Il Specialità fertilizzante Products Company (SFP) è riconosciuto per fornire i fondi necessari per questo studio.

1. Campioni Preparazione <ol><li> Preparare 2 ml della soluzione enzimatica e 0,5 ml di soluzione di substrato per ogni prova sperimentale. Diluire le soluzioni madre concentrate di enzima e substrato in soluzione tampone avente composizione identica per ridurre al minimo il calore di diluizione e miscelazione durante l&#39;aggiunta del substrato. <ol><li> Scegliere le condizioni di buffer che siano adeguati a prevenire il cambiamento del pH durante l&#39;esperimento. Ad esempio, HEPES 20 mM pH 7 è sufficiente per misurazioni a pH neutro. NOTA: Se scambio protonico è coinvolto, entalpie di protonazione dei buffer utilizzati devono essere considerati, in quanto influenzano l&#39;AH misurato della reazione. Possibili effetti specifici del buffer o additivi molecole del sistema sotto analisi devono essere presi in considerazione. Se solventi organici (ad esempio DMSO) sono inclusi nella soluzione enzimatica, aggiungerli alla stessa concentrazione nella soluzione substrato. </li><li> Per l&#39;esperimento M1, avviarecon concentrazione dell&#39;enzima nell&#39;intervallo nM (ad esempio, 1 nM) e con una concentrazione del substrato almeno tre ordini di grandezza superiore alla concentrazione dell&#39;enzima e sopra il K M. </li><li> Per l&#39;esperimento M2, iniziare con concentrazione dell&#39;enzima nel range pm-nM (ad esempio 15 pM). Concentrazione del substrato nella siringa è nell&#39;intervallo mM (ad esempio 400 mM). NOTA: Nell&#39;esperimento M1 singola iniezione, le concentrazioni dovrebbero essere sufficienti per ottenere la conversione totale del substrato nel prodotto nel tempo sperimentale. Pertanto, la concentrazione dell&#39;enzima dipende dal tasso di enzima: se gli enzimi di bassa k gatto sono in fase di studio, le concentrazioni enzimatiche più elevate (fino a 10 micron) devono essere usate. D&#39;altra parte, le concentrazioni di enzima usato nell&#39;esperimento M2 deve assicurare che il substrato iniettato è solo marginalmente (meno del 5%) consumata e che la reazione enzimatica procede allo stato stazionario. Per questo motivo, maggiore è laefficienza enzima, più bassa è la concentrazione di enzima necessario. Alla fine dell&#39;esperimento, concentrazione del substrato nella cella campione deve essere superiore K M. </li></ol></li><li> Controllare attentamente enzimi e concentrazioni di substrato con una procedura analitica appropriata (ad es assorbanza a 280 nm, colorimetrici, saggi BCA 11. Ciò è necessario per ottenere il calcolo preciso e affidabile dei parametri termodinamici e cinetici. </li><li> Misurare il pH delle soluzioni e verificare che il disallineamento pH sia della soluzioni substrato enzimatico ed è minima nelle condizioni sperimentali (± 0,05 unità di pH). </li></ol> 2. Esecuzione dell&#39;esperimento NOTA: La stessa procedura deve essere applicata sia per la M1 e M2 dell&#39;esperimento, che vengono eseguiti uno dopo l&#39;altro. <ol><li> Verificare che la cella porta-campione e la siringa di iniezione vengono puliti secondo il produttore delistruzioni. Riempire la siringa caricamento fornito con lo strumento con acqua distillata, inserire delicatamente l&#39;ago nella cella campione, riempire la cella e rimuovere il liquido usando la stessa siringa. Usando questo metodo, lavare la cella campione due volte con acqua distillata e due volte con il tampone. </li><li> Caricare la cella campione con 2 ml di soluzione enzimatica utilizzando la siringa carico, evitando accuratamente la formazione di bolle d&#39;aria. Iniettare lentamente la soluzione nella cella finché non fuoriesce all&#39;inizio della cellula staminale. Produrre un getto di ca. 0,25 ml di soluzione nella cella. Ripetere due volte. Questo passaggio rimuove le bolle d&#39;aria intrappolate nella cella del campione. </li><li> Posizionare l&#39;ago della siringa caricamento sulla sporgenza tra lo stelo e la cella porta cellulare e rimuovere la soluzione in eccesso. </li><li> Avviare il programma VP-Viewer e, dall&#39;interfaccia computer equilibrare lo strumento ITC ad una temperatura di 3 ° C inferiore alla temperatura sperimentale desideri. Questo è necessario per evitare lunghe equilibraturaperiodi precedenti l&#39;esperimento, a causa del dispositivo di raffreddamento passivo strumentale. </li><li> Riempire la cella di riferimento con acqua distillata con la stessa procedura di cui sopra. Quando buffer con elevata forza ionica o elevata osmolalità sono nella soluzione campione, lo stesso buffer deve essere utilizzata come soluzione di riferimento. </li><li> Collegare una siringa di plastica alla porta di riempimento della siringa di iniezione, utilizzando un tubo in silicone sottile. Riempire la siringa mettendo la punta dell&#39;ago in acqua e stesura, fino a quando l&#39;acqua esce dal porto di riempimento superiore, indicando che la siringa è pieno. Quindi spostare la punta della siringa da acqua e redigere aria, per svuotare la siringa. Con questa procedura, lavare la siringa con tampone, e aspirare aria attraverso il sistema. Successivamente, posizionare l&#39;ago di iniezione in uno stretto tubo contenente 0,5 ml di soluzione di substrato, elaborare accuratamente e riempire completamente la siringa di iniezione, lasciando piccola quantità di soluzione al fondo della provetta. </li><li> Dallainterfaccia del computer, premere il tasto &quot;Chiudi la porta di riempimento&quot;. Rimuovere il tubo di carico silicio. Premere &quot;Purge e ricarica&quot; ​​per consentire la siringa per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria e di espellere di nuovo nella soluzione di massa. Ripetere due volte. </li><li> Spostare la siringa di iniezione, pulire sui lati per rimuovere eventuali gocce e inserire l&#39;ago della siringa nella cella per campioni. </li><li> Sul computer, impostare i parametri di funzionamento appropriati. L&#39;enzima sperimentale e concentrazioni di substrato possono essere indicati. <ol><li> Nell&#39;esperimento M1, impostare almeno due aggiunte (5-30 microlitri) di supporto per verificare la riproducibilità. Impostare il tempo di distanza tra ciascuna iniezione (ad esempio 1.000 sec) sufficientemente grande da garantire che il segnale di calore ritorna al basale prima della successiva aggiunta. </li><li> Nell&#39;esperimento M2, impostare multiple (ad esempio 15 x 5-10 microlitri) iniezioni. Impostare l&#39;intervallo tra le iniezioni (ad esempio 180 sec) consente al sistema di stabilize la potenza termica per la nuova linea di base dopo ogni iniezione. NOTA: Il tempo spaziatura tra iniezioni nell&#39;esperimento M2 dovrebbe essere sufficientemente breve da evitare la conversione di una notevole quantità di substrato, consentendo le misurazioni da effettuare in condizioni stazionarie. </li><li> Nell&#39;esperimento M2, usare piccoli volumi (ad esempio 2 mL) per la prima iniezione, il cui valore corrispondente viene scartato durante la successiva analisi dei dati. Infatti, spesso presenta artefatti dovuti alla diffusione substrato iniziale attraverso la siringa, e per la presenza di bolle d&#39;aria intrappolate nel ago della siringa. </li><li> Impostare la potenza di riferimento, il livello approssimativo in cui la linea di base viene posizionato prima la reazione si inneschi, ad un valore di 20. Quindi definire l&#39;enzima sperimentale e concentrazioni di substrato e ha scelto un nome per l&#39;esperimento. </li><li> Definire la temperatura sperimentale, tipicamente a 25 ° C. ITC permette temperature di lavoro tra i 2<html> ° C e 80 ° C. L&#39;esperimento è pronto per l&#39;esecuzione. Premere il tasto &quot;Start&quot; per avviare l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;esperimento è finito, pulire la cella porta-campione e la siringa seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno uno o due più volte per verificare la riproducibilità dei dati. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Dal programma di analisi, fare clic sul pulsante &quot;Leggi i dati&quot;, e passare alla cartella in cui si trova il file. Itc dell&#39;esperimento M2 eseguita. Fare clic sulla freccia di scorrimento verso il basso del &quot;File di tipo&quot; e selezionare &quot;Enzima Assay (vero?)&quot;. Successivamente, fare clic e aprire il file. Itc dell&#39;esperimento M2. </li><li> Avere la AH della reazione da integrare la curva dell&#39;esperimento M1 secondo l&#39;equazione 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Leggi i dati&quot;, e selezionare il file. Itc dell&#39;esperimento M1 eseguita. Utilizzando Origin, dividere la traccia in diverse parti contenenti un picco e salva ogni picco come un file opj.. Aprire il file corrispondente al primo picco, risultante dalla deviazione basale nel termogramma dell&#39;esperimento singolo M1 iniezione, integrarlo e dividere il valore dell&#39;area ottenuto, espressa in μcal, dalla concentrazione del substrato finale nella cella campione, espresso in micron, e dal volume delle cellule espresso in litri, determinare, secondo l&#39;equazione 5, la AH della reazione. </li><li> Ripetere la stessa procedura per il secondo picco dell&#39;esperimento M1 ed ottenere un valore medio per i due misurazioni AH. </li></ol></li><li> Determinare dQ / dt dall&#39;esperimento M2 misurando la differenza tra la linea di base originale e la nuova linea di base dopo ciascuna iniezione. Convertire l&#39;indirizzoXperimental dati a velocità di reazione secondo l&#39;equazione 4, utilizzando il valore di entalpia ottenuto nell&#39;esperimento M1 e approssimare i dati per l&#39;equazione di Michaelis-Menten. <ol><li> Dal programma di analisi, fare clic sul pulsante &quot;Leggi i dati&quot;, e selezionare il file. Itc dell&#39;esperimento M2 eseguita. Fare clic sulla freccia di scorrimento verso il basso del &quot;File di tipo&quot; e selezionare &quot;Enzima Assay (vero?)&quot;. </li><li> Si apre la finestra di dialogo Enzyme Assay, permettendo selezionando uno dei quattro modelli. Selezionare &quot;Metodo 2 - solo substrato&quot; dalla finestra. </li><li> Nella finestra AH, indicare il valore di AH ottenuto nel passaggio 4.2. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Concentrazione&quot; per verificare i valori di concentrazione da utilizzare nella procedura di montaggio. Fare clic sul pulsante &quot;Tempo medio (P)&quot;. La finestra di dialogo si apre dando la possibilità di cambiare o accettare il valore predefinito. Questo valore rappresenta il tempo prima di ogni iniezioneione in cui le medie strumento il segnale di alimentazione per determinare il livello di potenza ad ogni concentrazione del substrato. Fare clic su OK per confermare il valore predefinito. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Zero Asse Y&quot;. Il cursore si trasforma in una croce che consente di fare doppio clic su un punto, a mettere a y = 0. Fare doppio clic appena prima del primo punto di iniezione. </li><li> Fare clic sul pulsante Calcola Rate. Tasso è tracciata in funzione della concentrazione del substrato, ottenuta dividendo il substrato aggiunto durante la titolazione per il volume cella campione (tenendo conto degli effetti di diluizione). Questa operazione dà una tipica trama di Michaelis-Menten che può essere montato per ottenere K M e K cat. </li><li> Se alcuni punti dovrebbero essere cancellati, selezionare il pulsante &quot;Troncare dati&quot;. Spostare gli indicatori di dati per escludere i punti dati cattivi e fare doppio clic su uno dei marcatori o premere Invio. </li><li> Utilizzare la funzione &quot;Adatta al modello&quot; per adattare la curva eottenere le costanti cinetiche. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Significato della ITC per studiare l&#39;attività enzimatica rispetto ai metodi esistenti Oltre alle sue applicazioni classiche per studiare equilibri vincolanti, Calorimetria isotermica di titolazione fornisce un metodo affidabile e veloce per caratterizzare reazioni enzimatiche in soluzione utilizzando il calore di reazione come sonda, senza richiedere modifiche o etichettatura sistema. I parametri cinetici k gatto e K M sono solita...

Determinazione quantitativa di reazioni biochimiche fornisce approfondimenti sui processi biologici alla base della vita. Calorimetria offre una metodologia libero-label per caratterizzare quantitativamente praticamente ogni reazione chimica in soluzione. Questa tecnica misura il calore rilasciato o assorbito nel tempo, ed è quindi un sistema di rilevamento universale e una metodologia molto comodo per quantificare la quantità di molecole reagenti (cioè termodinamica vincolanti), nonché per misurare la velocità di reazione (cioè cinetica). In particolare, Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stato adottato come metodo di scelta per caratterizzare la termodinamica di equilibri biomolecolari, coinvolgendo proteina-ligando, proteina-proteina, proteina-ioni metallici e le interazioni proteina-DNA 1-6. Inoltre, la capacità di ITC di fornire informazioni cinetiche rende un sistema molto potente per misurare catalisi enzimatica, anche se il potenziale di questa applicazione è ancorasottovalutato 7-9. L&#39;equazione di Michaelis-Menten 10 è una descrizione quantitativa di reazioni enzimatiche, in quanto fornisce una relazione tra la velocità di reazione e la concentrazione del substrato, a seconda di due parametri cinetici: la costante di Michaelis (K M) e la costante di velocità catalitica (k cat) . Il gatto k / rapporto K M viene definito come l&#39;efficienza catalitica di un enzima. In pratica, la determinazione di K M e K gatto per una reazione specifica fornisce una descrizione completa della catalisi. In una tipica reazione enzimatica (Figura 1), un substrato (S) interagisce con l&#39;enzima (E) che formano il complesso enzima-substrato (ES), che viene successivamente attivato nello stato di transizione (ES *). Quest&#39;ultimo viene convertito nel complesso enzima-prodotto (EP) che alla fine si dissocia. Questi steps sono descritti dalla seguente reazione. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) dove k 1 è la costante di velocità per la formazione del complesso ES, k -1 è la costante di velocità per la dissociazione del complesso ES, mentre k gatto è la costante di velocità catalitica o numero di turnover. Secondo l&#39;equazione di Michaelis-Menten 10, la velocità di reazione può essere calcolato come: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) in cui M = K (k -1 + k cat) / k 1 ek cat = v max / [E], con v max essendo la velocità massima raggiunta quando tutti enzima è legato al substrato. La titolazione calorimetro isotermico è lo strumento utilizzato in questo studio per caratterizzare l&#39;idrolisi enzimatica dell&#39;urea. Questo strumento è costituito da uno scudo adiabatico contenente due cellule a forma coniati (Figura 1). Questi sono collegati all&#39;esterno con tubi accesso strette. La cella campione (ca. 1,4 ml) viene caricato con soluzione enzimatica, mentre la cella di riferimento è generalmente riempito con acqua o con il solvente utilizzato per l&#39;analisi. Una siringa rotante con un lungo ago e una pagaia stir divisoria, generalmente comprendente ca. 0,3 ml di soluzione di substrato, è montato sulla cella campione. Un dispositivo termoelettrico misura la differenza di temperatura tra il campione e la cella di riferimento e, utilizzando una &quot;rete di retroazione cella&quot;, mantiene questa differenza a zero aggiungendo o sottraendo calore. Durante l&#39;esperimento, il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica a temperatura costante scelta. Quando l&#39;enzymatic reazione ha luogo, la quantità di calore ceduto o assorbito è proporzionale al numero di molecole di substrato che vengono convertiti in molecole dei prodotti. Inoltre, il tasso di flusso di calore è direttamente correlata alla velocità di reazione. I dati misurati, che appare come una deviazione del tracciato calore dalla linea di base iniziale (Figura 1), rappresentano la potenza termica (μcal / sec) fornite dallo strumento alla cella campione, che è proporzionale al flusso di calore che si verificano nella cella campione nel tempo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di titolazione isotermico calorimetro per studiare reazioni enzimatiche. Una reazione enzimatica si produce in conseguenza titolazione del substrato (prodotto nella siringa) nella soluzione enzimatica (nella cella campione) determina una variazione del therpotere mal rilasciato dal calorimetro, necessario per mantenere la differenza di temperatura tra la cella campione e la costante di cella di riferimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Nel complesso, la variazione di calore (Q) è proporzionale alla entalpia molare della reazione (AH) e il numero di moli di prodotto generato (n), che a sua volta è dato dai tempi totali di volume la concentrazione: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) La formazione del prodotto nel tempo (dP / dt), che corrisponde alla velocità di reazione, può quindi essere correlato alla quantità di calore generato nello stesso tempo (dQ / dt) attraverso la relazione: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) Secondo questa equazione, al fine di ottenere un Michaelis-Menten trama è necessario misurare i) il totale entalpia molare AH, e ii) il flusso di calore dQ / dt a differenti concentrazioni di substrato. Solitamente, questa viene eseguita in due diversi esperimenti: nel primo esperimento (metodo 1, M1), il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica e il calore per la conversione completa del substrato viene misurata; Nel secondo esperimento (metodo 2, M2), iniezioni multiple di substrato vengono eseguite e il tasso di produzione di calore viene misurato a differenti concentrazioni di substrato. Questi due insiemi di dati sono sufficienti per ricavare i parametri cinetici K M e K cat. Nel presente articolo, un protocollo generale per determinare i parametri cinetici per le reazioni enzimatiche eseguite utilizzando ITC è descritto. Abbiamo applicato il metodo di urea all&#39;idrolisi da Canavalia ensiformis urease, come un sistema di riferimento. Il buon accordo tra i risultati ottenuti con questo metodo e dei dati riportati in letteratura dimostra l&#39;affidabilità di questo approccio.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td></tr><tr><td>TRIZMA-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>4270</td><td>dissolving in water</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>30427</td><td>dissolving in water</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U4128</td><td>dissolving in water at 40 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Canavalia ensiformis&lt;/em&gt; urease (type C-3)</td><td>Sigma</td><td>U0251</td><td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>VP-ITC on Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td>SYS13901</td><td>instrument&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td></td><td>data acquisition software supplied with the instrument</td></tr></tbody></table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è una tecnica ben descritto che misura il calore rilasciato o assorbito durante una reazione chimica, usandolo come una sonda intrinseca per caratterizzare praticamente ogni processo chimico. Oggi, questa tecnica è ampiamente applicata per determinare i parametri termodinamici di equilibri vincolanti biomolecolari. Inoltre, ITC ha dimostrato di essere in grado di misurare direttamente cinetiche e termodinamiche (cat k, K M, AH) di reazioni enzimatiche, anche se questa applicazione è ancora poco sfruttato. Come sbalzi termici avvengono spontaneamente durante la catalisi enzimatica, ITC non richiede alcuna modifica o etichettatura del sistema sotto analisi e può essere eseguita in soluzione. Inoltre, il metodo deve piccola quantità di materiale. Queste caratteristiche rendono ITC uno strumento prezioso, potente e unica di studiare cinetica enzimatica in diverse applicazioni, come, ad esempio, la scoperta della droga. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In questo lavoro un metodo basato su ITC sperimentale per quantificare la cinetica e termodinamica delle reazioni enzimatiche è accuratamente descritta. Questo metodo viene applicato per determinare k gatto e K M del idrolisi enzimatica dell&#39;urea da Canavalia ensiformis (fagiolo jack) ureasi. Viene eseguito il calcolo di entalpia molare intrinseca (AH int) della reazione. I valori così ottenuti sono coerenti con i dati precedenti riportati in letteratura, dimostrando l&#39;affidabilità del metodo.

Ureasi (CE 3.5.1.5; urea amidoidrolasi) è un enzima contenente nichel multisubunit trovato Archea, batteri, eucarioti e piante unicellulari. Questa proteina agisce nell&#39;ultima fase di mineralizzazione dell&#39;azoto organico, che catalizzano l&#39;idrolisi dell&#39;urea in ammoniaca e carbammato, che si decompone spontaneamente a dare una seconda molecola di ammoniaca e bicarbonato (Equazione 6) 12. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/5148...

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Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isotermico misure titolazione calorimetria flusso di calore rilasciato o assorbito nelle reazioni chimiche. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare enzima-catalisi. In questo documento, il protocollo per la configurazione strumentale, esperimento esecuzione e analisi dei dati è generalmente descritto, e applicato alla caratterizzazione di idrolisi enzimatica dell&#39;urea da jack bean ureasi.

Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

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20.5K Views.  University of Bologna.  Isotermico misure titolazione calorimetria flusso di calore rilasciato o assorbito nelle reazioni chimiche. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare enzima-catalisi. In questo documento, il protocollo per la configurazione strumentale, esperimento esecuzione e analisi dei dati è generalmente descritto, e applicato alla caratterizzazione di idrolisi enzimatica dell'urea da jack bean ureasi. 

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Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell&#39;antigene

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Ricerca

Biochimica

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial parameter to compare different ligands, e.g., competitive inhibitors, protein isoforms and mutants, for their binding strength to a binding partner. Dissociation constants are determined by plotting concentrations of bound versus free ligand as binding curves. In contrast, titration curves, in which a signal that is proportional to the concentration of bound ligand is plotted against the total concentration of added ligand, are much easier to record. The signal can be detected spectroscopically and by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This is exemplified in a protocol for a titration ELISA that measures the binding of the snake venom-derived rhodocetin to its immobilized target domain of &#945;2&#946;1 integrin. Titration ELISAs are versatile and widely used. Any pair of interacting proteins can be used as immobilized receptor and soluble ligand, provided that both proteins are pure, and their concentrations are known. The difficulty so far has been to determine the dissociation constant from a titration curve. In this study, a mathematical function underlying titration curves is introduced. Without any error-prone graphical estimation of a saturation yield, this algorithm allows processing of the raw data (signal intensities at different concentrations of added ligand) directly by mathematical evaluation via non-linear regression. Thus, several titration curves can be recorded simultaneously and transformed into a set of characteristic parameters, among them the dissociation constant and the concentration of binding-active receptor, and they can be evaluated statistically. When combined with this algorithm, titration ELISAs gain the advantage of directly presenting the dissociation constant. Therefore, they may be used more efficiently in the future.

A detailed protocol to perform a titration ELISA is described. Moreover, a novel algorithm is presented to evaluate titration ELISAs and to obtain a dissociation constant of binding of a soluble ligand to a microtiter plate-immobilized receptor.

Titolazione ELISA come un metodo per determinare la costante di dissociazione dell'interazione ligando del recettore

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed after a single injection of the substrate solution into an enzyme solution is correlated with enzyme activity. Multiple injections of the substrate into the same enzyme solution over time show the loss of enzyme activity. The assay is autonomous, requiring very little personnel time, and is applicable to most media and enzymes.&#160; &#160;

The thermal stability of enzyme activity is readily measured by isothermal titration calorimetry (ITC). Most protein stability assays currently used measure protein unfolding, but do not provide information about enzymatic activity. ITC enables direct determination of the effect of enzyme modifications on the stability of enzyme activity.

Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Ambiente

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Raccolta variabile concentrazione dataset Calorimetria isotermica di titolazione per determinare meccanismi vincolanti

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Biologia

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

Calorimetria isotermica di titolazione di misura macromolecola-ligando di affinità

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as an&#160;innovative source of such new compounds. One bottleneck in the process is typically the elucidation of their mode-of-action. We recently established isothermal microcalorimetry as part of a routine profiling pipeline. This technology allows for investigating the effect of antibiotic exposure on the total bacterial metabolic response, including processes that are decoupled from biomass formation. Importantly, bacteriostatic and bactericidal effects are easily distinguishable without any user intervention during the measurements. However, isothermal microcalorimetry is a rather new approach and applying this method to different bacterial species usually requires pre-evaluation of suitable measurement conditions. There are some reference thermograms available of certain bacteria, greatly facilitating interpretation of results. As the pool of reference data is steadily growing, we expect the methodology to have increasing impact in the future and expect it to allow for in-depth fingerprint analyses enabling the differentiation of antibiotic classes.

The elucidation of the mode-of-action of a novel antibiotic is a challenging task in the drug discovery process. The goal of the method described here is the application of isothermal microcalorimetry using calScreener in antibacterial profiling to provide additional insight into drug-microbe interactions.

Profilazione metabolica per determinare gli effetti batterici o batteriosfondi dei nuovi prodotti naturali utilizzando la microcalorimetria isotermica

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Bioingegneria

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Attività ATPasi per enzimatica Caratterizzazione

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Constant Pressure Calorimetry

Calorimetry is a technique used to measure the amount of heat involved in a chemical or physical process or to measure the heat transferred to or from a substance. The heat is exchanged with a calibrated and insulated device called the calorimeter. Calorimetry experiments are based on the assumption that there is no heat exchange between the insulated calorimeter and the external environment. The well-insulated calorimeters prevent the transfer of heat between the calorimeter and its external environment, which effectively limits the &ldquo;surroundings&rdquo; to the nonsystem components within the calorimeter (and the calorimeter itself). This enables the accurate determination of the heat involved in chemical processes, such as the energy content of foods.&nbsp;
The temperature change measured by the calorimeter is used to derive the amount of heat transferred by the process under study. In a calorimeter, a system is defined as the substance or substances undergoing the chemical or physical change, or in other words, the reaction, and the surroundings are all other matter, including the solution and any other components in the calorimeter that either provide heat to the system or absorb heat from the system.
Before discussing the calorimetry of chemical reactions, consider a simpler example that illustrates the core idea behind calorimetry. Suppose a hot piece of metal at a high-temperature is placed in a low-temperature substance, such as cool water. Heat will flow from the hot metal to the water. The temperature of the metal will decrease, and the temperature of the water will increase until the two substances have the same temperature&mdash;that is when they reach thermal equilibrium. If this occurs in a calorimeter, all of the heat is transferred between the two substances, with no heat gained or lost by its external environment. Under these ideal circumstances, the net heat change is zero:
<img alt="Eq1" src="https://www.jove.com/files/core/CDNSource/lessons/798/798_Equations-01.png" style="height: 40px;" />
This relationship can be rearranged to show that the heat gained by the metal is equal to the heat lost by substance the water:
<img alt="Eq2" src="https://www.jove.com/files/core/CDNSource/lessons/798/798_Equations-02.png" style="height: 40px;" />
The magnitude of the heat (change) is, therefore, the same for both substances. The negative sign merely shows that qmetal and qwater are opposite in direction of&nbsp;heat flow (gain or loss), but it does not indicate the arithmetic sign of either q value (that is determined by whether the matter in question gains or loses heat, per definition). In the specific situation described, qmetal is a negative value and qwater is a positive value since heat is transferred from the metal to the water.
When using calorimetry to determine the heat involved in a chemical reaction, the same principles apply. The amount of heat absorbed by the calorimeter is often small enough that it can most often be neglected, and the calorimeter minimizes energy exchange with the outside environment. When an exothermic reaction occurs in solution in a calorimeter, the heat produced by the reaction is absorbed by the solution, which increases its temperature. When an endothermic reaction occurs, the heat required is absorbed from the thermal energy of the solution, which decreases its temperature. The temperature change (&Delta;T), along with the specific heat (csoln) and mass of the solution (msoln), can then be used to calculate the amount of heat (qsoln) involved in either case.
<img alt="Eq3" src="https://www.jove.com/files/core/CDNSource/lessons/798/798_Equations-03.png" style="height: 40px;" />
A &nbsp;simple calorimeter &mdash; called the coffee cup calorimeter &mdash; is constructed from two nested polystyrene cups closed with a loose-fitting lid. Coffee cup calorimeters are used to measure the heat of reactions that take place in solutions (mostly aqueous solutions) and involve no or very little volume change. Because energy is neither created nor destroyed during a chemical reaction, the heat produced or consumed in the reaction (the &ldquo;system&rdquo;), qrxn, plus the heat absorbed or lost by the solution (the &ldquo;surroundings&rdquo;), qsoln, must add up to zero:
<img alt="Eq4" src="https://www.jove.com/files/core/CDNSource/lessons/798/798_Equations-04.png" style="height: 40px;" />
This means that the amount of heat produced or consumed in the reaction equals the amount of heat absorbed or lost by the solution:
<img alt="Eq5" src="https://www.jove.com/files/core/CDNSource/lessons/798/798_Equations-05.png" style="height: 40px;" />
The coffee cup calorimeter is a constant-pressure calorimeter, and the measured heat of the reaction is equivalent to the change in enthalpy.
<img alt="Eq6" src="https://www.jove.com/files/core/CDNSource/lessons/798/798_Equations-06.png" style="height: 40px;" />
This text is adapted from <a href="https://openstax.org/books/chemistry-2e/pages/5-2-calorimetry">Openstax, Chemistry 2e, Section 5.2: Calorimetry</a>.

Constant Pressure Calorimeter/ Coffee Cup Calorimeter

Calorimetria a pressione costante

Calorimetry is a technique used to measure the amount of heat involved in a chemical or physical process or to measure the heat transferred to or from a ...

Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

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Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell'antigene