Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF-01EO1003 und BMBF 01EO1503) unterstützt.

Auf männliche Mäuse Alter 8 bis 12 Wochen alt unter der Zustimmung der Ethikkommission für Tierversuche aus Rheinland-Pfalz (Genehmigung Nr. 23 177-07/G12-1-002 und 23 177-07/G15-1-051) wurden Experimente durchgeführt.
1. Maus Anästhesie und OP-Vorbereitung
<ol>
	<li>Überprüfen Sie vor der Operation die gute Gesundheit und Kondition der Tiere. Überwachen Sie vor der Operation Tiere einmal pro Tag für 2-3 Tage auf ihren allgemeinen Zustand (aussehen, Haltung, spontanes Verhalten) sowie Körpergewicht, Ernährung und Wasserverbrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie den master-Mix für Anästhesie mit Midazolam (5 mg/kg Körpergewicht), Medetomidine (0,5 mg/kg Körpergewicht) und Fentanyl (0,05 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal (i.p.) 200 µL/30 g-Maus in 1 mL Spritze mit einer 26 G-Nadel zu injizieren.</li>
	<li>Osmotischen Pumpe Implantation und tierische Vorbereitung für IVM Experimente sind in einem Betrieb Feld mit 39 ° C Erwärmung Plattform durchgeführt. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge in einer Desinfektion Wanne und desinfizieren Sie die Erwärmung Plattform.</li>
	<li>Im Verlauf der Verfahren schützen Sie der tierischen Augen mit Augensalbe. Entfernen Sie das Fell mit Rasierer vor der osmotischen Pumpe Implantation. Verwenden Sie eine Haarentfernung Creme und Wattestäbchen zur Isolierung der Halsschlagadern und Vena Katheter Implantation in IVM Experimente. Die Tierhaut mit zwei Haut Desinfektionsmittel desinfizieren: ein Antiseptikum und Desinfektionsmittel mit Povidon-Jod und einer Haut antiseptisch mit Octenidin in Alkohol-basierte Lösung.</li>
	<li>Bereiten Sie den master-Mix zu antagonisieren Anästhesie ("antisedan Mix") mit Atipamezol (0,05 mg/kg Körpergewicht) und Flumazenil (0,01 mg/Kgbody Gewicht) und 200 µL/Maus in 1 mL Spritze mit einer Nadel 26 G subkutan zu bereiten (s.c.) gespritzt.</li>
</ol>
(2) osmotischen Pumpe Vorbereitung und Implantation
Hinweis: Die subkutane AngII Infusion mittels osmotische Pumpen wurde im Detail von Lu Et Al. beschrieben 17
<ol>
	<li>Bereiten Sie die AngII durch Neuaufbau des lyophilisierten Pulvers mit steriler Kochsalzlösung und passen Sie die Konzentration mit dem Tier Gewicht und die Fördermenge der Pumpe. Halten Sie die rekonstituierte AngII in Kunststoffrohren (verwenden Sie nicht Glasröhren).</li>
	<li>Füllen Sie die Pumpen mit AngII Lösung, 1 mg/(kg·d) für 7 Tage zu liefern. Halten Sie nach der Vorbereitung die Pumpen in steriler Kochsalzlösung für 4-6 h mindestens bei 37 ° C.</li>
	<li>Testen Sie die vollständige Anästhesie der Maus nach der Injektion des Anästhesie-Mix mit hinteren Fuß Reflexe und lege ihn auf den warmen Operationsfeld. Induktion der Anästhesie dauert 10-15 Minuten und funktioniert besser, wenn Tiere in einer dunklen Umgebung platziert werden.</li>
	<li>Rasieren Sie den unteren Rücken die Maus und desinfizieren Sie es mit einer alkoholischen Haut antiseptisch.</li>
	<li>Machen Sie einen 1 cm Schnitt senkrecht zur Wirbelsäule mit einer Schere. Eine Tasche für die Pumpe mit einem engen Gefäßklemme erstellen und fügen Sie die Pumpe (Moderator zuerst fließen). Die Tasche muss Freizügigkeit der Pumpe ohne Druck auf die Wunde zu ermöglichen.</li>
	<li>Schließen Sie die Wunde mit Fäden und nicht-Clips, um Entzündung zu begrenzen; dann desinfizieren Sie mit Haut antiseptisch.</li>
	<li>Antagonisieren die Narkose durch s.c. Injektion von 200 µL des antisedan-Mix und die Maus in seinen Käfig zurück.</li>
	<li>Postoperative Analgesie mit Buprenorphin durchführen (0,075 mg/kg s.c.) eine Zeit nach der Operation und bei Bedarf je nach dem Verhalten der Tiere.</li>
</ol>
(3) Vena Katheter Implantation und Halsschlagadern Vorbereitung
<ol>
	<li>Nach Injektion der Narkose mischen mit hinteren Essen Reflexe und das narkotisierten Tier in dorsalen Recumbence auf 39 ° C chirurgische Platte mit einer rektale Sonde um die Temperatur zu halten und die Salbe über testen Sie die komplette Anästhesie der Maus die Augen, sie während des Verfahrens zu schützen.</li>
	<li>Entfernen Sie Nackenhaare mit der Enthaarungscreme. Verwenden Sie ein Wattestäbchen zu verbreiten und reiben Sie die Creme für 2 min, bis die Haare beginnen zu fallen. Entfernen Sie nach einer zusätzlichen 2 min die Creme und Haare mit einem Spatel und desinfizieren Sie die Haut mit einer alkoholischen Haut antiseptisch.</li>
	<li>Führen Sie die Operation unter einem Stereomikroskop. Machen Sie einen 1-1,5 cm langen Schnitt in der Haut längs in den Hals, 1 cm neben der Luftröhre. Dann stellen Sie zwei weitere Einschnitte senkrecht zu beiden Extremitäten der ersten Schnitte.</li>
	<li>Vorsichtig entfernen Sie Gewebe direkt auf der Haut zu, und entfernen Sie das Stück Haut der linken Halsschlagader und Luftröhre.</li>
	<li>Sorgfältig isolieren der Ohrspeicheldrüse; sublinguale und Submaxillardrüsen Drüsen aus der Zone von Interesse mit 2 gebogenen Pinzette. Nicht geschnitten oder beschädigen der Drüsen, legen Sie sie um den besten Zugang zu der Halsschlagader und der Halsschlagadern zu ermöglichen.</li>
	<li>Um die Halsschlagader zu isolieren, verwenden Sie dünne Zange und öffnen Sie langsam und schließen Sie, um das Schiff aus dem umgebenden Gewebe sanft frei. Sobald die Vene vollständig sauber ist, positionieren Sie die Zange unter dem Behälter und platzieren Sie zwei 7-0 Nahtmaterial von 10 cm darunter zu.</li>
	<li>Schließen Sie die Naht proximal zu den Kopf mit zwei Knoten. Auf der anderen Naht bereiten ein Knoten aber nicht schließen.</li>
	<li>Den Katheter (0,28 mm Innendurchmesser 0,61 mm Außendurchmesser) gefüllt mit 37 ° C sterile Kochsalzlösung mit der Pinzette mit einer Hand zu halten; während mit der anderen Hand, machen Sie einen kleinen Schnitt in das Gefäß mit einer feinen Schere oder einer gebogenen 26 G-Nadel. Dann legen Sie den Katheter in die Halsschlagader und schließen Sie zwei Mal den Bund fürs Leben zu. Schließen Sie die Naht proximal zu den Kopf über den Katheter zur Sicherstellung der vollständigen Immobilisierung.</li>
	<li>Um zu isolieren und bereiten die Halsschlagadern, sezieren Sie die Fläche von der Luftröhre mit dünnen gebogenen Pinzette.</li>
	<li>Sobald die Halsschlagadern frei vom umgebenden Gewebe sind, entfernen Sie den Nervus Vagus (es sieht aus wie eine weiße Linie an der a. carotis) aus dem Behälter zu (aber schneiden Sie es nicht). Die dünnen Zange kann geschlossen und langsam geöffnet, um sanft den Nerv zu mobilisieren.</li>
	<li>Sobald beide Arterien ganz sauber sind, legen Sie die Zange unter der ersten Halsschlagader und legen Sie ein kleines schwarzes 3 mm breit x 2,5 cm Länge Plastikteil unter dem Behälter. Es ist sehr wichtig, nicht um das Schiff zu übernehmen und zu prüfen, ob der Blutfluss ist vorhanden, sobald der Schiff Halter platziert wird. Legen Sie die zweite Arterie über dem Schiff Inhaber. Wenn die Maus nicht direkt unter dem Mikroskop platziert ist, setzen Sie wieder die Drüsen über die Luftröhre und gelten Sie 37 ° C sterile Kochsalzlösung um zu vermeiden, Trocknen der Zone.</li>
</ol>
4. Bewertung der Rollen und die Einhaltung von Leukozyten / LysM + Zellen mit IVM
<ol>
	<li>Bereiten Sie Acridin orange aus einer 2 mg/mL Stammlösung bei-20 ° C gelagert und verdünnen Sie es 1:4 in steriler Kochsalzlösung (Endkonzentration 0,5 mg/mL) in einer 1 mL Spritze.</li></ol>Die Spritze vor Licht schützen und 200 µL pro Mausklick verwenden.<ol>
		<li>Unterschiedlichen Testbedingungen: (1) Injektion von Acridin orange mit der Vena Katheter; (2) Injektion von Acridin orange direkt in die Rute seitliche Vene (mit dieser Bedingung, die keine Vena Katheter implantiert wurde); (3) die Messung ohne Acridin orange mit Fluoreszenz LysMCre++ IRG Mäuse (hier wieder keine Vena Katheter implantiert wurde).</li>
	</ol>
	
	<li>Sobald der Katheter vorhanden ist und die zwei Halsschlagadern isoliert sind, positionieren Sie den Mauszeiger unter die Lupe genommen. Messungen mit einem High-Speed-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem Langstrecken Kondensator und eine 10 X (NA 0,3) Wasser eintauchen Ziel mit einem Monochromator, einen Strahlteiler und ein Ladegerät – Coupled-Kamera. Durchführen Sie Bildaufnahme und Analyse mit Echtzeit-imaging-System.</li>
	<li>Das Mikroskopobjektiv in der Mitte der Halsschlagader an der Endothel-Oberfläche zu konzentrieren. Injizieren Sie langsam 50 µL Acridin orange (0,5 mg/mL) (berücksichtigt das Totvolumen des Katheters für die erste Injektion). Stellen Sie die Software, 100 Bilder mit einer Belichtungszeit von 120 Millisekunden pro Bild aufzuzeichnen.</li>
	<li>Vier Videos pro Halsschlagader (links und rechts) an verschiedenen Standorten auf die Arterie für jedes Video zu machen. Wenn das Fluoreszenzsignal schwächer wird, injizieren Sie ein weiteres 50 µL Acridin orange.</li>
	<li>Nach der Aufnahme des Videos einschläfern Sie das Tier durch zervikale Dislokation.</li>
	<li>Legen Sie die Videogeschwindigkeit mit 10 Bildern pro Sekunde und quantifizieren Sie die Roll- und adhärenten Zellen in einer 200 µm X 250-µm-Rechteck-Ansicht in der Mitte des Schiffes für jedes Video. Roll- und adhärente Zellen zu zählen; adhärente Zellen werden als Zellen definiert, die nicht verschieben oder trennen Sie das Endothel innerhalb von 10 s-Video. Zur Vereinfachung der Quantifizierung entfernen Sie den Kanal mit der rote Fluoreszenz und verwenden Sie nur die grüne Fluoreszenz, um Roll- und anhaftende Zellen zu zählen.</li>
	<li>Machen Sie für Experimente mit Acridin orange eine manuelle Schwelle der Fluoreszenz, um Hintergrund von Endothelzellen gemacht zu entfernen.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension.">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans.">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li><li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+monocytes+and+platelets:+implication+for+life.">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li><li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation.">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li><li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway.">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice.">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+the+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).</li><li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

LysM+ Monozyten zeigten sich bereits in die Entwicklung von Bluthochdruck5verwickelt werden. Hier zeigen wir, dass Immunzellen LysM+ Rollen und an der endotheliale Schicht als Reaktion auf AngII Infusion haften. Diese Erkenntnis wurde gewonnen, mit LysMCre++ IRG Mäuse aus unseren früheren Studien erforschen die Rolle von Immunzellen in Hypertonie in Vivo durch die Visualisierung Leukozyten mit Einspritzung von Acridin orange6,10. Diskriminierung von Zelltypen, die Einhaltung des Endothels war somit nicht möglich.
Die IVM ist ein sehr nützliches Tool für vaskuläre Untersuchungen und in-Vivo Beobachtungen der Zellen direkt in das Gefäßsystem, aber die Wirkung der Injektion Farbstoffe mit Hilfe von chirurgisch Katheter im Zusammenhang mit entzündlichen Hypertonie bleibt unbekannt. Zur Bewertung der möglichen Wirkung der Katheter und Acridin orange Injektion wir nutzten LysMCre++ IRG Mäuse. AngII Infusion stieg die Zahl der Rollen LysM+ Zellen des Endothels. Einführen eines Katheters in die Halsschlagader verstärkt die Wirkung und rollende und anhaftende Leukozyten erkannt wurden, in AngII infundiert Mäuse mit einem Katheter verglichen mit Mäusen ohne Katheter Implantate instrumentiert. Dies weist darauf hin, dass Implantation einer Halsschlagader Katheter Ursachen eine systemische Entzündungsreaktion im Rahmen der Wundheilung, überlagert mit der Immunreaktion in Hypertonie18gesehen. Darüber hinaus aufgrund der Nähe der Halsschlagader an der Halsschlagader eine zusätzliche Immunaktivierung möglicherweise aufgetreten durch Einwirkung auf die Halsschlagader. Da dieser Effekt nicht anwesend war, als Injektionen direkt in die Vene Heck vorgenommen wurden, ist davon auszugehen, dass der Effekt zurückzuführen war, der Farbstoff nicht aber an die Prozedur des Einsetzens des Katheters. Die Bedeutung von transgenen Reporter Mäusen mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine in Vivo Prozesse während der Experimente nicht stören, die wir hier demonstriert. Darüber hinaus möglicherweise Schweif Vene Injektion von Fluoreszenz Tracer eine mögliche Alternative zur Vena Katheter Injektionen.
Ein wichtiger Schritt des Verfahrens ist die AngII Infusion. Tail kann Manschette des Blutdrucks beurteilt werden um die Wirksamkeit der AngII Lieferung kontrollieren von der Pumpe. Nach 2−3 Tagen der Infusion sollte den Blutdruck erhöhen. Um Entzündung zu begrenzen, die LysM+ Zellen Aktivierung beeinflussen könnten, sollten die Schließung des Schnittes, wo die Pumpe implantiert wird, mit Nähten statt Clips erfolgen. Eine Einschränkung über Heck Vene Injektion zu beachten: um die beste mögliche Datenerfassung machen, 4 Videos stammen in der Regel für jede carotis. Sinkt das Fluoreszenzsignal 50 µL Acridin Orange gespritzt, aber mit Schweif Injektion ist es schwieriger, mehrere Injektionen zu machen und um die Halsschlagadern unter dem Mikroskopobjektiv stabil zu halten. Die Dauer der Anwesenheit eines Katheters in die Halsschlagader könnte auch die Aktivierung von Immunzellen modulieren, da es die Gerinnung Aktivierung im Platelet-Rich Plasma vorbereitet 4 h nach der Katheter Implantation19betroffen sind. Dieser Aspekt der Katheter Implantation bedarf weiterer Untersuchung.
Schließlich, auch wenn wir die Auswirkungen der Vena Katheter Implantation auf LysM+ -Zell-Aktivierung nach AngII Infusion schätzen, können wir voll die Rolle der Vorbereitung, Haut entfernen und Karotis Isolation auf eine mögliche LysM+ -Zelle nicht einschätzen Aktivierung. Wir schlussfolgern, dass die Nutzung von Fluoreszenz Reporter Mäusen wie LysMCre++ IRG Maus wird empfohlen, die Störung des Schiffes Integrität während der tierischen Vorbereitung für die in-Vivo Bildgebung zu vermeiden.

Arterielle Hypertonie erhöht das Risiko von Herz-Kreislauf-Krankheit und Tod und fördert die Entwicklung von Arteriosklerose, koronare Herzkrankheit und arteriellen oder venösen Thromboembolisms1. Die Entwicklung von Bluthochdruck hängt das Zusammenspiel von ökologischen, genetische, endokrine und hämodynamischen Faktoren. Derzeit sind Immunität und damit verbundene Entzündungen geschätzt, um eine wichtige Rolle in der Ätiologie der Hypertonie2.
Unter den Immunzellen fanden T-Lymphozyten sowie Monozyten und Makrophagen in AngII-induzierten vaskulären Entzündung und Bluthochdruck, teilweise im Zusammenhang mit ihrer Fähigkeit, reaktive Sauerstoff Spezies3auslösen ursächlich beteiligt sein. Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor mangelhaft Mäuse zeigten verringerte Reaktion auf AngII zu Blutdruckanstieg und vaskulären Entzündung4. In einer früheren Arbeit konnten wir zeigen, dass LysM + Monozyten vaskuläre Dysfunktion und Entzündungen im AngII-induzierte Hypertonie5fahren. Vor kurzem haben wir einen neuartigen Weg in die, den Gerinnung Faktor XI mit Thrombozyten und der Gefäßwand kooperiert induzieren Thrombin-abhängige vaskulären Entzündung6beschrieben. Das aktuelle Wissen über die Rolle des Immunsystems bei Hypertonie wurde vor kurzem zusammengefasst und bewertet von Rodriguez-Iturbe Et Al. 7
Da die Beteiligung von Immunzellen in die Entwicklung von Bluthochdruck deutlich wurde, wurde Modelle und Techniken, um die Interaktion zwischen dem Schiff und Immunzellen zu studieren notwendig. Epifluorescence IVM der Blutgefäße ist ein nützliches Tool um in Vivo Interaktionen zwischen den zirkulierenden Blutzellen und das Endothel8,9,10zu beobachten. Mit dieser Technik kann die Injektion von Farbstoffen (z. B. Acridin Orange) mit DNA verschuppen kernhaltigen Zellen (zirkulierende sowie aus dem Endothel) visualisieren. Isolierte Blutplättchen gebeizt ex Vivo mit Rhodamin 6 G oder Dichlorofluoresceins (DCF) Platelet-Rich Thrombus im arteriellen oder venösen Verletzungen Modelle visualisieren injiziert werden kann.
In der Regel ein Halsschlagader Katheter ist Tracer injiziert oder markierte Thrombozyten. Änderung des Endothels und anschließende Aktivierung der Gerinnung Kaskade sind beide bekannt, auf Monocyte Aktivierung auswirken. Endotheliale Schädigung führt sofort zur Thrombozyten Aktivierung über subendothelial Matrix Moleküle, die Gewebe mit anschließenden Monocyte Attraktion und Aktivierung11zu versiegeln. Im Gegenteil, eine intakte Endothel bekanntermaßen gerinnungshemmenden Eigenschaften (z. B. über Gewebe Factor Pathway Inhibitor oder Thrombomodulin)12 und direkte hemmende Wirkungen auf die Monocyte, z. B.durch die Sekretion von extrazelluläre Vesikel mit Micro-RNAs13. Monozyten sind dafür bekannt, produzieren einen Gewebe-Faktor, der extrinsischen Aktivator der Koagulation Kaskade und ausdrückliche Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs), die durch Thrombin aktiviert werden können und an Monocyte Aktivierung14,15 . Daher Aktivierung der Blutplättchen oder der Koagulation Kaskade durch Gefäßverletzung möglicherweise unerwartete Auswirkungen auf Monocyte Aktivierung und stören das beobachtete Phänomen. Mit Hilfe der IRG transgenen LysM Cre transgene Mäuse, eine Doppel-fluoreszierende Cre Reporter Maus (LysMCre+IRG+) schlagen wir im Detail studieren die Wirkung der Injektionen mit einem Katheter und Alternative Methoden auf LysM+ Myelomonocytic Zellen in einem Mausmodell der arteriellen Hypertonie16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

Epifluoreszenz intravitalen Videomikroskopie (IVM) der Blutgefäße ist eine etablierte Methode der Aktivierung von Immunzellen und ihre Fähigkeit zur Rolle zu beurteilen und haften an der endotheliale Schicht. Visualisierung der zirkulierenden Zellen durch Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen oder Fluorophor-gekoppelten Antikörper wird häufig verwendet. Alternativ können fluoreszierende Reporter Mäuse verwendet werden. Wechselwirkungen von Leukozyten, in bestimmten Lysozym M+ (LysM+) Monozyten mit der Gefäßwand spielen entscheidende Rolle bei der Förderung vaskuläre Dysfunktion und arterielle Hypertonie. Wir präsentieren hier die Technik zu visualisieren und zu quantifizieren, Leukozyten Rollen und Haftung in Halsschlagadern in Angiotensin II (AngII)-induzierte Hypertonie bei Mäusen durch IVM.
Die Implantation eines Katheters die Gefäßwand schädigt und führt zu veränderten Blutkörperchen Reaktionen. Wir gegenüber verschiedenen Injektionstechniken und Verwaltung Routen zu visualisieren, Leukozyten in einem LysMCre++ IRG Maus mit weit verbreiteten Ausdruck rot fluoreszierenden Proteins und bedingten Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins in LysM + Zellen. LysM+ -Zell-Aktivierung zu studieren, verwendeten wir AngII infundiert Mäuse in welche Rollen und Adhäsion von Leukozyten des Endothels erhöht wird. Wir entweder Acridin orange mit einer Halsschlagader Katheter injiziert oder direkt wenn das Heck Vene und verglich die Höhe der Rollen und die Einhaltung von Zellen. Wir fanden, dass Vena Katheter Implantation schlechthin die Zahl der Rollen stieg und anhaftende LysM+ Zellen in Sham-LysMCre+IRG+ -Mäuse im Vergleich zu Kontrollen Infusion. Diese Aktivierung wurde bei Mäusen AngII infundiert ergänzt. Interessanterweise Injektion Acridin orange direkt durch den Schweif Vene nicht zu einer Erhöhung LysM+ Zelladhäsion oder Rollen in Sham-infundiert Mäuse. Damit beweisen wir die Bedeutung der transgenen Reporter Mäuse mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine in Vivo Prozesse während der Experimente nicht stören. Darüber hinaus möglicherweise Schweif Vene Injektion von Fluoreszenz Tracer eine mögliche Alternative zur Vena Katheter Injektionen.

Halsschlagadern von LysMCre++ IRG wurden Mäuse mit AngII infundiert mit IVM beobachtet. Acridin Orange wurde mit einem Vena Katheter injiziert. Wir wollten den Anteil der LysM+ Zellen in Kontakt mit der Gefäßwand im Vergleich zu allen kernhaltigen zirkulierenden Zellen (die auch mit dem Schiff interagieren konnte, da Diskriminierung des Zelltyps Interaktion mit dem Schiff eine offene blieb Schau Frage von unserer bisherigen Arbeit). Bei Studienbeginn führt die Anwesenheit eines Vena Katheters Adhäsion LysM+ Zellen (Abb. 2A, D). Nach der Injektion Acridin orange, dieselben Zellen fluoreszierende, aber auch die Endothelzellen waren fluoreszierende (Abb. 2 b, E). Nach der Reduzierung des Hintergrunds an Endothelzellen zu begrenzen im Zusammenhang mit Fluoreszenz, zeigen die Daten, dass alle kernhaltigen anhaftende Zellen sind LysM+ (Abbildung 2, F); Diese Ergebnisse gelten nach AngII Infusion bestätigt unsere bisherige Ergebnisse und zeigen, dass die LysMCre++ IRG ein gutes Modell, die Wirkung von AngII auf LysM+ -Zell-Aktivierung zu beobachten ist.
Wir bewerten die Rolle der Verwaltung Routen von Acridin orange auf LysM+ -Zell-Aktivierung nach AngII Infusion in LysMCre++IRG. Nach einer Woche AngII Infusion, Leukozyten-Endothel-Interaktion in Halsschlagadern von LysMCre++ IRG Mäuse waren abgebildet und visualisiert durch IVM mit oder ohne Injektion von Acridin orange über einen Vena Katheter oder durch die Rute Vene. Ohne Katheter oder Injektion wurde Rollen LysM+ -Zellen deutlich erhöht, nach AngII Infusion im Vergleich zu unbehandelten Mäusen und Adhäsion eine Zunahme (Abbildung 3 zeigten). Injektion von Acridin orange mit einem Vena Katheter erhöhte Adhäsion und rollt in AngII behandelten Mäuse in einem größeren Ausmaß im Vergleich zu Mäusen ohne einen Katheter (Abbildung 3). Injektion von Acridin orange in der Rute Ader führt zu ähnlichen Adhäsion und Rollen im Vergleich zu den Mäusen, die Injektion von Acridin orange (Abbildung 3) nicht erhalten haben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
Abbildung 1. Regelung für Angiotensin-II-Infusion und Bewertung von LysM+ Zellen Rollen und Haftung bei Mäusen. LysMCre++ IRG Mäuse waren 7 Tage mit AngII infundiert und Einhaltung sowie Rollen LysM+ Zellen über die Halsschlagadern wurden quantifiziert, mit oder ohne Injektion von Acridin orange durch eine Vena Katheter oder Schweif Vene Injektion. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
Abbildung 2. Bewertung von+ LysM Zelladhäsion und Rollen in Halsschlagadern von LysMCre++ IRG Mäuse. Haftung des LysM+ Zellen in LysMCre++ IRG Mäuse vor (A, D) und nach (B, E) Acridin Injektion über einen Vena Katheter. Rote und grüne Fluoreszenz verzeichneten, LysM+ Zellen (in grün) und glatten Muskelzellen (in rot) waren zu sehen. Nach Injektion von Acridin Orange Endothelzellen sind auch sichtbar in grün aber entfernen Hintergrundfluoreszenz ermöglicht, dass nur im Umlauf kernhaltigen Zelle Visualisierung (C, F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Bewertung der Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin II infundiert LysMCre++ IRG Mäuse. Quantifizierung der Rollen (A) und (B) LysM+ die Einhaltung Zellen im Schein betrieben oder AngII infundiert Tiere und mit oder ohne Injektion von Acridin Orange mit einem Vena Katheter oder durch Rute Vene Injektion. Repräsentative Bilder die unterschiedlichen Bedingungen (C). Ergebnisse sind Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. 2-Way ANOVA durchgeführt wurde und Bonferronis post Hoc Test, n = 3-12/Gruppen; p &#60; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von transgenen Reporter Mäuse und verschiedenen Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin-II-induzierte Hypertonie mit intravitalen Videomikroskopie der Blutgefäße, um die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten und ihre Fähigkeit, Rollen und halten uns an das Endothel.

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.6K Aufrufe.  University Medical Center Mainz. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von transgenen Reporter Mäuse und verschiedenen Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin-II-induzierte Hypertonie mit intravitalen Videomikroskopie der Blutgefäße, um die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten und ihre Fähigkeit, Rollen und halten uns an das Endothel.

Serie: Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...