Il Specialità fertilizzante Products Company (SFP) è riconosciuto per fornire i fondi necessari per questo studio.

1. Campioni Preparazione <ol><li> Preparare 2 ml della soluzione enzimatica e 0,5 ml di soluzione di substrato per ogni prova sperimentale. Diluire le soluzioni madre concentrate di enzima e substrato in soluzione tampone avente composizione identica per ridurre al minimo il calore di diluizione e miscelazione durante l&#39;aggiunta del substrato. <ol><li> Scegliere le condizioni di buffer che siano adeguati a prevenire il cambiamento del pH durante l&#39;esperimento. Ad esempio, HEPES 20 mM pH 7 è sufficiente per misurazioni a pH neutro. NOTA: Se scambio protonico è coinvolto, entalpie di protonazione dei buffer utilizzati devono essere considerati, in quanto influenzano l&#39;AH misurato della reazione. Possibili effetti specifici del buffer o additivi molecole del sistema sotto analisi devono essere presi in considerazione. Se solventi organici (ad esempio DMSO) sono inclusi nella soluzione enzimatica, aggiungerli alla stessa concentrazione nella soluzione substrato. </li><li> Per l&#39;esperimento M1, avviarecon concentrazione dell&#39;enzima nell&#39;intervallo nM (ad esempio, 1 nM) e con una concentrazione del substrato almeno tre ordini di grandezza superiore alla concentrazione dell&#39;enzima e sopra il K M. </li><li> Per l&#39;esperimento M2, iniziare con concentrazione dell&#39;enzima nel range pm-nM (ad esempio 15 pM). Concentrazione del substrato nella siringa è nell&#39;intervallo mM (ad esempio 400 mM). NOTA: Nell&#39;esperimento M1 singola iniezione, le concentrazioni dovrebbero essere sufficienti per ottenere la conversione totale del substrato nel prodotto nel tempo sperimentale. Pertanto, la concentrazione dell&#39;enzima dipende dal tasso di enzima: se gli enzimi di bassa k gatto sono in fase di studio, le concentrazioni enzimatiche più elevate (fino a 10 micron) devono essere usate. D&#39;altra parte, le concentrazioni di enzima usato nell&#39;esperimento M2 deve assicurare che il substrato iniettato è solo marginalmente (meno del 5%) consumata e che la reazione enzimatica procede allo stato stazionario. Per questo motivo, maggiore è laefficienza enzima, più bassa è la concentrazione di enzima necessario. Alla fine dell&#39;esperimento, concentrazione del substrato nella cella campione deve essere superiore K M. </li></ol></li><li> Controllare attentamente enzimi e concentrazioni di substrato con una procedura analitica appropriata (ad es assorbanza a 280 nm, colorimetrici, saggi BCA 11. Ciò è necessario per ottenere il calcolo preciso e affidabile dei parametri termodinamici e cinetici. </li><li> Misurare il pH delle soluzioni e verificare che il disallineamento pH sia della soluzioni substrato enzimatico ed è minima nelle condizioni sperimentali (± 0,05 unità di pH). </li></ol> 2. Esecuzione dell&#39;esperimento NOTA: La stessa procedura deve essere applicata sia per la M1 e M2 dell&#39;esperimento, che vengono eseguiti uno dopo l&#39;altro. <ol><li> Verificare che la cella porta-campione e la siringa di iniezione vengono puliti secondo il produttore delistruzioni. Riempire la siringa caricamento fornito con lo strumento con acqua distillata, inserire delicatamente l&#39;ago nella cella campione, riempire la cella e rimuovere il liquido usando la stessa siringa. Usando questo metodo, lavare la cella campione due volte con acqua distillata e due volte con il tampone. </li><li> Caricare la cella campione con 2 ml di soluzione enzimatica utilizzando la siringa carico, evitando accuratamente la formazione di bolle d&#39;aria. Iniettare lentamente la soluzione nella cella finché non fuoriesce all&#39;inizio della cellula staminale. Produrre un getto di ca. 0,25 ml di soluzione nella cella. Ripetere due volte. Questo passaggio rimuove le bolle d&#39;aria intrappolate nella cella del campione. </li><li> Posizionare l&#39;ago della siringa caricamento sulla sporgenza tra lo stelo e la cella porta cellulare e rimuovere la soluzione in eccesso. </li><li> Avviare il programma VP-Viewer e, dall&#39;interfaccia computer equilibrare lo strumento ITC ad una temperatura di 3 ° C inferiore alla temperatura sperimentale desideri. Questo è necessario per evitare lunghe equilibraturaperiodi precedenti l&#39;esperimento, a causa del dispositivo di raffreddamento passivo strumentale. </li><li> Riempire la cella di riferimento con acqua distillata con la stessa procedura di cui sopra. Quando buffer con elevata forza ionica o elevata osmolalità sono nella soluzione campione, lo stesso buffer deve essere utilizzata come soluzione di riferimento. </li><li> Collegare una siringa di plastica alla porta di riempimento della siringa di iniezione, utilizzando un tubo in silicone sottile. Riempire la siringa mettendo la punta dell&#39;ago in acqua e stesura, fino a quando l&#39;acqua esce dal porto di riempimento superiore, indicando che la siringa è pieno. Quindi spostare la punta della siringa da acqua e redigere aria, per svuotare la siringa. Con questa procedura, lavare la siringa con tampone, e aspirare aria attraverso il sistema. Successivamente, posizionare l&#39;ago di iniezione in uno stretto tubo contenente 0,5 ml di soluzione di substrato, elaborare accuratamente e riempire completamente la siringa di iniezione, lasciando piccola quantità di soluzione al fondo della provetta. </li><li> Dallainterfaccia del computer, premere il tasto &quot;Chiudi la porta di riempimento&quot;. Rimuovere il tubo di carico silicio. Premere &quot;Purge e ricarica&quot; ​​per consentire la siringa per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria e di espellere di nuovo nella soluzione di massa. Ripetere due volte. </li><li> Spostare la siringa di iniezione, pulire sui lati per rimuovere eventuali gocce e inserire l&#39;ago della siringa nella cella per campioni. </li><li> Sul computer, impostare i parametri di funzionamento appropriati. L&#39;enzima sperimentale e concentrazioni di substrato possono essere indicati. <ol><li> Nell&#39;esperimento M1, impostare almeno due aggiunte (5-30 microlitri) di supporto per verificare la riproducibilità. Impostare il tempo di distanza tra ciascuna iniezione (ad esempio 1.000 sec) sufficientemente grande da garantire che il segnale di calore ritorna al basale prima della successiva aggiunta. </li><li> Nell&#39;esperimento M2, impostare multiple (ad esempio 15 x 5-10 microlitri) iniezioni. Impostare l&#39;intervallo tra le iniezioni (ad esempio 180 sec) consente al sistema di stabilize la potenza termica per la nuova linea di base dopo ogni iniezione. NOTA: Il tempo spaziatura tra iniezioni nell&#39;esperimento M2 dovrebbe essere sufficientemente breve da evitare la conversione di una notevole quantità di substrato, consentendo le misurazioni da effettuare in condizioni stazionarie. </li><li> Nell&#39;esperimento M2, usare piccoli volumi (ad esempio 2 mL) per la prima iniezione, il cui valore corrispondente viene scartato durante la successiva analisi dei dati. Infatti, spesso presenta artefatti dovuti alla diffusione substrato iniziale attraverso la siringa, e per la presenza di bolle d&#39;aria intrappolate nel ago della siringa. </li><li> Impostare la potenza di riferimento, il livello approssimativo in cui la linea di base viene posizionato prima la reazione si inneschi, ad un valore di 20. Quindi definire l&#39;enzima sperimentale e concentrazioni di substrato e ha scelto un nome per l&#39;esperimento. </li><li> Definire la temperatura sperimentale, tipicamente a 25 ° C. ITC permette temperature di lavoro tra i 2<html> ° C e 80 ° C. L&#39;esperimento è pronto per l&#39;esecuzione. Premere il tasto &quot;Start&quot; per avviare l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;esperimento è finito, pulire la cella porta-campione e la siringa seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno uno o due più volte per verificare la riproducibilità dei dati. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Dal programma di analisi, fare clic sul pulsante &quot;Leggi i dati&quot;, e passare alla cartella in cui si trova il file. Itc dell&#39;esperimento M2 eseguita. Fare clic sulla freccia di scorrimento verso il basso del &quot;File di tipo&quot; e selezionare &quot;Enzima Assay (vero?)&quot;. Successivamente, fare clic e aprire il file. Itc dell&#39;esperimento M2. </li><li> Avere la AH della reazione da integrare la curva dell&#39;esperimento M1 secondo l&#39;equazione 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Leggi i dati&quot;, e selezionare il file. Itc dell&#39;esperimento M1 eseguita. Utilizzando Origin, dividere la traccia in diverse parti contenenti un picco e salva ogni picco come un file opj.. Aprire il file corrispondente al primo picco, risultante dalla deviazione basale nel termogramma dell&#39;esperimento singolo M1 iniezione, integrarlo e dividere il valore dell&#39;area ottenuto, espressa in μcal, dalla concentrazione del substrato finale nella cella campione, espresso in micron, e dal volume delle cellule espresso in litri, determinare, secondo l&#39;equazione 5, la AH della reazione. </li><li> Ripetere la stessa procedura per il secondo picco dell&#39;esperimento M1 ed ottenere un valore medio per i due misurazioni AH. </li></ol></li><li> Determinare dQ / dt dall&#39;esperimento M2 misurando la differenza tra la linea di base originale e la nuova linea di base dopo ciascuna iniezione. Convertire l&#39;indirizzoXperimental dati a velocità di reazione secondo l&#39;equazione 4, utilizzando il valore di entalpia ottenuto nell&#39;esperimento M1 e approssimare i dati per l&#39;equazione di Michaelis-Menten. <ol><li> Dal programma di analisi, fare clic sul pulsante &quot;Leggi i dati&quot;, e selezionare il file. Itc dell&#39;esperimento M2 eseguita. Fare clic sulla freccia di scorrimento verso il basso del &quot;File di tipo&quot; e selezionare &quot;Enzima Assay (vero?)&quot;. </li><li> Si apre la finestra di dialogo Enzyme Assay, permettendo selezionando uno dei quattro modelli. Selezionare &quot;Metodo 2 - solo substrato&quot; dalla finestra. </li><li> Nella finestra AH, indicare il valore di AH ottenuto nel passaggio 4.2. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Concentrazione&quot; per verificare i valori di concentrazione da utilizzare nella procedura di montaggio. Fare clic sul pulsante &quot;Tempo medio (P)&quot;. La finestra di dialogo si apre dando la possibilità di cambiare o accettare il valore predefinito. Questo valore rappresenta il tempo prima di ogni iniezioneione in cui le medie strumento il segnale di alimentazione per determinare il livello di potenza ad ogni concentrazione del substrato. Fare clic su OK per confermare il valore predefinito. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Zero Asse Y&quot;. Il cursore si trasforma in una croce che consente di fare doppio clic su un punto, a mettere a y = 0. Fare doppio clic appena prima del primo punto di iniezione. </li><li> Fare clic sul pulsante Calcola Rate. Tasso è tracciata in funzione della concentrazione del substrato, ottenuta dividendo il substrato aggiunto durante la titolazione per il volume cella campione (tenendo conto degli effetti di diluizione). Questa operazione dà una tipica trama di Michaelis-Menten che può essere montato per ottenere K M e K cat. </li><li> Se alcuni punti dovrebbero essere cancellati, selezionare il pulsante &quot;Troncare dati&quot;. Spostare gli indicatori di dati per escludere i punti dati cattivi e fare doppio clic su uno dei marcatori o premere Invio. </li><li> Utilizzare la funzione &quot;Adatta al modello&quot; per adattare la curva eottenere le costanti cinetiche. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Significato della ITC per studiare l&#39;attività enzimatica rispetto ai metodi esistenti Oltre alle sue applicazioni classiche per studiare equilibri vincolanti, Calorimetria isotermica di titolazione fornisce un metodo affidabile e veloce per caratterizzare reazioni enzimatiche in soluzione utilizzando il calore di reazione come sonda, senza richiedere modifiche o etichettatura sistema. I parametri cinetici k gatto e K M sono solita...

Determinazione quantitativa di reazioni biochimiche fornisce approfondimenti sui processi biologici alla base della vita. Calorimetria offre una metodologia libero-label per caratterizzare quantitativamente praticamente ogni reazione chimica in soluzione. Questa tecnica misura il calore rilasciato o assorbito nel tempo, ed è quindi un sistema di rilevamento universale e una metodologia molto comodo per quantificare la quantità di molecole reagenti (cioè termodinamica vincolanti), nonché per misurare la velocità di reazione (cioè cinetica). In particolare, Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stato adottato come metodo di scelta per caratterizzare la termodinamica di equilibri biomolecolari, coinvolgendo proteina-ligando, proteina-proteina, proteina-ioni metallici e le interazioni proteina-DNA 1-6. Inoltre, la capacità di ITC di fornire informazioni cinetiche rende un sistema molto potente per misurare catalisi enzimatica, anche se il potenziale di questa applicazione è ancorasottovalutato 7-9. L&#39;equazione di Michaelis-Menten 10 è una descrizione quantitativa di reazioni enzimatiche, in quanto fornisce una relazione tra la velocità di reazione e la concentrazione del substrato, a seconda di due parametri cinetici: la costante di Michaelis (K M) e la costante di velocità catalitica (k cat) . Il gatto k / rapporto K M viene definito come l&#39;efficienza catalitica di un enzima. In pratica, la determinazione di K M e K gatto per una reazione specifica fornisce una descrizione completa della catalisi. In una tipica reazione enzimatica (Figura 1), un substrato (S) interagisce con l&#39;enzima (E) che formano il complesso enzima-substrato (ES), che viene successivamente attivato nello stato di transizione (ES *). Quest&#39;ultimo viene convertito nel complesso enzima-prodotto (EP) che alla fine si dissocia. Questi steps sono descritti dalla seguente reazione. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) dove k 1 è la costante di velocità per la formazione del complesso ES, k -1 è la costante di velocità per la dissociazione del complesso ES, mentre k gatto è la costante di velocità catalitica o numero di turnover. Secondo l&#39;equazione di Michaelis-Menten 10, la velocità di reazione può essere calcolato come: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) in cui M = K (k -1 + k cat) / k 1 ek cat = v max / [E], con v max essendo la velocità massima raggiunta quando tutti enzima è legato al substrato. La titolazione calorimetro isotermico è lo strumento utilizzato in questo studio per caratterizzare l&#39;idrolisi enzimatica dell&#39;urea. Questo strumento è costituito da uno scudo adiabatico contenente due cellule a forma coniati (Figura 1). Questi sono collegati all&#39;esterno con tubi accesso strette. La cella campione (ca. 1,4 ml) viene caricato con soluzione enzimatica, mentre la cella di riferimento è generalmente riempito con acqua o con il solvente utilizzato per l&#39;analisi. Una siringa rotante con un lungo ago e una pagaia stir divisoria, generalmente comprendente ca. 0,3 ml di soluzione di substrato, è montato sulla cella campione. Un dispositivo termoelettrico misura la differenza di temperatura tra il campione e la cella di riferimento e, utilizzando una &quot;rete di retroazione cella&quot;, mantiene questa differenza a zero aggiungendo o sottraendo calore. Durante l&#39;esperimento, il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica a temperatura costante scelta. Quando l&#39;enzymatic reazione ha luogo, la quantità di calore ceduto o assorbito è proporzionale al numero di molecole di substrato che vengono convertiti in molecole dei prodotti. Inoltre, il tasso di flusso di calore è direttamente correlata alla velocità di reazione. I dati misurati, che appare come una deviazione del tracciato calore dalla linea di base iniziale (Figura 1), rappresentano la potenza termica (μcal / sec) fornite dallo strumento alla cella campione, che è proporzionale al flusso di calore che si verificano nella cella campione nel tempo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di titolazione isotermico calorimetro per studiare reazioni enzimatiche. Una reazione enzimatica si produce in conseguenza titolazione del substrato (prodotto nella siringa) nella soluzione enzimatica (nella cella campione) determina una variazione del therpotere mal rilasciato dal calorimetro, necessario per mantenere la differenza di temperatura tra la cella campione e la costante di cella di riferimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Nel complesso, la variazione di calore (Q) è proporzionale alla entalpia molare della reazione (AH) e il numero di moli di prodotto generato (n), che a sua volta è dato dai tempi totali di volume la concentrazione: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) La formazione del prodotto nel tempo (dP / dt), che corrisponde alla velocità di reazione, può quindi essere correlato alla quantità di calore generato nello stesso tempo (dQ / dt) attraverso la relazione: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) Secondo questa equazione, al fine di ottenere un Michaelis-Menten trama è necessario misurare i) il totale entalpia molare AH, e ii) il flusso di calore dQ / dt a differenti concentrazioni di substrato. Solitamente, questa viene eseguita in due diversi esperimenti: nel primo esperimento (metodo 1, M1), il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica e il calore per la conversione completa del substrato viene misurata; Nel secondo esperimento (metodo 2, M2), iniezioni multiple di substrato vengono eseguite e il tasso di produzione di calore viene misurato a differenti concentrazioni di substrato. Questi due insiemi di dati sono sufficienti per ricavare i parametri cinetici K M e K cat. Nel presente articolo, un protocollo generale per determinare i parametri cinetici per le reazioni enzimatiche eseguite utilizzando ITC è descritto. Abbiamo applicato il metodo di urea all&#39;idrolisi da Canavalia ensiformis urease, come un sistema di riferimento. Il buon accordo tra i risultati ottenuti con questo metodo e dei dati riportati in letteratura dimostra l&#39;affidabilità di questo approccio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:323px;">dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TRIZMA-Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">4270</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">30427</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Urea</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U4128</td>
			<td>dissolving in water at 40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U0251</td>
			<td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VP-ITC on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">SYS13901</td>
			<td>instrument&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data acquisition software supplied with the instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è una tecnica ben descritto che misura il calore rilasciato o assorbito durante una reazione chimica, usandolo come una sonda intrinseca per caratterizzare praticamente ogni processo chimico. Oggi, questa tecnica è ampiamente applicata per determinare i parametri termodinamici di equilibri vincolanti biomolecolari. Inoltre, ITC ha dimostrato di essere in grado di misurare direttamente cinetiche e termodinamiche (cat k, K M, AH) di reazioni enzimatiche, anche se questa applicazione è ancora poco sfruttato. Come sbalzi termici avvengono spontaneamente durante la catalisi enzimatica, ITC non richiede alcuna modifica o etichettatura del sistema sotto analisi e può essere eseguita in soluzione. Inoltre, il metodo deve piccola quantità di materiale. Queste caratteristiche rendono ITC uno strumento prezioso, potente e unica di studiare cinetica enzimatica in diverse applicazioni, come, ad esempio, la scoperta della droga. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In questo lavoro un metodo basato su ITC sperimentale per quantificare la cinetica e termodinamica delle reazioni enzimatiche è accuratamente descritta. Questo metodo viene applicato per determinare k gatto e K M del idrolisi enzimatica dell&#39;urea da Canavalia ensiformis (fagiolo jack) ureasi. Viene eseguito il calcolo di entalpia molare intrinseca (AH int) della reazione. I valori così ottenuti sono coerenti con i dati precedenti riportati in letteratura, dimostrando l&#39;affidabilità del metodo.

Ureasi (CE 3.5.1.5; urea amidoidrolasi) è un enzima contenente nichel multisubunit trovato Archea, batteri, eucarioti e piante unicellulari. Questa proteina agisce nell&#39;ultima fase di mineralizzazione dell&#39;azoto organico, che catalizzano l&#39;idrolisi dell&#39;urea in ammoniaca e carbammato, che si decompone spontaneamente a dare una seconda molecola di ammoniaca e bicarbonato (Equazione 6) 12. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/5148...

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Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isotermico misure titolazione calorimetria flusso di calore rilasciato o assorbito nelle reazioni chimiche. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare enzima-catalisi. In questo documento, il protocollo per la configurazione strumentale, esperimento esecuzione e analisi dei dati è generalmente descritto, e applicato alla caratterizzazione di idrolisi enzimatica dell&#39;urea da jack bean ureasi.

Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

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20.4K Views.  University of Bologna.  Isotermico misure titolazione calorimetria flusso di calore rilasciato o assorbito nelle reazioni chimiche. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare enzima-catalisi. In questo documento, il protocollo per la configurazione strumentale, esperimento esecuzione e analisi dei dati è generalmente descritto, e applicato alla caratterizzazione di idrolisi enzimatica dell'urea da jack bean ureasi. 

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Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle diameters ranging from 30-250 nm by varying the reaction conditions. Through the selection of a microwave compatible solvent, silicic acid precursor, catalyst, and microwave irradiation time, these microwave-assisted methods were capable of overcoming the previously reported shortcomings associated with synthesis of silica nanoparticles using microwave reactors. The siloxane precursor was hydrolyzed using the acid catalyst, HCl. Acetone, a low-tan &#948; solvent, mediates the condensation reactions and has minimal interaction with the electromagnetic field. Condensation reactions begin when the silicic acid precursor couples with the microwave radiation, leading to silica nanoparticle sol formation. The silica nanoparticles were characterized by dynamic light scattering data and scanning electron microscopy, which show the materials&#39; morphology and size to be dependent on the reaction conditions. Microwave-assisted reactions produce silica nanoparticles with roughened textured surfaces that are atypical for silica sols produced by St&#246;ber&#39;s methods, which have smooth surfaces.

Silica nanoparticles were prepared using acid-catalysis of a siloxane precursor and microwave-assisted synthetic techniques resulting in the controlled growth of nanomaterials ranging from 30-250 nm in diameter. The growth dynamics can be controlled by varying the initial silicic acid concentration, time of the reaction, and temperature of reaction.

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

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Chimica

Retropinacol/Cross-pinacol Coupling Reactions - A Catalytic Access to 1,2-Unsymmetrical Diols

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear recognition and strict differentiation of two similar carbonyl compounds (aldehydes &#8594; secondary 1,2-diols or ketones &#8594; tertiary 1,2-diols). This fine-tuning is still a challenge and an unsolved problem for an organic chemist. There exist several reports on successful execution of this transformation but they cannot be generalized. Herein we describe a catalytic direct pinacol coupling process which proceeds via a retropinacol/cross-pinacol coupling sequence. Thus, unsymmetrical substituted 1,2-diols can be accessed with almost quantitative yields by means of an&#160;operationally simple performance under very mild conditions. Artificial techniques, such as syringe-pump techniques or delayed additions of reactants are not necessary. The procedure we describe provides a very rapid access to cross-pinacol products (1,2-diols, vicinal diols). A further extension of this new process, e.g. an enantioselective performance could provide a very useful tool for the synthesis of unsymmetrical chiral 1,2-diols.

A novel account for the synthesis of unsymmetrical 1,2-diols based on a retropinacol/cross-pinacol coupling mechanism is described. Due to the catalytic execution of this reaction a considerable improvement compared to conventional cross-pinacol couplings is achieved.

Retropinacol / Cross-Pinacol Coupling Reazioni - Una catalitico Accesso al 1,2-asimmetriche Dioli

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family of easy accessible, very cheap, and air stable, but highly active and universally applicable C-C cross-coupling catalysts with an excellent functional group tolerance. Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1), the least stable complex within this series towards protons; e.g. in the form of water, allows an eased nanoparticle formation and hence, proved to be the most active Heck catalyst within this series at 100 &#176;C and is a very rare example of an effective and versatile catalyst system that efficiently operates under mild reaction conditions. Rapid and complete catalyst degradation under work-up conditions into phosphonates, piperidinium salts and other, palladium-containing decomposition products assure an easy separation of the coupling products from catalyst and ligands. The facile, cheap, and rapid synthesis of 1,1',1"-(phosphinetriyl)tripiperidine and 1 respectively, the simple and convenient use as well as its excellent catalytic performance in the Heck reaction at 100 &#176;C make 1 to one of the most attractive and greenest Heck catalysts available.
We provide here the visualized protocols for the ligand and catalyst syntheses as well as the reaction protocol for Heck reactions performed at 10 mmol scale at 100 &#176;C and show that this catalyst is suitable for its use in organic syntheses.

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1&#039;,1&#039;&#039;-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1) is an easy accessible, cheap, and air stable, but highly active Heck catalyst with an excellent functional group tolerance that efficiently operates under mild reaction conditions to give the coupling products in very high yields.

Mizoroki-Heck reazioni di cross-coupling catalizzate da dicloro {bis [1,1 &#39;, 1&#39;&#39; - (phosphinetriyl) tripiperidine]} palladio Sotto lievi condizioni di reazione

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

Un protocollo per reazioni sicuro litiazione Utilizzando organolitio Reagenti

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

Impiegando l'estrazione con acqua calda pressurizzata (PHWE) per esplorare la chimica di prodotti naturali in laboratorio dello studente non laureato

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared according to the methodology developed by surface organometallic chemistry (SOMC). In this framework, catalytic cycles can be determined by isolating crucial intermediates. All air-sensitive materials are handled under inert atmosphere (using gloveboxes or a Schlenk line) or high vacuum lines (HVLs, &#60;10-5 mbar). The preparation of SiO2-700 (silica dehydroxylated at 700 &#176;C) and subsequent applications (the grafting of complexes and catalytic runs) requires the use of HVLs and double-Schlenk techniques. Several well-known characterization methods are used, such as Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), elemental microanalysis, solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SSNMR), and state-of-the-art dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy (DNP-SENS). FTIR and elemental microanalysis permit scientists to establish the grafting and its stoichiometry. 1H and 13C SSNMR allows the structural determination of the hydrocarbon ligands coordination sphere. DNP SENS is an emerging powerful technique in solid characterization for the detection of poorly sensitive nuclei (15N, in our case). SiO2-700 is treated with about one equivalent of the metal precursor compared to the amount of surface silanol (0.30 mmol&#183;g-1) in pentane at room temperature. Then, volatiles are removed, and the powder samples are dried under dynamic high vacuum to afford the desired materials [(&#8801;Si-O-)Hf(&#951;2&#960;-MeNCH2)(&#951;1-NMe2)(&#951;1-HNMe2)]. After a thermal treatment under high vacuum, the grafted complex is converted into metal imido silica complex [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)]. [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] effectively promotes the metathesis of imines, using the combination of two imine substrates, N-(4-phenylbenzylidene)benzylamine, or N-(4-fluorobenzylidene)-4-fluoroaniline, with N-benzylidenetert-butylamine as substrates. A significantly lower conversion is observed with the blank runs; thus, the presence of the imido group in [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is correlated to the catalytic performance.

A new group IV metal catalyst for imine metathesis is prepared by grafting amine metal complex onto dehydroxylated silica. Surface metal fragments are characterized using FT-IR, elemental microanalysis, and solid-state NMR spectroscopy. Further dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy experiments complement the determination of the coordination sphere.

Metatesi imine da silice-supported Catalysts Utilizzando la metodologia della chimica dell'organimetallico di superficie

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

A Microwave-Assisted Direct Heteroarylation of Ketones Using Transition Metal Catalysis

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal catalysis, the literature on direct heteroarylation is scarce. The presence of heteroatoms such as nitrogen, sulfur and oxygen often make heteroarylation a challenging research field due to catalyst poisoning, product decomposition and the rest. This protocol details a highly efficient direct &#945;-C(sp3) heteroarylation of ketones under microwave irradiation. Key factors for successful heteroarylation include the use of XPhos Palladacycle Gen. 4 Catalyst, excess base to suppress side reactions and the high temperature and pressure achieved in a sealed reaction vial under microwave irradiation. The heteroarylation compounds prepared by this method were fully characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR), carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS). This methodology has several advantages over literature precedents including broad substrate scope, rapid reaction time, greener procedure and operational simplicity by eliminating the preparation of intermediates such as silyl enol ether. Possible applications for this protocol include, but are not limited to, diversity-oriented synthesis for the discovery of biologically active small molecules, domino synthesis for the preparation of natural products and ligand development for new transition metal catalytic systems.

Heteroaryl compounds are important molecules utilized in organic synthesis, medicinal and biological chemistry. A microwave-assisted heteroarylation using palladium catalysis provides a rapid and efficient method to attach heteroaryl moieties directly to ketone substrates.

Un'eteroarylazione diretta a microonde di chetoni utilizzando la catalisi metallica di transizione

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal ...