Quest'opera è stata sostenuta dal Ministero tedesco dell'istruzione e ricerca (BMBF 01EO1003 e 01EO1503 BMBF).

Gli esperimenti sono stati condotti sull'età di topo maschio 8-12 settimane vecchie sotto l'approvazione del comitato etico sulla sperimentazione animale da Renania-Palatinato (numero di autorizzazione 23 177-07/G12-1-002 e 23 177-07/G15-1-051).
1. mouse l'anestesia e la preparazione all'intervento
<ol>
	<li>Prima dell'intervento, verificare la buona salute e la condizione degli animali. Prima dell'intervento chirurgico, è necessario monitorare gli animali una volta al giorno per 2-3 giorni per la loro condizione generale (aspetto, postura, comportamento spontaneo), peso corporeo, cibo e consumo di acqua.</li>
	<li>Preparare il mix master per anestesia con midazolam (5 mg/kg di peso corporeo), medetomidina (0,5 mg/kg di peso corporeo) e fentanil (0,05 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale (i.p.) iniettare 200 µ l/30 g topo in siringa da 1 mL con ago 26 G.</li>
	<li>L'impianto pompa osmotica e preparazione degli animali per esperimenti di IVM vengono eseguite su un campo di funzionamento con un 39 ° C riscaldamento piattaforma. Tutti gli strumenti in un bagno di disinfezione di sterilizzare e disinfettare la piattaforma.</li>
	<li>Durante le procedure, proteggere gli occhi degli animali con unguento oculare. Rimuovere la pelliccia con rasoi prima dell'impianto pompa osmotica. Utilizzare una crema depilatoria e tamponi di cotone per l'isolamento delle carotidi e l'impianto di catetere giugulare in esperimenti di IVM. Disinfettare la pelle dell'animale utilizzando due disinfettanti della pelle: un antisettico e disinfettante contenente iodio povidone e una pelle antisettico octenidine contenenti in soluzione a base di alcool.</li>
	<li>Preparare il mix master per antagonizzare l'anestesia ("mix antisedan") con atipamezol (0,05 mg/kg di peso corporeo) e di flumazenil (0,01 mg/kgbody peso) e 200 µ l/mouse nella siringa da 1 mL con un ago da 26 G sia per via sottocutanea (s.c.) iniettato.</li>
</ol>
2. l'impianto e la pompa osmotica preparazione
Nota: L'infusione sottocutanea di AngII mediante pompe osmotiche è stata descritta in dettaglio da Lu et al. 17
<ol>
	<li>Preparare il AngII mediante ricostituzione della polvere liofilizzata con soluzione salina sterile e regolare la concentrazione con il peso dell'animale e della portata della pompa. Mantenere l'AngII ricostituito in tubi di plastica (non utilizzare tubi di vetro).</li>
	<li>Riempire la pompa con la soluzione di AngII a consegnare 1 mg/(kg·d) per 7 giorni. Dopo la preparazione, mantenere le pompe in soluzione salina sterile per 4-6 h minimo a 37 ° C.</li>
	<li>Testare l'anestesia completa del mouse dopo l'iniezione di anestesia mix con posteriore riflessi del piede e posizionarlo sul campo di operazione a caldo. Induzione di anestesia dura 10-15 min e funziona meglio se gli animali sono collocati in un ambiente buio.</li>
	<li>Radere la parte bassa della schiena il mouse e disinfettarlo con una pelle alcolica antisettica.</li>
	<li>Praticare un'incisione di 1 cm perpendicolarmente alla colonna vertebrale con le forbici. Creare una tasca per la pompa usando un laccio emostatico stretto e inserire la pompa (portata moderatore prima). La tasca deve consentire la libera circolazione della pompa con nessuna pressione sulla ferita.</li>
	<li>Chiudere la ferita con punti di sutura e non clip, al fine di limitare l'infiammazione; quindi disinfettare con antisettico della pelle.</li>
	<li>Antagonizzare l'anestesia tramite iniezione s.c. di 200 µ l della miscela antisedan e tornare il mouse alla sua gabbia.</li>
	<li>Svolgere l'analgesia postoperatoria con buprenorfina (0,075 mg/kg s.c.) una volta dopo l'intervento chirurgico e su richiesta in base al comportamento animale.</li>
</ol>
3. l'impianto di catetere giugulare e carotidi preparazione
<ol>
	<li>Testare l'anestesia completa del mouse dopo l'iniezione dell'anestesia mescolare con riflessi posteriore cibo e metti l'animale anestetizzato in dorsale recumbence sulla piastra chirurgica di 39 ° C con una sonda rettale al fine di mantenere la temperatura e mettere l'unguento sopra gli occhi per proteggerli durante la procedura.</li>
	<li>Eliminare i peli del collo usando la crema depilatoria. Utilizzare un cotton fioc per diffondere e strofinare la crema per 2 min, fino a quando i capelli iniziano a cadere. Dopo altri 2 minuti, togliere la panna e i capelli con una spatola e disinfettare la cute con un antisettico di pelle alcoliche.</li>
	<li>Effettuare l'intervento in un microscopio stereoscopico. Fare un'incisione lungo 1-1,5 cm nella pelle longitudinalmente nel collo, 1 cm accanto alla trachea. Poi fare due altre incisioni perpendicolarmente alla due estremità delle incisioni prime.</li>
	<li>Rimuovere tessuti vicino la pelle delicatamente e rimuovere il pezzo di pelle che copre la vena giugulare di sinistra e la trachea.</li>
	<li>Isolare accuratamente la ghiandola parotidea; ghiandole sublinguali e sottomascellari dalla zona di interesse con il forcipe curvo 2. Non tagliare o danneggiare le ghiandole, metterli per consentire il migliore accesso alla vena giugulare e per le carotidi.</li>
	<li>Per isolare la vena giugulare, utilizzare pinze sottili e lentamente aprire e chiudere per liberare delicatamente il vaso dal tessuto circostante. Una volta che la vena è completamente pulita, posizionare la pinza sotto la nave e posizionare due suture 7-0 di 10 cm ogni sotto esso.</li>
	<li>Chiudere la sutura prossimale alla testa con due nodi. La sutura di altri, preparare un nodo ma non chiuderlo.</li>
	<li>Mantenere il catetere (0,28 mm diametro interno, diametro esterno mm 0,61) riempito con soluzione fisiologica sterile di 37 ° C con una pinza con una mano; mentre con l'altra mano, praticare una piccola incisione nel recipiente con un paio di forbici sottile o un ago curvo 26 G. Quindi inserire il catetere nella vena giugulare e chiudere il nodo due volte. Chiudere la sutura prossimale alla testa sopra il catetere al fine di garantire l'immobilizzazione completa.</li>
	<li>Per isolare e preparare le arterie carotiche, sezionare l'area che copre la trachea usando il forcipe curvo sottile.</li>
	<li>Una volta che le carotidi sono liberi dai tessuti circostanti, rimuovere il nervo vago (si presenta come una linea bianca adiacente la carotide) dalla nave (ma non lo taglio). Il forcipe sottile può essere chiuso e aperto lentamente per mobilitare delicatamente il nervo.</li>
	<li>Una volta che entrambe le arterie sono completamente pulite, collocare la pinza sotto la prima arteria carotica e posizionare un pezzo di plastica piccolo nero 3 mm larghezza x 2,5 cm lunghezza sotto la nave. È molto importante non tirare troppo il vaso e controllare che il flusso di sangue è presente una volta il nave titolare è collocato. Posizionare la seconda arteria sopra il nave titolare. Se il mouse non è posizionato direttamente sotto il microscopio, rimettere le ghiandole sopra la trachea e applicare la soluzione salina sterile a 37 ° C per evitare l'essiccazione della zona.</li>
</ol>
4. valutazione di rotolamento e l'aderenza dei leucociti / LysM + celle con IVM
<ol>
	<li>Preparare acridina arancia da una soluzione madre di 2 mg/mL conservata a-20 ° C e diluirla 1:4 in soluzione fisiologica sterile (concentrazione finale di 0,5 mg/mL) in una siringa da 1 mL.</li></ol>Proteggere la siringa dalla luce e utilizzare 200 µ l per un topo.<ol>
		<li>Diverse condizioni di prova: (1) iniezione di acridina arancia con il catetere giugulare; (2) iniezione di arancio di acridina direttamente nella vena caudale laterale (con questa circostanza che è stato impiantato senza catetere giugulare); (3) misurazione senza topi acridina arancione usando la fluorescenza LysMCre++ di IRG (in questo caso nessun catetere giugulare è stato impiantato).</li>
	</ol>
	
	<li>Una volta che il catetere è a posto e le due carotidi sono isolate, posizionare il mouse al microscopio. Eseguire misure con un microscopio a fluorescenza di largo campo ad alta velocità utilizzando un condensatore a lunga distanza e un 10x (NA 0,3) obiettivo a immersione in acqua con un monocromatore, un divisore di fascio e una fotocamera di charge coupled device. Eseguire analisi con sistema di imaging in tempo reale e acquisizione di immagini.</li>
	<li>Focalizzare l'obiettivo del microscopio nel mezzo dell'arteria carotica alla superficie dell'endotelio. Iniettare lentamente 50 µ l di arancio di acridina (0,5 mg/mL) (prendere in considerazione il volume morto del catetere per la prima iniezione). Impostare il software per registrare 100 immagini con un tempo di esposizione di 120 millisecondi per ogni immagine.</li>
	<li>Fare quattro video per dell'arteria carotica (sinistra e destra) alle posizioni differenti sull'arteria per ogni video. Se il segnale di fluorescenza diminuisce, iniettare un altro 50 µ l di arancio di acridina.</li>
	<li>Dopo aver registrato tutti i video eutanasia animale di dislocazione cervicale.</li>
	<li>Impostare la velocità dei video a 10 immagini al secondo e quantificare le cellule rotolamento e aderente in vista per il rettangolo µm 200 µm x 250, collocato nel mezzo della nave per ogni video. Contare le celle di rotolamento e aderente; le cellule aderenti sono definite come cellule che non spostare o staccare dall'endotelio entro 10 s video. Per semplificare la quantificazione, il canale viene rimosso con la fluorescenza rossa e utilizzare solo la fluorescenza verde per contare le celle di rotolamento e aderente.</li>
	<li>Per esperimenti con arancio di acridina, fare una soglia manuale della fluorescenza al fine di rimuovere sfondo fatto da cellule endoteliali.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension.">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans.">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li><li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+monocytes+and+platelets:+implication+for+life.">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li><li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation.">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li><li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway.">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice.">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+the+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).</li><li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

I monociti LysM+ precedentemente sono stati indicati per essere implicati nello sviluppo di ipertensione5. Qui indichiamo che le cellule immunitarie LysM+ rotolo e rispettano lo strato endoteliale in risposta all'infusione di AngII. Questo risultato è stato ottenuto utilizzando LysMCre++ di IRG topi da nostri studi precedenti, esplorando il ruolo delle cellule immuni in ipertensione in vivo visualizzando leucociti con iniezione di arancio di acridina6,10. Così, la discriminazione di tipi delle cellule aderiscono all'endotelio non era possibile.
L'IVM è uno strumento molto utile per studi vascolari e osservazioni in vivo delle cellule direttamente nel sistema vascolare, ma l'impatto di iniettare coloranti con l'aiuto di un catetere inserito chirurgicamente nel contesto infiammatorio di ipertensione rimane sconosciuto. Per valutare l'effetto potenziale del catetere e arancio di acridina iniezione abbiamo approfittato del LysMCre+topi IRG+ . Infusione di AngII ha aumentato il numero di rotolamento LysM+ cellule all'endotelio. Inserimento di un catetere nella vena giugulare amplificato l'effetto e leucociti più rotolamento e aderenti sono stati rilevati nei topi AngII-infuso strumentati con un catetere rispetto ai topi senza catetere protesi. Questo indica che l'impianto di un cause carotica catetere una reazione infiammatoria sistemica nel contesto della cicatrizzazione che si sovrappone con la reazione immune vista in ipertensione18. Inoltre, a causa della vicinanza della vena giugulare all'arteria carotica un'ulteriore attivazione immunitaria potrebbe essersi verificato che interessano la vena giugulare. Poiché questo effetto non era presente quando le iniezioni sono state fatte direttamente nella vena caudale, possiamo supporre che l'effetto era dovuta non alla tintura, ma per la procedura di inserimento del catetere. Abbiamo dimostrato qui l'importanza di topi transgenici reporter che esprimono le proteine fluorescenti per non interferire con i processi in vivo durante la sperimentazione. Inoltre, iniezione della vena della coda di traccianti fluorescenti potrebbe essere una possibile alternativa a iniezioni catetere giugulare.
Un passaggio fondamentale della procedura è l'infusione di AngII. Valutazione del polsino della coda della pressione sanguigna può essere fatta al fine di controllare l'efficacia di AngII consegna la pompa. Pressione sanguigna dovrebbero aumentare dopo 2−3 giorni di infusione. Per limitare l'infiammazione che poteva influenzare l'attivazione di cellule LysM+ , chiusura dell'incisione dove viene impiantata la pompa dovrebbe essere effettuata con suture invece di clip. Una limitazione deve essere notata sull'iniezione della vena della coda: per rendere l'acquisizione di dati possibili migliore, 4 video è di solito prese per ogni carotico. Se il segnale fluorescente diminuisce, 50 µ l di arancio di acridina vengono iniettati ma con iniezione coda è più difficile di fare diverse iniezioni e di mantenere le carotidi stabile nell'ambito dell'obiettivo del microscopio. La durata della presenza di un catetere nella vena giugulare potrebbe inoltre modulano l'attivazione di cellule immunitarie poiché si sta interessando l'attivazione di coagulazione in plasma ricco di piastrine preparato 4 h dopo l' impianto di catetere19. Questo aspetto dell'impianto di catetere necessita di ulteriori indagini.
Infine, anche se apprezziamo l'impatto dell'impianto di catetere giugulare sull'attivazione delle cellule LysM+ dopo infusione di AngII, completamente abbiamo non possiamo stimare il ruolo della preparazione, la rimozione della pelle e carotica isolamento su una potenziale cellula LysM+ attivazione. Concludiamo che l'uso di topi reporter fluorescenza come il LysMCre++ di IRG mouse è consigliato per evitare interruzioni di integrità del vaso durante la preparazione degli animali per l'imaging in vivo .

Ipertensione arteriosa aumenta il rischio di malattia cardiovascolare e di morte e promuove lo sviluppo di aterosclerosi, malattia coronarica e tromboembolie arteriose o venose1. Lo sviluppo di ipertensione dipende dall'interazione di fattori ambientali, genetici, endocrini ed emodinamici. Attualmente, l'immunità e infiammazione correlato sono apprezzate per svolgere un ruolo importante in eziologia di ipertensione2.
Tra le cellule del sistema immunitario, i macrofagi così come monociti e linfociti T sono stati trovati per essere causalmente coinvolti nell'infiammazione vascolare indotta da AngII e ipertensione, in parte legate alla loro capacità di innescare di specie reattive dell'ossigeno3. Topi deficienti di fattore del macrofago distimolazione ha mostrato ridotta risposta di AngII per quanto riguarda l'aumento della pressione sanguigna e l'infiammazione vascolare4. In un precedente lavoro, abbiamo potuto mostrare che i monociti LysM + guidano disfunzione vascolare e l'infiammazione in ipertensione indotta da AngII5. Più recentemente, abbiamo descritto una via novella nella quale coagulazione fattore XI coopera con le piastrine e la parete del vaso per indurre l'infiammazione vascolare trombina-dipendente6. Le attuali conoscenze sul ruolo del sistema immunitario nell'ipertensione recentemente sintetizzata e recensita da Rodriguez-Iturbe et al. 7
Dal momento che il coinvolgimento delle cellule immuni nello sviluppo di ipertensione è diventato evidente, modelli e tecniche per lo studio dell'interazione tra la nave e le cellule immuni è diventato necessari. Epifluorescence IVM dei vasi sanguigni è un utile strumento per osservare in vivo interazioni fra le cellule del sangue e l'endotelio8,9,10di circolazione. Con questa tecnica, iniezione di coloranti intercalanti con DNA (ad esempio di arancio di acridina) possa visualizzare cellule nucleate (circolazione nonché dall'endotelio). Piastrine isolate tinto ex vivo con rhodamin - 6G o della diclorofluorescina (DCF) può essere iniettata per visualizzare embolo ricco di piastrina in modelli di lesione arteriosa o venosa.
In genere, un catetere giugulare è usato per iniettare traccianti o contrassegnato le piastrine. Alterazione dell'endotelio e la successiva attivazione della cascata della coagulazione sono entrambi noti per avere effetti sull'attivazione del monocito. Lesione endoteliale porta immediatamente all'attivazione delle piastrine tramite molecole subendothelial matrice per sigillare il tessuto, con conseguente monocito attrazione e attivazione11. Al contrario, un endotelio intatto è noto per avere proprietà anticoagulanti (ad es., via inibitore di via di fattore del tessuto o thrombomodulin)12 ed effetti inibitori diretti su monocito, ad esempio, attraverso la secrezione di vescicole extracellulari contenenti microRNA13. I monociti sono noti per produrre un fattore del tessuto, l'attivatore estrinseco della cascata della coagulazione ed esprimere recettori attivati da proteasi (PARs) che possono essere attivati dalla trombina e partecipare a monocito attivazione14,15 . Pertanto, qualsiasi attivazione delle piastrine o della cascata della coagulazione, a causa di lesioni vascolari può avere effetti inattesi sulla attivazione del monocito e interferire con il fenomeno osservato. Con l'aiuto di topi transgenici di LysM Cre transgenici IRG, un mouse di reporter di doppio-fluorescente Cre (LysMCre+IRG+), ci proponiamo di studiare in dettaglio l'effetto delle iniezioni con un catetere e metodi alternativi su LysM+ cellule myelomonocytic in un modello murino di ipertensione arteriosa16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

Videomicroscopia video epifluorescenza (IVM) dei vasi sanguigni è un metodo consolidato per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e la loro capacità di ruolo e rispettare lo strato endoteliale. Visualizzazione di cellule circolanti per iniezione di coloranti fluorescenti o fluorophore-accoppiati anticorpi è comunemente usato. In alternativa, possono essere utilizzati topi reporter fluorescente. Interazioni dei leucociti, in particolare lisozima M+ (LysM+) monociti, con la parete del vaso giocano un ruolo fondamentale nella promozione della disfunzione vascolare e ipertensione arteriosa. Qui presentiamo la tecnica per visualizzare e quantificare leucocita rotolamento e adesione nelle arterie carotiche in angiotensina II (AngII)-ha indotto l'ipertensione nei topi di IVM.
L'impianto di un catetere danneggia la parete vascolare e porta a risposte alterata delle cellule del sangue. Abbiamo confrontato le tecniche di iniezione differenti e vie di somministrazione per visualizzare i leucociti in un LysMCre++ di IRG mouse con diffusa espressione della proteina fluorescente rossa e condizionale espressione della proteina fluorescente verde in LysM + cellule. Per studiare l'attivazione delle cellule di LysM+ , abbiamo usato AngII infuso topi in cui rotolamento e adesione dei leucociti all'endotelio è aumentato. Abbiamo iniettato o catetere acridina arancione utilizzando una giugulare o direttamente se la coda della vena e rispetto la quantità di rotolamento e l'aderenza delle cellule. Abbiamo trovato che l'impianto di catetere giugulare per sé aumentato il numero di rotolamento e aderente LysM+ cellule in sham-infuso LysMCre+topi IRG+ rispetto ai controlli. Questa attivazione è stata aumentata in topi AngII-infuso. Interessante, l'iniezione di adesione delle cellule acridina arancio direttamente attraverso la coda della vena non ha aumentato LysM+ o rotolamento in topi falsità-infuso. Abbiamo quindi dimostrato l'importanza di topi transgenici reporter che esprimono le proteine fluorescenti per non interferire con i processi in vivo durante la sperimentazione. Inoltre, iniezione della vena della coda di traccianti fluorescenti potrebbe essere una possibile alternativa a iniezioni catetere giugulare.

Carotidi di LysMCre++ di IRG infusi con AngII topi sono stati osservati utilizzando IVM. Arancio di acridina è stato iniettato usando un catetere giugulare. Abbiamo mirato a guardare la proporzione di cellule LysM+ a contatto con la parete vascolare rispetto a tutte le cellule nucleate circolanti (che potrebbero anche interagire con la nave, poiché la discriminazione del tipo cellulare interagendo con la nave è rimasto un open domanda dal nostro lavoro precedente). Al basale, la presenza di un catetere giugulare provoca adesione delle cellule LysM+ (Figura 2A, D). Dopo l'iniezione di arancio di acridina, le stesse cellule erano fluorescente, ma anche le cellule endothelial erano fluorescenti (Figura 2B, E). Dopo la riduzione dello sfondo per limitare endoteliali correlate a fluorescenza, i dati indicano che tutte le cellule nucleate aderenti sono LysM+ (Figura 2, F); Questi risultati valgono dopo infusione di AngII confermando i nostri risultati precedenti e dimostrando che il LysMCre++ di IRG è un buon modello per osservare l'effetto di AngII sull'attivazione delle cellule LysM+ .
Abbiamo valutato il ruolo delle vie di somministrazione dell'acridina arancia sull'attivazione delle cellule LysM+ dopo infusione di AngII in LysMCre++di IRG. Dopo una settimana di AngII infusione, interazioni leucocitarie endotelio nelle arterie carotiche di LysMCre++ di IRG topi erano imaged e visualizzati da IVM con o senza iniezione di arancio di acridina tramite un catetere giugulare o attraverso la vena caudale. Senza catetere o iniezione, rotolamento delle cellule LysM+ è stato aumentato significativamente dopo infusione di AngII rispetto ai topi non trattati e l'adesione ha mostrato un aumento (Figura 3). Iniezione di acridina arancia con una catetere giugulare aumentata adesione e rotolamento in AngII topi trattati in misura maggiore rispetto ai topi senza catetere (Figura 3). Iniezione di acridina arancia nella vena caudale conduce ad adesione simili e rotolamento rispetto ai topi che non hanno ricevuto l'iniezione di arancio di acridina (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
Figura 1. Schema di infusione di angiotensina II e di valutazione di LysM+ cellule di rotolamento e adesione in topi. LysMCre++ di IRG topi sono stati infusi 7 giorni con AngII e aderendo così come rotolamento LysM+ cellule sopra le carotidi sono state quantificate con o senza iniezione di acridina arancia tramite un catetere giugulare o vena caudale iniezione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
Nella figura 2. Valutazione dell'adesione cellulare LysM+ e rotolamento nelle arterie carotiche di LysMCre+topi IRG+ . Cellule di adesione di LysM+ in LysMCre+topi IRG+ prima (A, D) e dopo l'iniezione di acridina (B, E) tramite un catetere giugulare. Fluorescenza rossa e verde sono state registrate, erano visibili cellule LysM+ (in verde) e cellule di muscolo liscio (in rosso). Dopo iniezione di arancio di acridina, le cellule endoteliali sono anche visibili in verde ma rimozione di fluorescenza di fondo permette solo circolanti nucleate visualizzazione delle cellule (C, F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
Nella figura 3. Valutazione delle vie di somministrazione di coloranti fluorescenti in angiotensina II infuso LysMCre+topi IRG+ . Quantificazione di rotolamento (A) e di aderire LysM (B)+ cellule in animali AngII-infuso o sham operati e con o senza iniezione di arancio di acridina utilizzando un catetere giugulare o di iniezione della vena della coda. Immagini rappresentative delle diverse condizioni (C). I risultati sono media ± errore standard della media. 2-way ANOVA è stato effettuato e post hoc test di Bonferroni, n = 3-12/gruppi; p &#60; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Questo manoscritto descrive l'uso di topi transgenici reporter e vie di somministrazione differenti di coloranti fluorescenti in angiotensina II-ipertensione indotta mediante videomicroscopia video microscopia dei vasi sanguigni per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e loro capacità di rotolare e aderire all'endotelio.

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

visualizing-leukocyte-rolling-adhesion-angiotensin-ii-infused-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.6K Views.  University Medical Center Mainz. Questo manoscritto descrive l'uso di topi transgenici reporter e vie di somministrazione differenti di coloranti fluorescenti in angiotensina II-ipertensione indotta mediante videomicroscopia video microscopia dei vasi sanguigni per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e loro capacità di rotolare e aderire all'endotelio.

Video: Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Imaging adesione dei leucociti all&#39;endotelio vascolare ad alta pressione intraluminale

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

La valutazione rapida e specifica del alogenazione perossidasi attività in campioni di sangue leucociti arricchita

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...