Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo di Klebsiella, come quali geni vengono utilizzati per regolare la capsula e i virulenti associati. I principali vantaggi di questa tecnica sono che fornisce un mezzo per separare fisicamente ceppi capsulati e non capsulati, e può anche essere utilizzato per confronti rapidi tra ceppi di produzione di capsule. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per studiare la regolazione delle capsule a Klebsiella, può anche essere applicato a diverse specie batteriche.
Generalmente gli individui che sono nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché versare i gradienti e aggiungere le celle ai gradienti può essere piuttosto difficile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché mostriamo le tecniche difficili da padroneggiare, fornendo suggerimenti e suggerimenti per aiutare l'utente. Per iniziare, selezionare una singola colonia da una piastra di serie con un anello sterile e inoculare 10 millilitri di un brodo appropriato.
Incubare la coltura durante la notte. Quindi trasferire la coltura in un tubo da 15 millilitri e centrifugare. Successivamente, scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in due millilitri di PBS.
Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante risultante. Quindi sospendere di nuovo il pellet in due millilitri di PBS. Per creare le diluizioni del gradiente di densità, combinate il mezzo gradiente di densità con PBS.
Quindi aliquota 600 microlitri di ogni diluizione gradiente in singoli due tubi millilitro. Prendere 100 microlitri di celle con una pipetta da 200 microlitri e posizionare la punta della pipetta sul lato del tubo appena sotto il menisco di uno dei tanti gradienti. Aspirare le cellule batteriche sul gradiente molto lentamente, facendo attenzione a non mescolare l'interfaccia.
Centrifugare i tubi preparati per 10 minuti a 8.000 g. Successivamente, trasferire i tubi su un rack per visualizzare la diluizione minima del gradiente necessaria per mantenere le celle appena sopra il livello di sfumatura. In primo luogo, trasferire un millilitro della diluizione del gradiente di densità più diluito in un tubo a fondo tondo da cinque millilitri.
Utilizzando una siringa con un ago da 1,5 pollici, prendere un millilitro del successivo gradiente di densità più concentrato. Posizionare l'ago nella parte inferiore del tubo e iniettare il contenuto della siringa molto lentamente. Deve esserci un'interfaccia chiara in ogni fase del gradiente di densità.
Se gli strati si mescolano, non si otterrà una separazione pulita dei batteri. Rimuovere delicatamente l'ago dalla sfumatura in modo da non disturbare l'interfaccia tra le diluizioni del gradiente. Quindi posizionare il tubo in un rack.
Aggiungere con cura 600 microlitri delle cellule preparate alla parte superiore del gradiente nel tubo. Quindi posizionare il tubo in un adattatore per tubi e pesare il tubo con l'adattatore per garantire l'equilibrio. Successivamente, posizionare l'adattatore del tubo in un rotore ad angolo fisso all'interno di una centrifuga da banco e centrifugare il tubo per 30 minuti a 3.000 g.
Infine, dopo la centrifugazione, rimuovere attentamente il tubo, posizionarlo in un rack e fotografare i risultati. In questo protocollo, la centrifugazione del gradiente di densità è stata utilizzata per separare i ceppi batterici in base alla quantità di capsula che producono. Sebbene i risultati esatti dipendano dalle specie batteriche, la maggior parte dei ceppi migrerà in una singola posizione all'interno del gradiente.
L'applicazione di questo metodo a una libreria mutante batterica dovrebbe produrre una banda maggiore sopra il gradiente, una banda meno densa attraverso lo strato più alto del gradiente e una frazione acapsulare minore nella parte inferiore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le interfacce sfumato non devono essere mescolate e che la sfumatura non deve contenere bolle d'aria. Seguendo la procedura, devono essere eseguiti metodi di convalida come il saggio dell'acido uronico o la microscopia per esaminare le quantità di capsule.
Questo è particolarmente importante quando si utilizza questa tecnica per nuovi ceppi. Non dimenticare che lavorare con gli agenti patogeni di Hazard Group 2 può essere pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura devono sempre essere prese precauzioni quali dispositivi correttivi di protezione, aderendo alle valutazioni dei rischi e smaltindo correttamente le colture.
