Iniettare un minimo di 50 embrioni per sperimentare. </li><li> Incubare gli embrioni al buio a 28,5 ° C nella E3 allo stadio di sviluppo desiderato. Se gli embrioni più di 24 ore dopo la fecondazione vengono analizzati, aggiungere 0,1% phenylthiourea (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. No. 22290-9) per inibire la pigmentazione. </li></ol> 2. Embrione di montaggio <ol><li> Preparare una soluzione fresca E2 (cfr. parte soluzioni; può essere conservato a 4 ° C per una settimana). </li><li> Cappotto 60 millimetri Petri con un sottile strato di agarosio 1% sciolto in media E2. </li><li> Preparare il 2% di agarosio a basso punto di fusione (Ultra Pure agarosio LMP, Invitrogen, Carlsbad, CA, il gatto non 16520100..) Per l&#39;incorporamento: sciogliere l&#39;agarosio in acqua sterile bidistillata da riscaldamento a microonde fino a ebollizione. Mantenere tappo del tubo è aperto durante il riscaldamento. Aliquota 1 ml in provette da microcentrifuga e tenere su una piastra riscaldante a 72 ° C. </li><li> Rimuovere il chorions degli embrioni tirando delicatamente il corion a parte con una pinza tagliente (n. 5). Mantenere gli embrioni in soluzione E2 su agar-rivestito piatto (vedi punto 2). Dechorionated embrioni devono essere trattati con il fuoco lucidato vetro pipetta Pasteur in quanto possono attenersi a pipette polipropilene. Evitare di esporre l&#39;embrione dechorionized per aria come questi embrioni potrebbe essere danneggiato dalla tensione superficiale del liquido. </li><li> Raccogliere l&#39;embrione selezionato in un piccolo volume di E2 con un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur, e posto l&#39;embrione sul piatto 60 mm Petri. Montare una goccia (~ 150 mL) del 2% agarosio (fase 3) accanto l&#39;embrione. Rapidamente mescolare le due gocce per ottenere una miscela omogenea finale ~ 1% di agarosio e utilizzando un microscopio da dissezione orientare l&#39;embrione con il suo lato dorsale di fronte alla lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Attendere che l&#39;agarosio si è solidificato e aggiungere medio E2 fino a quando l&#39;embrione incorporato è immerso in un liquido. Si preferisce ottenere un singolo embrione per piatto come può essere liberato dal agarosio dopo il processo di fotoattivazione. </li></ol> 3. Fotoattivazione <ol><li> Usiamo un Zeiss LSM 510 META NLO microscopio a due fotoni dotati di banda larga sintonizzabile (700-1020nm) Mai Tai-HP-laser al femtosecondo da Spectraphysics. </li><li> Posizionare l&#39;embrione montato su un portatarga sotto il microscopio. Il punto di riferimento fluorescente negli embrioni viene visualizzato per mezzo 40x/0.8W acqua Achroplan immerso obiettivo. Per le seguenti operazioni che usiamo non descanned rivelatore (NDD) con filtro passa banda (BP) di 500-550nm. </li><li> Come prerequisito per il processo di fotoattivazione, ottenere informazioni spaziali fluorescenti della regione di interesse con l&#39;acquisizione di serie di immagini dalle più ventrale alla parte dorsale del segnale rilevato fluorescente, con due-fotone di lunghezza d&#39;onda laser di 860nm (per il rilevamento GFP). A tal fine, una risoluzione sufficiente può essere ottenuto usando un arco di 6μm tra ogni piano ha acquisito focale. </li><li> Selezionare la destinazionez-aereo per fotoattivazione e portare questa regione a fuoco. A seconda dello scopo dell&#39;esperimento, la regione di interesse può essere sia all&#39;interno o all&#39;esterno del punto di riferimento visibile GFP. Prendete una singola immagine in questo piano z. Salvare l&#39;immagine e tenerlo aperto in una finestra separata. </li><li> Impostare i due fotoni di lunghezza d&#39;onda laser a 720nm e quando il laser è in modo bloccato aprire la &#39;Modifica candeggina menu&#39;. Definire l&#39;area di interesse (ROI) per fotoattivazione secondo l&#39;immagine prese a 860nm (Fase 4) usando il menu &#39;Definire Regione&#39;. E &#39;fondamentale selezionare il ROI su questa immagine dopo lo spostamento della lunghezza d&#39;onda laser a 720nm come quest&#39;ultima azione cambia la x, y posizioni del campo osservato. </li><li> Regolare i seguenti parametri per fotoattivazione nel menu &#39;Modifica candeggina&#39; (vedi punto 9): a) potenza del laser relativa; b) numero di iterazioni, c) velocità di scansione. </li><li> &#39;Bleach&#39; stampa nella finestra &#39;Modifica candeggina&#39; e attende che cessi il laser. </li><li> Tornare a 860nm, acquisire una sola immagine aereo per valutare l&#39;intensità del materiale risultante fotoattivati ​​e una seconda serie di acquisizione delle immagini per valutare la Z-span (spessore) del dominio attivato. </li><li> Considerare i seguenti parametri per fotoattivazione: <ol class="lalpha"><li> Si dovrebbe empiricamente determinare le condizioni ottimali per fotoattivazione variando due parametri: intensità del laser e la durata della fotoattivazione. La potenza del laser relativa può essere controllato dal modulatore acusto-ottico (AOM) di trasmissione. La durata di fotoattivazione è una funzione del numero di iterazioni e velocità di scansione. </li><li> Determinare l&#39;intervallo lineare di intensità di fluorescenza in modo da evitare la saturazione della fluorescenza Uncaged. </li><li> Esiste una correlazione lineare tra l&#39;intensità ottenuto fluorescenza delle molecole Uncaged e l&#39;asse z durata del clone fotoattivati ​​2. </li></ol></li></ol> 4. Rilevazione del Fluoresceina Uncaged <ol><li> Dopo fotoattivazione, alzare gli embrioni al buio a 28,5 ° C in media E2 contenente 0,1% PTU per prevenire la comparsa di pigmentazione della pelle. </li><li> Allo stadio di sviluppo desiderato, rimuovere l&#39;embrione dal agarosio sotto un microscopio da dissezione. Usando un bisturi sottolineato, creare una incisione a forma di &quot;V&quot; nel agarosio vicino l&#39;embrione in modo che la &quot;V&quot; è rivolta verso la testa dell&#39;embrione. Posizionare una pinza chiusa nel punto di &quot;V&quot; vicino alla testa di un embrione e spingere delicatamente aprire il forcipe che separa l&#39;agarosio per tutta la lunghezza dell&#39;embrione e rilasciando l&#39;embrione nel mezzo. </li><li> Raccogliere gli embrioni con un fuoco lucido pipetta Pasteur e fissare con paraformaldeide (PFA, 4% nel 1 x PBS, pH 7,2) sia per 3 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di fissativo e sciacquare 2-3 volte in PBST per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare gli embrioni con 100% di metanolo per 10 minuti, riempire con il metanolo fresco e incubare a -20 ° C per almeno 2 ore. </li><li> Reidratare embrioni da incubazioni consecutive (5 minuti ciascuno) in una serie di metanolo diluito in PBSTr: 80%, 60%, 40% e 20%. Lavare 2 x 10 minuti in PBSTr. </li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in 500 ml di soluzione di blocco. </li><li> Aggiungi un anti-fluoresceina-fosfatasi alcalina (AP) frammenti Fab (Roche, Palo Alto, CA, cat. No. 11426338910), diluito 1:500 nella soluzione di blocco e incubare una notte a 4 ° C (tubi da microcentrifuga posto su un fianco) . </li><li> Lavare 5 x 15 minuti in PBST. </li><li> Lavare per 5 minuti in NaCl 0,2 M in TNT. </li><li> Lavare per 5 minuti a 0.4M NaCl in TNT. </li><li> Equilibrare 3 x 5 minuti in appena preparato soluzione Prestain. </li><li> Sciogliere un Fast Red compressa (Roche, Palo Alto, CA, cat. No. 11496549001) in 2 mL di soluzione Prestain. Si consiglia di filtrare la soluzione con carta Whatman n ° 2 di omettere un-dissolto particelle. In alternativa, spin down soluzione e utilizzare il liquido chiaro sopranatante. </li><li> Aggiungere 500 microlitri soluzione Fast Red per ogni tubo, incubare al buio a temperatura ambiente, e il colore sorvegliare l&#39;evoluzione fino alla desiderata segnale-fondo il rapporto è raggiunta (20 minuti a diverse ore). Se lo sfondo si sviluppa, il trasferimento a 4 ° C. Dopo un&#39;ora di incubazione, riempire con una nuova soluzione rapida colorazione rossa. </li><li> Arrestare la reazione di colorazione da 3 x 5 minuti lava in PBST. </li><li> Fix per 20 minuti nel 4% PFA a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 2 x 5 minuti in PBST. </li><li> Embrioni chiaro attraverso una serie di 25%, 50% e 75% glicerolo in PBS fino a quando gli embrioni sono regolati sul fondo della provetta. Gli embrioni possono essere conservati a 4 ° C per pochi giorni. </li></ol> 5. Visualizzazione fluorescente dello Spazio Uncaged <ol><li> Preparare un vetrino da microscopio per il montaggio: utilizzando una siringa da 1 ml applicare quattro macchie di grasso al silicone trasparente sul vetrino, poste ad una distanza di ~ 15mm l&#39;uno dall&#39;altro. Montare l&#39;embrione allo center in ~ 200 ml di 75% glicerolo e mettere un coprioggetto (n. 0; 18x18mm) in alto e spingere delicatamente contro il silicone fino a quando la soluzione di glicerolo occupa la superficie tra le diapositive. </li><li> Posizionare l&#39;embrione montato sul palco e portarlo a fuoco con un obiettivo 40x. Acquisire un confocale Z-serie di immagini utilizzando 488nm e 543nm laser Argon HeNe come fonte di eccitazione. </li><li> L&#39;asse z durata del dominio photoactivatated possono essere analizzati utilizzando la ricostruzione 3D di un embrione Uncaged utilizzando un software di analisi dell&#39;immagine. </li></ol> 6. Soluzioni <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mm NaCl, KCl 21mm, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0.3M NaCl, 10mM KCl, 20 mM CaCl 2 * 2HOH, 20 mM MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtrato e conservare a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> Diluire 20 x E2 in acqua bidistillata e aggiungere appena fatto NaHCO 3 (a una concentrazione finale di 0,7 mm), penicillina e streptomicina (soluzione diluita di streptococco penna per una concentrazione finale di 1 x, che contiene 100 U di penicillina e streptomicina 100 mg per mL (Invitrogen , Carlsbad, CA, cat. no. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0,1% Tween-20 in PBS </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> Triton 0,3% in PBS </td></tr><tr><td> Soluzione bloccante </td><td> 10% di BSA, Triton 0,3%, 1% di DMSO in PBS </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl 150 mm, 0,5% Tween-20 in acqua bidistillata </td></tr><tr><td> Prestain soluzione </td><td> 100mM Tris-HCl pH 8.2, 0.4M NaCl, 0,1% Tween-20 in acqua bidistillata </td></tr></tbody></table> 7. Rappresentante Risultati Un esempio di utilizzo di microscopia a due fotoni per photoactivate agenti in un embrione di zebrafish vivente è presentato. Utilizzando un approccio simile è già tracciato la stirpe dei fotoattivati ​​progenitori etichettato neurali nel cervello zebrafish 2,3. La figura 1 mostra fotoattivazione di una gabbia colorante tracciante fluoresceina coniugato in piastra neurale anteriore di embrioni di zebrafish portando un neurog1:: GFP giornalista transgene, che serviva come punto di riferimento vivo intrinseca. Gli embrioni sono stati iniettati con fluoresceina in gabbia in fase di una cella e incorporati in agarosio in fase di germoglio. A 3 - 5-somite fase le coordinate spaziali sono stati misurati nel neurog1:: GFP embrione transgenico per determinare la regione di interesse (ROI) per uncaging (Figura 1A, A &#39;). Noi Uncaged il tracciante lignaggio fluoresceina in un dominio specifico della piastra neurale (Figura 1B, B &#39;). Successivamente, il destino di questo dato sottodominio etichettati progenitrici neurali è stato determinato in prim5 (24 ore dopo la fecondazione), tappa per immunocolorazione delle Uncaged fluoresceina (Figura 1C, C &#39;). Il grado di due fotoni uncaging laser, cioè l&#39;intensità della fluorescenza Uncaged e lo spessore del dominio fotoattivati ​​(z-span), può essere controllata regolando due parametri: intensità del laser e la durata. Quest&#39;ultimo può essere controllata dalla regolazione del numero di iterazioni e la velocità di scansione (vedi parte 3, punto 9; Russek-Blum, 2009). Nell&#39;esempio mostrato nella Figura 1, abbiamo usato potere relativo laser di trasmissione AOM 12%, 20 iterazioni e velocità di scansione di 25,6 msec / pixel. Utilizzando queste impostazioni abbiamo etichettato come contenente ROI 9-10 cellule e un fotoattivati ​​z-arco di 30μm (~ 1-2 righe delle celle). <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un risultato rappresentante di fotoattivazione di fluoresceina in gabbia in embrione zebrafish dal vivo utilizzando la microscopia a due fotoni. Schematica illustrazione (AC) e immagini rappresentative (A&#39;-C &#39;) del processo di fotoattivazione. Vivere embrione zebrafish (A, A &#39;) che esprimono GFP sotto il controllo di neurogenina-1 promotore (neurog1:: GFP) che è stato iniettato in gabbia con fluoresceina tracciante colorante nella fase 1 cella. Al 3-5 - fase somite, una zona discreta del primordio prosencefalo (diencefalo) è stato fotoattivati ​​e il Uncaged fluoresceina tracciante colorante potrebbe essere rilevato (B, B &#39;). A seguito della procedura di fotoattivazione, l&#39;embrione è stato incubato a 28,5 ° C e le cellule cerebrali contenenti la fluoresceina Uncaged sono state tracciate da anti-fluoresceina immunocolorazione a 24 ore dopo la fecondazione (HPF, C, C &#39;). Dien, Diencefalo;. Tel., telencefalo..

<ol>
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Photo-attivabili composti sono molecole la cui funzione è mascherato fino a quando non sono illuminati con una specifica lunghezza d&#39;onda (di solito UV), inducendo una reazione fotochimica che converte le molecole in uno stato chimicamente o biologicamente attive. Queste sonde forniscono strumenti molto potenti per la ricerca di biologia delle cellule, poiché l&#39;attivazione può essere controllato con precisione temporalmente e spazialmente, limitando la loro esposizione alla luce. ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

Fotoattivazione di composti target in un organismo vivente si è dimostrato un valido approccio per studiare vari processi biologici quali lo sviluppo embrionale, segnalazione cellulare e la fisiologia adulta. A questo proposito, l&#39;uso del multi-fotone microscopia permette fotoattivazione quantitativa di un dato agente luce reattivo nei tessuti profondi con una risoluzione singola cella. Come embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, il loro sviluppo può essere monitorata in vivo. Queste caratteristiche rendono il pesce zebra un organismo modello perfetto per controllare l&#39;attività di una varietà di agenti chimici e le proteine ​​dalla luce concentrata. Qui si descrivono l&#39;uso della microscopia a due fotoni per indurre l&#39;attivazione di chimicamente in gabbia fluoresceina, che a sua volta ci permette di seguire il destino delle cellule in vivo embrioni di zebrafish. Noi usiamo gli embrioni che esprimono un punto di riferimento vivo genetica (GFP) per individuare con precisione obiettivi e le cellule di interesse. Questa procedura può essere utilizzata allo stesso modo per un preciso attivazione luce indotta di proteine, ormoni, molecole di piccole dimensioni e altri composti in gabbia.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l&#39;uso di questa tecnologia per l&#39;etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  Weizmann Institute of Science. Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l'uso di questa tecnologia per l'etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.

Video: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...