Quindi il nostro protocollo ci permette di preparare acidi grassi epossidici enantiopure, e questo metodo potrebbe aiutare a far progredire la ricerca sui meccanismi con cui questi metaboliti agiscono nel corpo. Storicamente, gli acidi grassi epossidici puri sono molto difficili da ottenere. Quindi il nostro protocollo è semplice, rapido, conveniente, e ci permette di preparare quantità significative di questi metaboliti.
Sì, abbiamo sviluppato un protocollo per il DHA, ma funziona molto bene anche per l'EPA e l'acido arachidonico. Lavora rapidamente, poiché alcuni dei reagenti sono sensibili all'aria, in particolare DHA e NADPH, e assicurati di abbinare tutto in anticipo in modo che la configurazione sia semplice. Inoltre, essere consapevoli dei pericoli.
Il nostro protocollo utilizza tecniche sia di chimica della ossigenazione che di chimica organica. La visualizzazione è fondamentale per aiutare i lettori e gli spettatori che non hanno familiarità con le tecniche specializzate in questi campi. Per inoculare, utilizzare un anello sterile o pipetta immerso in brodo di glicerolo di pBS-BM3 trasfetto DH5-alfa E.coli in cinque millilitri di brodo LB sterile integrato con 0,5 milligrammi di ampicillina.
Incubare la coltura cellulare in uno shaker a 37 gradi Celsius per 24 ore a 200 giri/min. Quindi, aggiungere la coltura iniziale di cinque millilitri e 100 milligrammi di ampicillina a un litro di brodo LB sterile in un pallone Erlenmeyer. Agitare a 37 gradi Celsius per sei ore a 200 giri/min, quindi a 30 gradi Celsius per 18 ore a 200 giri/min.
Successivamente, raccogliere la coltura cellulare in tubi di centrifuga e centrifugare la coltura cellulare a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 1.000 volte g. Versare il supernatante in un altro pallone. Decontaminare con candeggina o usando l'autoclave e conservare il pellet cellulare a meno 78 gradi Celsius fino alla purificazione enzimatica.
Per eseguire la lisi cellulare, scongelare prima il pellet cellulare sul ghiaccio e rimescolare in 40 millilitri di tampone di solubilizzazione ghiacciato contenente Tris, PMSF ed EDTA. Mentre sei sul ghiaccio, sonicare le cellule per un minuto con un omogeneizzatore ad ultrasuoni, con un'impostazione di potenza in uscita di 10 e un dovere di 100, seguita da una pausa di un minuto sul ghiaccio per liscire le cellule. Ripetere questa procedura sei volte.
Centrifugare la cellula lysate a quattro gradi Celsius per 30 minuti a 11.000 volte g per pellettare i detriti cellulari. Per eseguire la cromatografia di affinità, in una cella frigoriferi o in frigorifero con porta scorrevole, a quattro gradi Celsius, preparare prima una forte colonna di cromatografia a scambio di anione lavando la resina con cinque volumi di colonna di tampone A di Tris da 10 millimolare a pH 7,8. Successivamente, aggiungere il supernatante dei liscivi cellulari alla colonna equilibrata e lavare la colonna con tre volumi di colonna di tampone freddo A.Quindi, elutare il BM3 lavando la colonna con sei volumi di colonna di tampone freddo B di Tris da 10 millimolare e cloruro di sodio 600 millimolare.
Raccogliere la frazione eluente bruno-rossastra. Se la proteina non viene utilizzata immediatamente, mescolarla con un volume uguale di glicerolo e congelare con azoto liquido. Conservare la soluzione congelata a meno 78 gradi Celsius.
Per eseguire l'epossidazione del DHA, determinare prima la concentrazione dell'enzima BM3 scongelato, secondo il metodo di dosaggio spettrale del monossido di carbonio ditionite. Quindi, in un bicchiere contenente due litri di tampone di reazione che viene mescolato su una piastra di agitazione magnetica, aggiungere 0,94 millimoli di DHA diluiti in 18,8 millilitri di DMSO e l'enzima BM3 diluito a 20 nanomolari. Mentre la soluzione si muove, iniziare la reazione di epossidazione aggiungendo 8,7 millilitri di tampone di reazione contenenti 0,94 millimoli di NADPH.
Mescolare la reazione per 30 minuti mentre si gorgoglia aria nella miscela di reazione con un palloncino pieno d'aria attaccato a una siringa e un ago attaccato all'interno del becher. Successivamente, disegnare un microlitro della miscela di reazione e metterlo in uno spettrofotometro NanoDrop per misurare l'assorbanza a 340 nanometri. Usa l'acqua come vuoto.
Se non c'è ancora assorbanza, il che indica che il NADPH è stato consumato, la reazione è completa. Dissetare la miscela di reazione aggiungendo lentamente acido ossalico un molare dropwise, fino a quando il pH della soluzione raggiunge circa quattro. Ora, estrarre la soluzione tampone temprata con due litri di etere dietile anidro e privo di perossido.
Utilizzare un imbuto separatore per scuotere e separare gli strati e raccogliere l'etere in un pallone Erlenmeyer. Ripetere altre due volte e aggiungere circa 50 grammi di solfato di magnesio anidro per asciugare l'etere. Su un imbuto filtrante sottovuoto, versare l'etere essiccato per filtrare il solfato di magnesio e trasferire lo strato di etere filtrato in un pallone a fondo rotondo dell'evaporatore rotante.
Regolare la velocità di rotazione su media e avviare il vuoto per concentrare il liquido per produrre residui EDP grezzi. Caricare il residuo in una cartuccia di silice da 40 grammi per eseguire la cromatografia a colonna flash utilizzando una macchina automatica per la purificazione del flash. Inizia dal 10% di acetato di etile negli esaani e aumenta fino al 60% di acetato di etile in esani per 22 minuti.
Le frazioni vengono raccolte automaticamente in tubi. Quindi, unire le frazioni di ogni picco in un pallone a fondo rotondo, indossare l'evaporatore rotante e iniziare l'evaporazione. Si ottengono tre frazioni, DHA, isomeri EDP e diepossido.
Per esterificare gli 0,151 grammi di epossido ottenuti, in un pallone a fondo tondo o in una piccola fiala, aggiungere due millilitri di metanolo anidro e tre millilitri di toluene anidro e aggiungere una barra di agitazione. Collegare il pallone con un palloncino riempito con argon attraverso un setto di gomma e un ago e aggiungere 0,26 millilitri di TMS-diazometano bimolare attraverso una siringa durante l'agitazione. Attendere 10 minuti e aggiungere altri 05 millilitri di TMS-diazometano fino a quando non appare un colore giallo pallido.
Dopo 30 minuti, concentrare accuratamente la miscela utilizzando l'evaporatore rotante e utilizzare una cartuccia a colonna di gel di silice da 40 grammi sulla macchina per la cromatografia flash per purificare il residuo. Eluto con una concentrazione isocratica di acetato di etile al 4% in esani per 22 minuti. Raccogliere prima le frazioni contenenti gli eluati di estere metile purificato 19S, 20R-EDP, seguiti da 16S, 17R-EDP estere metile.
Ora, valuta le frazioni per cromatografia a strato sottile in una miscela da otto a uno da esano a etil-acetato. Macchia con permanganato di potassio per verificare la presenza di eventuali frazioni miste contenenti entrambi gli isomeri. Concentrare le frazioni corrispondenti a ciascun picco su un evaporatore rotante, quindi pesare su un bilanciere per determinare la quantità di esteri EDP ottenuti.
Se rimangono frazioni miste, ricromatografarle con lo stesso sistema di solventi utilizzato in precedenza. Concentrare ogni frazione contenente il singolo regioisomero su un evaporatore rotante. Per convertire i singoli regioisomeri di estere metile EDP nelle loro forme acide, diluire l'estere EDP in una piccola fiala con circa 0,7 millilitri di THF per 0,1 millimoli di estere, insieme a 0,175 millilitri di acqua.
Raffreddare la fiala a zero gradi Celsius in un bagno di ghiaccio, aggiungere tre equivalenti di soluzione di idrossido di litio e mescolare su una piastra di agitazione sotto argon durante la notte mentre si riscalda a temperatura ambiente. Al mattino, dissetare la reazione aggiungendo lentamente acido formico, fino a quando il pH della miscela raggiunge i tre o quattro. Quindi, aggiungere acqua e due millilitri di acetato di etile per separare gli strati.
Estrarre lo strato d'acqua con 10 millilitri di acetato di etile tre volte, lavare con 20 millilitri di soluzione di salamoia satura e aggiungere diversi grammi di solfato di sodio anidro nella soluzione per asciugare lo strato di acetato di etile. Concentrare la soluzione di acetato di etile utilizzando l'evaporatore rotante, aggiungere 10 millilitri di esaani e concentrarsi di nuovo. Ripetere due volte per rimuovere azeotropicamente l'acido formico residuo.
Purificare il residuo mediante cromatografia a colonna flash, eluificando con acetato di etile dal 10 al 30% per 15 minuti. Concentrare le frazioni desiderate nell'evaporatore rotante e asciugare in vacuo per permettersi l'acido purificato. Il cromatogramma a colonna flash ottenuto dopo la purificazione della miscela grezza dall'epossidazione enzimatica è mostrato qui.
Sono stati ottenuti tre picchi principali, che eluivano nell'ordine di, da un primo, DHA non reatto, secondo, miscela di isomeri EDP e, terzo, diepossido, che sono normali prodotti di sovraossidazione. A seguito dell'esterificazione e della separazione dei regioisomeri, gli spettri nmr protonici indicano che sono stati ottenuti esteri metilici ad alta purezza 16S, 17R-EDP e 19S, 20R-EDP. L'HPLC chirale ha confermato la purezza enantiomerica delle forme acide dei GEPD.
Assicurarsi di mantenere sterile il brodo durante la manipolazione e l'inoculazione per evitare la contaminazione. L'epossidazione può essere utilizzata per altri acidi grassi. Quindi l'abbiamo provato anche con acidi arachidonico ed eicosapentaenoico, e abbiamo ottenuto buone rese di quegli epossidi di enantiopure, quindi 14, 15-EET e 17, 18-EEQ.
Quindi un protocollo che consenta ai ricercatori di accedere agli acidi grassi epossidici potrebbe aiutare nella ricerca sulle funzioni biologiche di questi composti, che potrebbe portare al loro uso come porta farmaci. Le sostanze chimiche pericolose sono il PMSF, pericoloso per contatto, e il TMS-diazometano, che è molto tossico per contatto e inalazione. Quindi quest'ultimo dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante e con adeguati dispositivi di protezione individuale.
