Agradecemos a los miembros del laboratorio de Huse para asesoramiento y asistencia. El apoyo de los Estados Unidos institutos nacionales de salud (R01-AI087644 a M.H.) y P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. preparación de superficies de vidrio estimulante
<ol><li>Cubre-objetos de capa bien ocho cámara con biotinilado poli-l-lisina (Bio-PLL) diluyen 1: 500 en agua destilada, desionizada (ddH2O). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavado con H2O.</li>
	<li>Secado por 2 h a TA.</li>
	<li>Bloque de Bio-PLL cubrió superficies con solución amortiguadora de bloqueo (HEPES-solución salina con tampón [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) por 30 min a TA.<ol>
<li>Disolver 5 mg de bromhidrato de poli-l-lisina en 1 mL de 10 mM NaPO4, pH 8.5.</li>
		<li>Añadir 125 μmol (0,55 mg) del NHS-biotina (de un stock de 100 mg/mL en DMSO) y compruebe el pH de la reacción. Si el pH está por debajo de 8.5, añadir 2 μL de 4 N NaOH para elevarla a entre pH 8.5 y 9.5.</li>
		<li>Vortex durante 30 minutos.</li>
		<li>Calmar la reacción con 50 μL de 100 mM glicina disuelta en 20 mM Tris de pH 8,0.</li>
		<li>Girar a plena potencia durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Nota: Calidad de Bio-PLL es típicamente comparado con anteriores preparaciones por capa dos diluciones en serie del material sobre una placa de ELISA de 96 pocillos y cuantificar el contenido de biotina tras incubación con fosfatasa alcalina unida estreptavidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire el amortiguador de bloqueo. No permita que los pozos se sequen. Añadir estreptavidina (100 μg/mL en solución amortiguadora de bloqueo). Incubar durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lave en HBS. Llenar e invierta pozos de diapositiva de cámara 4 - 5 veces, quitando HBS de los pozos. No permita que los pozos se sequen.</li>
	<li>Añadir el biotinilado pMHC ligandos y moléculas de adhesión a la superficie. Nota: MCC y los óvulos pueden ser photocaged mediante la adición de ortho-Nitrobencilo basado en grupos de protección (por ejemplo, nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) para el grupo ε-amino de lisinas claves (K12 en MCC, K7 en OVA). Photocaged MCC y los óvulos pueden obtenerse de proveedores comerciales. Después de la reconstitución en buffer acuoso, ellos son replegados en bacteriano expresada-Ek y H2-Kb utilizando enfoques establecidos11,12.</li>
	<li>Validación del péptido MCC o OVA photoactivatable<ol>
<li>Decage péptidos NVOC protegido por irradiación UV con una lámpara UV de mano (véase Tabla de materiales) por 20 min a TA.</li>
		<li>Pulso 1.0 x 105 vehículos blindados con 1 μm de péptido nonstimulatory (control negativo, por ejemplo, Hb), irradiados photoactivatable péptido péptido photoactivatable irradiado y péptido de agonista (control positivo, por ejemplo, MCC) durante 1 h a durante la noche a 37 ° C.</li>
		<li>Para estimular células T expresando el C. 5 C7/2B4/y TCR, uso CH12 o células B CH27. Para estimular las células de T de OT1, utilizar RMA-s o EL4 thymoma células.</li>
		<li>Mezclar el APCs pulsadas con igual número de células T en 96 pocillos redondos placas de fondo en un volumen final de 200 μl. incubar a 37 ° C durante 12-24 h.</li>
		<li>Recuperar el sobrenadante de cada pozo y analizar IL-2 por ELISA con detección colorimétrica de peroxidasa estreptavidina-rábano. Nota: Se recomienda confirmación del estado de los péptidos por espectrometría de masas por electrospray antes refolding en complejos de MHC, jaulas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar el plegado y la purificación de MHC con el fin de minimizar la exposición a la luz. Por ejemplo, envuelven reacciones de plegamiento de papel de aluminio y llevar a cabo cromatografía de gel filtración con la lámpara Ultravioleta de. Nota: Se ha encontrado photoactivatable MCC-Ek y OVA - H2-Kb inducir la activación de células T independientes de UV en alta densidad, posiblemente debido a la incompleta jaulas funcional. Por lo tanto, la photoactivatable pMHC se diluye en un 10-30 x exceso de pMHC nonstimulatory (e.g. -Ek que contiene el péptido de64-76 de hemoglobina (Hb)) durante la etapa de inmovilización. Esto mejora la relación señal a ruido del experimento de imágenes posteriores.</li>
	<li>Para Fotoactivar CD4+ T las células, colectivamente utilizan una mezcla de biotinilado Hb-Ek (3 μg/mL), biotinilado photoactivatable MCC-Ek (0,1 μg/mL) y el anticuerpo biotinilado contra la clase I MHC H2-Kk (0,5 μg / mL). los anticuerpos de anti-H2-Kk anima a 5 C. C7/2B4/y T las células, que expresan H2-Kk, extender sobre la superficie de vidrio sin sufrir activación.</li>
	<li>Para CD8+ T células, use una mezcla de biotinilado H2 Db teniendo el péptido KAVYDFATL (1 μg/mL), biotinilado photoactivatable OVA-H2-Kb (0,1 μg/mL) y el dominio extracelular de la molécula de adhesión ICAM-1 (2 μg/mL producido por insectos de la célula cultura13). El ICAM-1 favorece la formación contacto cercana enganchando la integrina LFA1 en la superficie de la célula de T.</li>
	<li>Aplicar todas las mezclas de proteínas en solución amortiguadora de bloqueo, seguido por incubación durante 1 h a temperatura ambiente o por lo menos 2 h a 4 ° C. Nota: La densidad molecular en las superficies de este tipo que ~ 8000 por μm2 ha sido previamente6. Que pMHC photoactivatable representa ~1/30to de la proteína biotinilada en la superficie, su densidad será ~ 267 moléculas por μm2, antes de decaging.</li>
	<li>Lavar como en el paso 1.6 y deje en HBS hasta que esté listo para usar.</li>
	<li>Añadir 200.000 CD4+ o CD8+ T expresan el TCR adecuado en cada pocillo de las células y permitir que las células se adhieran a 37 ° C durante 15 minutos. Una vez las células se han unido a la extensión en la superficie, están listos para la fotoactivación y proyección de imagen. Nota: Transducción Retroviral de células efectoras T con fluorescente puntas de prueba de la proyección de imagen se describe en detalle cordón6,7. Señalización de calcio también se puede estudiar usando las células de T untransduced con el tinte sensible del calcio Fluo-46. El tinte radiométrica Fura-2 no se recomienda porque requiere excitación en el rango de UV, que también induce la decaging de la photoactivatable pMHC.</li>
</ol>2. adquisición de la imagen
<ol><li>Usar un microscopio TIRF invertido con un objetivo X UV 150 compatible para la adquisición de la imagen. UV irradiar regiones definidas por el usuario mediante un sistema de diafragma digital conectado a una lámpara de mercurio de 100 W (HBO). Luz de esta lámpara sobre la muestra utilizando un espejo de pase largo 400 nm UV directa.</li>
	<li>Utilizar software de análisis de imagen para la fotoactivación localizada y adquisición de Time-lapse. En la mayoría de los experimentos, controlar las puntas de prueba en los canales rojos y verdes con 488 nm y 561 láseres de excitación nm, respectivamente. Luz láser se dirige sobre la muestra utilizando un espejo dicroico de doble banda que transmite también en la gama ultravioleta (para decaging). Por favor vea la Tabla de materiales y la figura 6 para obtener información adicional sobre la configuración del microscopio.</li>
	<li>Después de montar el portaobjetos de la cámara que contiene las células de T, ajuste la configuración para obtener iluminación TIRF o epifluorescencia, según sea necesario. En modo live, seleccione el campo de las células que están expresando la sonda fluorescente de interés. Establecer regiones de microescala para la fotoactivación por debajo de las células individuales utilizando el software de control.</li>
	<li>Comenzar la adquisición de Time-lapse. Por lo general, se adquieren los puntos de 80 tiempo, con un intervalo de 5 s entre cada punto del tiempo. Esto deja tiempo más que suficiente para secuencial 488 nm y 563 exposiciones nm, en el caso de los experimentos de doble color.</li>
	<li>Después de 10 puntos de tiempo, Fotoactivar las regiones seleccionadas al abrir el diafragma digital del obturador de 1-1.5 s.</li>
	<li>Una vez finalizado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de las células y repetir el proceso.</li>
</ol>3. Análisis de los datos
Nota: Fotoactivación localizada de ligandos inmovilizados crea una región estimuladora bien definida y estacionaria, que puede utilizarse para el análisis cuantitativo de la señalización de las respuestas y eventos remodelación citoesqueleto. Análisis de protocolos generalmente involucran cuantificación de la intensidad de fluorescencia dentro de la región irradiada o utilizando la región irradiada como un extremo posicional para medidas de distancia (ej. para evaluar la polarización del centrosoma a la irradiado a región). A continuación se describen ambos protocolos de análisis. Varios programas de análisis de imagen interactiva pueden utilizarse para hacer intensidad y medidas de la distancia, que pueden ser salida de procesamiento adicional y análisis.
<ol><li>
Intensidad de fluorescencia
	<ol>
<li>Determinar la intensidad de fluorescencia (FI) de una región de fondo fuera de la célula (FIb). Esto se utilizará para la corrección de fondo.<ol>
<li>Dibuja una región cuadrada de tamaño micrométrico fuera de la célula y hacer una máscara. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación. Nota: Ver detalles de procedimiento (p. ej. 3.1.1.1) software Slidebook (véase Tabla de materiales). Aplicación del presente Protocolo con otros paquetes de software (por ej., FIJI) será ligeramente diferente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinar la FI dentro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo.<ol>
<li>Seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Restar el fondo FI de los valores medidos de FI dentro de la región. Entonces, normalizar las mediciones de FI corregidas dividiendo por la media, antecedentes corrección FI de los primeros 9 marcos antes de fotoactivación. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Nota: El gráfico ΔF/F como una función del tiempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distancia
	<ol>
<li>Obtener x e y coordenadas del centro de la región de fotoactivado.<ol>
<li>Para determinar x e y coordenadas del centro de la región de Fotoactivado, seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Una vez que se destaca la región de fotoactivación, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinar x e y las coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés para cada momento. Esto se logra normalmente a través de rastreo de partículas ya sea manual o automatizado.<ol>
<li>Para determinar x e y coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés, seleccione Manual de seguimiento de partículas y haga clic en la punta de prueba fluorescente de interés con el tiempo. Una vez que han sido rastreados todos los puntos de tiempo, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular la distancia entre la proteína fluorescente de interés y el centro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo usando la ecuación: distancia = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), en que x2 y y2 son las coordenadas de la proteína fluorescente de interés y x1 y y1 son las coordenadas del centro de la región de fotoactivado.</li>
		<li>Gráfico de la distancia en función del tiempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. 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J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los últimos años, la luz ha surgido como una excelente herramienta para la activación spatiotemporally controlada de procesos celulares. Diversas metodologías se han desarrollado, cada uno con desventajas y ventajas asociadas. El sistema descrito aquí, que se basa en la decaging de ligandos inmovilizados, extracelulares, es ideal para el análisis de las respuestas de señalización rápidas, subcelulares, polarizados. Este enfoque se ha aplicado para examinar la formación es en las células T como se describió...

Los linfocitos T (células T) juegan un papel central en la inmunidad celular mediante el reconocimiento de péptidos antigénicos en el contexto de la superficie de la célula MHC. Reconocimiento del antígeno, que es mediada por el TCR, conduce a la diferenciación de células ingenuas T y promueve la entrega de respuestas citolíticas y comunicativas por poblaciones efectoras. Participación de TCR también induce cambios dramáticos en la arquitectura celular. Dentro de minutos, las células T gloms sobre el lado de la célula presentadora de antígeno (APC), formando una interfaz polarizada conocida como sinapsis inmunológica (es) de1,2. LA potencia respuestas de células T efectoras habilitando la direccional liberación de citoquinas o, en el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruyen el APC.
Participación de TCR por pMHC induce la fosforilación rápida de múltiples moléculas de adaptador aguas abajo, incluyendo a Linker para las activación de las células T (LAT), que en última instancia promueve fuerte remodelación del citoesqueleto sináptico2. Cortical actinia filamentosa (F-actina) unidades de la célula de T que se separa sobre la superficie de la APC y entonces se resuelve en una estructura anular, caracterizada por la acumulación de la F-actina en la periferia es y agotamiento del centro. Formación del anillo de F-actina se acopla firmemente a la reorientación del centro organizador de microtúbulos (MTOC, también llamado centrosoma en las células de T) a una posición justo debajo del centro de la interfaz. Ambos eventos ocurren dentro de minutos del reconocimiento del antígeno inicial y establecen el contexto arquitectónico en que eventos posteriores de activación y efectora se producen las respuestas.
Para estudiar es formación, varios laboratorios han desarrollado enfoques que la APC se sustituirá por una superficie de vidrio que contiene ligandos inmovilizados de TCR o apoya una bicapa lipídica que sí mismo contiene los ligandos3,4. Las células T forman contactos es-como en estas superficies que pueden ser reflejadas por el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o microscopía confocal, lo que permite estudios de alta resolución de activación temprana de la célula de T y es la formación.
Aunque estos enfoques han permitido la visualización excelente del totalmente montado, gran parte de la ligadura de TCR:pMHC siguiente señalización ocurre dentro de segundos, que complica los esfuerzos para determinar la secuencia de eventos después de la activación del TCR con precisión . Para evitar este problema, se ha desarrollado un enfoque de fotoactivación, que pMHC photoactivatable se utiliza para lograr un control spatiotemporal de TCR activación5,6,7. En este sistema, las células T se unen a las superficies de vidrio que contienen pMHC photoactivatable que es no estimulantes para el TCR hasta irradiados con luz ultravioleta (UV). La radiación UV de una región de micras de tamaño de la superficie debajo de la célula T quita la photocage crear una zona estimulante que puede ser reconocida por la célula de T. Posteriores eventos de señalización y remodelación citoesqueleto entonces son monitoreados utilizando reporteros fluorescentes genéticamente codificados. Dos versiones de photoactivatable de péptidos antigénicos, polilla citocromo c88-103 (MCC) y ovoalbúmina257-264 (OVA), que se presentan en el contexto de la clase II MHC-Ek y la clase I MHC H2-Kb, respectivamente, han sido desarrollados (figura 1). Esto permite el análisis de ambos CD4+ T las células específicas para MCC-Ek (expresando lo 5 C. C7, 2B4, o y TCR) y CD8+ T las células específicas para OVA-H2-Kb (expresan el TCR de OT1).
En la última década, el enfoque de fotoactivación y proyección de imagen de TCR se ha utilizado para establecer la cinética precisa de TCR primeros pasos de señalización y también para identificar las vías moleculares que regulan la remodelación citoesqueleto polarizados5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por ejemplo, el ensayo era instrumental en la determinación de que el centrosoma reorientación hacia la APC está mediado por un gradiente localizado de lo lípidos segundo mensajero diacilglicerol centrada en el es. Se prevé que esta metodología seguirá siendo valioso para aplicaciones que exigen análisis proyección de imagen de alta resolución de la función de la célula de T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

Los linfocitos T participan en la señalización rápida, polarizado, que ocurre dentro de minutos después de la activación del TCR. Esto induce la formación de la sinapsis inmunológica, una ensambladura del estereotipado de la célula que regula la activación de la célula de T y direccionalmente apunta las respuestas efectoras. Para estudiar con eficacia estos procesos, es necesario un enfoque imagen adaptado para capturar respuestas rápidas, polarizadas. Este protocolo describe un sistema, que se basa en un photoactivatable péptido mayor complejo de histocompatibilidad (pMHC) que es no estimulante hasta que se expone a la luz ultravioleta. Decaging objetivo de este reactivo durante experimentos de videomicroscopía permite exacto control espacio-temporal de la activación del TCR y vigilancia alta resolución de posteriores respuestas celulares por reflexión interna total (TIRF) proyección de imagen. Este enfoque también es compatible con estrategias de perturbación genética y farmacológica. Esto permite el montaje de vías moleculares bien definidas que vinculan la señalización del TCR a la formación de las estructuras citoesqueléticas polarizadas que subyacen en la sinapsis inmunológica.

El enfoque de fotoactivación y proyección de imagen permite observación y fácil cuantificación de respuestas señalización rápidas, polarizadas. Para ilustrar sus capacidades, reproducidos aquí es un experimento examinando la correlación espacio-temporal entre la acumulación inducida por TCR DAG y reorientación del centrosoma. 5C. T C7 celular ráfagas fueron retrovirally transduced con dos reporteros fluorescentes: un biosensor de DAG que contienen los dominios C1 de tándem d...

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K vistas.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

Video: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...