Gli autori desiderano ringraziare Norman Krüger per il suo eccellente supporto tecnico.

1. Parte 1: Cultura della hNPCs in PuraMatrix <ol><li> In anticipo per la generazione di un ponteggio con una concentrazione PuraMatrix del 0,25% senza laminina si ha la necessità di preparare le seguenti soluzioni </li><li> Preparare una soluzione contenente 20% di saccarosio e una soluzione contenente il 10% di saccarosio disciolto in acqua distillata sterile. </li><li> Per la soluzione 1 mix 120 ml di soluzione di saccarosio al 20% con 120 ml di acqua distillata in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Per la soluzione 2 mescolare 60 ml di soluzione PuraMatrix con 60 ml di soluzione di saccarosio al 20% in un tubo di 1,5 ml. </li></ol> Per la preparazione di un ponteggio con una concentrazione di 0,25% PuraMatrix integrato con laminina (8 mg per 100 microlitri Matrix) si ha la necessità di preparare le seguenti soluzioni. <ol class="lroman"><li> Per la soluzione 1 miscelare 72 ml di acqua distillata con 120 ml di soluzione di saccarosio al 20% e 48 microlitri laminina in un tubo di 1,5 ml. </li><li>Per la soluzione 2 mescolare 60 microlitri PuraMatrix soluzione con 60 ml di soluzione di saccarosio al 20% in una provetta da 1,5 ml. </li></ol><ol start="5"><li> Per il radicamento di cellule nel PuraMatrix preparare un 4-ben piastra di coltura cellulare e mettere un coperchio di vetro sterilizzati antiscivolo (diametro 13 mm) in due pozzi. Conservare la piastrina in panchina pulita per l&#39;uso in seguito. Scivola copertura in vetro vengono utilizzati solo per gli studi di immunocitochimica. Se non colorazioni immunocitochimiche sono destinati, il passo può essere saltato. </li></ol> Per preparare il hNPCs per l&#39;incapsulamento in 3D uno ponteggi deve preparare le seguenti soluzioni. Diluire il benzonasi nel tripsina / EDTA soluzione, utilizzando un fattore di diluizione di 1:10.000. Per un mix soluzione Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + benzonasi 25U/μl + 1% + Tripsina HSA-inibitore (0.5mg/ml). <ol start="6"><li> Staccare le cellule aggiungendo 500 microlitri tripsina / benzonasi soluzione e incubare per 5 minuti in un incubatore (37 ° C, 5% di CO 2). Arrestare la reazione con la soluzione Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Successivamente le cellule centrifuga staccato per 5 min a 3000 x g. Lavare le cellule con 5 ml di soluzione di saccarosio al 10% e centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in soluzione di saccarosio al 10%, la soluzione finale deve contenere cellule 1x10 6 cellule / ml. </li></ol> I prossimi passi, da 1,8 a 1,11, dovrebbe essere fatto il più velocemente possibile, a causa del basso pH della soluzione PuraMatrix, che potrebbe essere dannosa per le cellule. <ol start="8"><li> Mescolare 60 ml di sospensione cellulare con la soluzione 1. </li><li> Aggiungere 120 ml di soluzione 1, contenente le cellule, per il tubo conico con la soluzione 2 e mescolare con cura. </li><li> Posto 100 ul della miscela immediatamente su ogni copertina scivola risiedeva nel 4-pozzetti. </li><li> Aggiungere lentamente 200 ul terreno di coltura cellulare per bene e dopo 2-3 minuti, un altro 200 ul. Questo avvierà l&#39;auto-assemblaggio della matrice. </li><li> Incubare cells a 37 ° C, per 1 ora in panchina pulita su una piastra di riscaldamento o l&#39;area riscaldata del banco pulito. Per quanto possibile, non si muovono la piastra in quanto ciò potrebbe danneggiare l&#39;assemblaggio delle matrici. </li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo, ma non tutti, per evitare le matrici cadere a secco, con una pipetta 1000 ml. Aggiungere 500 l di media a lavare matrici per 10 minuti. Infine rimuovere il supporto e aggiungere 500 microlitri di medie posto fresco e la piastra di coltura in un incubatore (37 ° C CO, 5% 2). Poiché le matrici sono sensibili agli urti i piatti dovrebbe essere spostato il meno possibile e conservarli, se possibile, in un apposito incubatore. </li><li> Il hNPCs qui utilizzate sono state moltiplicate per 7 giorni nel 3D-scaffold e la differenziazione è stata avviata con il ritiro dei fattori di crescita 13. Medio è stato cambiato ogni 2-3 giorni. </li></ol> 2. Parte 2: colorazione immunocitochimica delle matrici intere <ol><li> In anticipo per la procedura di colorazione bisogna preparare: abSoluzione tampone di bloccaggio composto da 5% di siero normale di capra e lo 0,3% di Triton X-100 (sciolto in PBS, una soluzione di paraformaldeide al 4% sulla base di 0,1 M PBS e se aveva bisogno di una soluzione con 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid DAPI) per la colorazione dei nuclei DAPI contenente 100 ng / ml sciolto in PBS. I campioni sono stati montati con un misto di Mowiol e DABCO. </li><li> Per lavare le matrici di rimuovere il terreno con una pipetta 1000 ml e lavare i ponteggi una volta con PBS per 5 minuti. </li><li> Per fissare i ponteggi togliere il PBS e aggiungere 400 ml di paraformaldeide (4% di 0,1 M PBS) in ogni pozzetto e incubare le matrici per 30 minuti a temperatura ambiente. Ponteggi fissi possono essere memorizzati in PBS integrato con 0,02% NaN 3 a 4 ° C per diverse settimane fino a diversi mesi. </li><li> Prima di una colorazione lavare i ponteggi con PBS per 5 minuti. </li><li> Incubare i ponteggi in blocco soluzione tampone. Soluzione bloccante è stata cambiata tre volte ogni 2-3 ore ed esercizi successividipendentemente ponteggi sono stati incubati in soluzione il blocco durante la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione tampone di bloccaggio e aggiungere l&#39;anticorpo primario sciolto in PBS integrato con 1% di siero normale di capra e incubare le matrici per tutta la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e lavare ponteggi 4 volte per 2 ore e successivamente per tutta la notte a 4 ° C con PBS. </li><li> Rimuovere la PBS e aggiungere la soluzione con l&#39;anticorpo secondario, sciolto in PBS integrato con 1% di siero di capra normale, per 4 ore a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare i campioni con PBS 4-6 volte per 1 ora e successivamente per tutta la notte a 4 ° C al buio. </li><li> Per una colorazione nuclei si possono aggiungere 400 microlitri della soluzione DAPI per 30 min. </li><li> Per montare i campioni si ha la necessità vetrini da microscopio. Aggiungere 50 microlitri Mowiol / DABCO sui vetrini da microscopio. Togliere il coperchio scivola dal 4-pozzetti e metterli attenzione sul supporto di montaggio. </li><li> Qui abbiamo usato un 8000 Biozeromicroscopio (Keyence, Germania, Karlsruhe) per ottenere micrografie singolo e z-stack. Ogni stack contiene 30 singole immagini con una distanza di 1-2 micron. Utilizzando il software corrispondente analizzatore la sfocatura inerente alla fluorescenza è stato rimosso prima proiezione completa del z-stack sono stati prodotti. </li></ol> 3. Parte 3: Rilascio di hNPCs dalle impalcature per l&#39;analisi di citometria a flusso <ol><li> In anticipo per il rilascio delle cellule dal ponteggi lavare i ponteggi HBSS con 500 microlitri. </li><li> Trasferire i ponteggi per mezzo di una pipetta 1000 ml in una provetta da 15 ml contenenti terreno di coltura cellulare. </li><li> Per disturbare i ponteggi meccanicamente risospendere la soluzione delle cellule più volte con una pipetta 1000 ml e, successivamente, centrifugare la soluzione a 3000 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante con una pipetta, aggiungere 500 ml di tripsina / benzonasi soluzione e risospendere il pellet di cellule diverse volte. </li><li> Incubare le cellule per 5 minutia 37 ° C in tripsina / benzonasi soluzione. Per fermare la reazione aggiungere 1 ml di soluzione Trypsin-inhibitor/Benzonase e pipettare su e giù diverse volte. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare 5 min a 3000 xg, rimuovere il surnatante e lavare le cellule con 2 ml di tampone HBSS. Ripetere questa operazione due volte. Questa procedura rimuovere i detriti matrice. </li><li> Passare attraverso la sospensione di cellule soluzione un filtro cella (dimensione dei pori 70 micron) per rimuovere inerti e raccogliere le cellule in terreno di coltura cellulare. Le cellule ottenute possono essere seminati di nuovo ad esempio su vetrini coprioggetto per studi funzionali come patch clamp o misure fluometric. Per elaborare le cellule per citometria a flusso, fissare le cellule immediatamente (vedi 4.1). </li></ol> 4. Parte 4: Quantificazione βIII-tubulina cellule positive mediante citometria di flusso <ol><li> Fissare le cellule rilasciato ottenuto nel passaggio 3,7% PFA con 1 per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 3000 xg di age il surnatante. Se necessario, le cellule possono essere preparato per essere conservato a 4 ° C per la successiva analisi. Quindi risospendere le cellule in tampone di lavaggio (PBS integrata con 0,5% di BSA e 0,02% Na-azide). </li><li> Per procedere con la preparazione per la citometria a flusso, centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 350 xg, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 25 microlitri della soluzione di anticorpi. Pertanto il primo anticorpo è mescolato con tampone saponina ad una concentrazione 1:100 per esempio βIII-tubulina. Il buffer è costituito da saponina PBS con una concentrazione di saponina dello 0,5%, una concentrazione di BSA 0,5% e una Na-azide concentrazione del 0,02%. </li><li> Incubare la sospensione cellulare con il primo anticorpo per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Come controllo negativo preparare un campione senza il primo anticorpo. </li><li> Per la prima fase di lavaggio aggiungere 300 microlitri di buffer saponina direttamente alle cellule. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. Per la fase di lavaggio secondo, scartareil surnatante, aggiungere 300 microlitri di buffer e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 25 ul di soluzione contenente l&#39;anticorpo secondario (per esempio Alexa Fluor 647, 1:1000, disciolto in tampone saponina). Incubare le cellule con l&#39;anticorpo secondario 1h a temperatura ambiente, al buio. </li><li> Per la prima fase di lavaggio aggiungere 300 microlitri di buffer saponina direttamente alle cellule. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. Per la fase di lavaggio secondo, scartare il surnatante, aggiungere 300 microlitri di buffer e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lavaggio per l&#39;analisi di citometria a flusso. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Un esempio di hNPCs coltivate in auto-assemblaggio idrogel impalcatura PuraMatrix è mostrato in figura 1. Il hNPCs crescere in strutture sferica come in PM non modificato. In questa condizione la culturas, le cellule possono difficilmente essere riconosciuta in una trasmissione della luce, anche se fasci di processi tra le sfere sono visibili (fig. 1A). A seconda delle condizioni di coltura del tipo di cellule, la matrice può essere modificato ad esempio con l&#39;aggiunta di laminina. Per la linea cellulare hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina è necessario per indurre un modello di crescita con aggregati meno denso, ma una distribuzione più omogenea delle cellule (fig 1B). Indipendente di modifiche, la matrice può essere utilizzato per studiare ad esempio la differenziazione neuronale. Figura 1C presenta una colorazione della hNPCs per il marcatore neuronale βIII-tubulina. In questo esempio, le cellule sono state coltivate per 7 giorni nella matrice e successivamente differenziati per 4 giorni, in cui è stata indotta la differenziazione con il ritiro dei fattori di crescita EGF e bFGF. 13 corpi cellulari e una fitta rete di processi costruiti dalle cellule possono essere riconosciuto facilmente. Tuttavia, è evidente che una quantificazione del numero delle cellule è molto tempo, come un gran numero dile immagini di diverse regioni della matrice deve essere analizzato, per ottenere una base di dati affidabile per una analisi statistica. In 1D fico si può vedere un esempio di cellule rilasciati dalla matrice e successivamente intrecciata su coprioggetto. Queste cellule potrebbero essere utilizzate per studi funzionali. Il rilascio delle cellule dal 3D-scaffold offre la possibilità di analizzare diversi parametri come espressione di proteine ​​marker o il tasso di sopravvivenza delle cellule da parte AnnexinV / PI colorazione o un saggio TUNEL. La Figura 2 mostra un esempio di analisi di citometria a flusso della percentuale di βIII-tubulina cellule +. Il controllo negativo (cellule non contrassegnati per βIII-tubulina) è mostrato in figura 2A. Questi controlli vengono utilizzati per determinare la porta per la rilevazione successiva βIII-tubulina + cellule (Fig. 2b). Un confronto di un conteggio manuale delle cellule e l&#39;analisi in citometria a flusso è mostrato nella figura 2C. La percentuale di βIII-tubulina cellule + è stato determINED contando il numero totale di cellule (per mezzo di una colorazione nucleare DAPI) e il numero di cellule tubulina βIII-+ nelle immagini a fluorescenza. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Figura 1. hNPCs coltivate in auto-assemblaggio PuraMatrix peptide idrogel. A) hNPCs incapsulati in PuraMatrix (PM) crescono in sferica, strutture dense confezionato, in cui il diametro delle sfere può arrivare a diverse centinaia di micron. Tra le sfere si può riconoscere fasci di processi costruiti dalle cellule (frecce). B) Le cellule incapsulate in PuraMatrix integrato con laminina (PML) crescono in strutture meno denso, più omogeneamente distribuita. Nel laminina integrata matrice si può riconoscere singole cellule in aree meno dense (frecce), tuttavia è quasi impossibile quantificare il numero di cellule. C) hNPCs differenziato per 4 giorni in contrassegno PML esprimere neuronali come βIII-tubulina (verde). Di valutazionete la percentuale di cellule positive si deve determinare il numero totale delle cellule da una colorazione nuclei come DAPI (blu). Il Microfotografia presenta la proiezione completa di un z-pila di foto scattate con Biozero-8000 microscopio. D) Le cellule rilasciati dalla matrice possono essere seminati su vetrini coprioggetto per esempio per ulteriori studi funzionali. Il Microfotografia mostra cellule in coltura per il 3D, successivamente alla procedura di rilascio. La colorazione per βIII-tubulina (rosso) rivela una morfologia comparabile alle cellule ospitato nel patibolo 3D. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi di citometria a flusso delle cellule liberato dalla PuraMatrix. Per superare la quantificazione in termini di tempo di microfotografie abbiamo utilizzato un protocollo di rilasciare cellule in coltura in PuraMatrix che danno accesso alle più veloce analisi di citometria a flusso. A) le cellule non colorati sono state usate come controllo negativo, per impostare la porta (cornice nera) per la successiva analisiper esempio di βIII-tubulina cellule. B) Per quantificare la percentuale di βIII-tubulina + cellule è stata utilizzata la porta stessa, ambientato nel controllo negativo,. Cellule positive appaiono nella parte destra l&#39;asse x, dove inoltre è stata osservata una popolazione intermedia (telaio tratteggiata), molto probabilmente detriti cellulari che rappresentano. C) Il confronto del manuale cellule contate e le cellule contate mediante citometria a flusso ha evidenziato una più alta proporzione di cellule positive, dove la dipendenza dal tempo del numero di βIII-tubulina + era paragonabile, indicando l&#39;affidabilità del protocollo di citometria a flusso.

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ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;uso del 3D-scaffold offre l&#39;opportunità di studiare lo sviluppo di diversi tipi di cellule in una situazione di coltura cellulare più vicino alla situazione in vivo. Per quanto riguarda invece l&#39;analisi di esempio differenziamento neuronale o studi funzionali si deve superare alcuni ostacoli per ottenere dati affidabili per la quantificazione esempio di tipi di cellule. Qui abbiamo descritto la cultura del hNPCs in idrogel a base di peptidi patibolo PuraMatrix e il c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptide idrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> I mouse laminina </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Sale Hanks &#39;soluzione equilibrata 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubulina di anticorpi </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Mouse, monoclonale, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11029 </td><td> Capra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Capra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Capra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 reagente </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano 98% </td></tr><tr><td> Cellulare filtro </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 micron dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonasi 250 U / mL </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% di HSA </td><td> Octapharma </td><td> Albumina umana Kabi-20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

L&#39;influenza di 3 dimensioni (3D) ponteggi sulla differenziazione della crescita, la proliferazione neuronale e, infine, è di grande interesse al fine di trovare nuovi metodi per le terapie basate sulle cellule e standardizzati a disturbi neurologici o malattie neurodegenerative. Strutture 3D sono tenuti a fornire un ambiente molto più vicino alla situazione in vivo di culture 2D. Nel contesto della medicina rigenerativa, la combinazione di ponteggi biomateriale con staminali neurali e cellule progenitrici promette grandi come strumento terapeutico. 1-5 sistemi di cultura che emula un ambiente di tre dimensioni hanno dimostrato di influenzare la proliferazione e la differenziazione in diversi tipi di staminali e cellule progenitrici. Qui, la formazione e la funzionalizzazione del 3D-microenviroment è importante determinare la sopravvivenza e il destino delle cellule incorporato. 6-8 Qui abbiamo usato PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un peptide idrogel a base patibolo,che è ben descritto e usato per studiare l&#39;influenza di un ambiente 3D su diversi tipi di cellule. 7,11-14 PuraMatrix possono essere personalizzati in modo semplice e sintetico la realizzazione di nano-fibre fornisce una 3D-cultura sistema di alta affidabilità, che in aggiunta xeno-free. Recentemente abbiamo studiato l&#39;influenza della concentrazione di PM-sulla formazione del patibolo. 13 In questo studio le concentrazioni di PM utilizzato ha avuto un impatto diretto sulla formazione della struttura 3D, che è stato dimostrato dalla microscopia a forza atomica. Una successiva analisi della sopravvivenza e della differenziazione dei hNPCs rivelato un&#39;influenza delle concentrazioni di PM utilizzate sul destino delle cellule incorporato. Tuttavia, l&#39;analisi di sopravvivenza o la differenziazione neuronale mediante tecniche di immunofluorescenza possiede alcuni ostacoli. Per ottenere dati attendibili, si deve determinare il numero totale di celle all&#39;interno di una matrice per ottenere il numero relativo di esempio. cellule neuronali segnato da βIII-tubulina. Questi prerequisiti di una tecnica per analizzare i ponteggi in tutte le 3-Dimensioni da un microscopio confocale o una tecnica paragonabile come microscopi a fluorescenza in grado di prendere z-stack del campione. Inoltre questo tipo di analisi è estremamente tempo. Qui mostriamo un metodo per rilasciare le cellule dal 3D-scaffold per l&#39;esempio, una successiva analisi in citometria a flusso. In questo protocollo umani le cellule progenitrici neurali (hNPCs) della linea cellulare ReNcell VM (Millipore USA) sono state coltivate e differenziati in 3D ponteggi costituito da PuraMatrix (PM) o PuraMatrix integrato con laminina (PML). Nelle nostre mani un PM concentrazione dello 0,25% è stato ottimale per la coltivazione delle cellule 13, tuttavia la concentrazione potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule. 12 Le cellule rilasciato può essere utilizzato ad esempio per studi immunocitochimiche e successivamente analizzate mediante citometria a flusso. Questo accelera l&#39;analisi e more oltre, il resto i dati ottenuti su una base più larga, migliorando l&#39;affidabilità dei dati.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Qui si descrive l&#39;uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

cultivation-human-neural-progenitor-cells-3-dimensional-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.5K Views.  University of Rostock. Qui si descrive l'uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Un metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Ricerca

Bioingegneria

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipiche Collagene I test: una piattaforma malleabile per valutare Comportamento cella in un 3-dimensionale Contesto

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

Adattamento di un robot tattile in un fMRI 3T

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Acido ialuronico base di idrogel per cultura 3-dimensionale delle cellule di Glioblastoma paziente-derivato

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

Sintesi di idrogel adesivo forte, gelatina O-nitrosobenzaldeide

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...