Name: adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer at JoVE.com

Vorremmo riconoscere Bettine Gibbs per il suo aiuto tecnico.

Indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza in ogni momento durante l'esecuzione di tutte le procedure in questo protocollo. Assicurarsi che i contenitori/provette contenenti il reagente di fenolo e guanidina isotiocianato sono aperti solo in un cappuccio certificata e smaltire i rifiuti di fenolo in un contenitore designato. Utilizzare i reagenti, i suggerimenti e privo di DNasi e RNasi provette sterili.
1. coltura cellulare
<ol><li>Crescere la linea delle cellule HeLa e due sospensioni mantello cella linee cellulari di linfoma, Granta-519 e Jeko-1, in DMEM contenente 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C. Diluire le celle 01:10 e contare utilizzando un contatore di particelle14.</li>
	<li>Per l'estrazione di RNA, piastra 500.000 cellule/pozzetto in un piatto ben 6 (media di 2 mL per pozzetto). Dopo incubazione per 24 h, raccogliere RNA dalle cellule.</li>
</ol>2. estrazione del RNA
<ol><li>Raccolta delle cellule Nota: Fatta eccezione per la fase di centrifugazione, eseguire tutti i passaggi elencati in una cappa di coltura del tessuto per mantenere la sterilità.<ol>
<li>Per cellule in sospensione (Jeko-1 e Granta-519):<ol>
<li>Trasferire le cellule (insieme con 2 mL di terreno) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 1.725 x g per 5 min, aspirato i media e lasciare il pellet cellulare nella parte inferiore del tubo.</li>
			<li>Risospendere il pellet cellulare in 50 µ l di tampone fosfato salino (PBS): 1x. Aggiungere 500 µ l di reagente di isotiocianato di fenolo e guanidina monofasica a ciascun campione nel tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Mescolare bene e lasciare a temperatura ambiente (TA) per 5 min mentre invertendo il tubo del microcentrifuge ogni 1 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per le celle aderenti (HeLa):<ol>
<li>Aspirare il terreno di coltura delle cellule da ciascun pozzetto. Aggiungere 1 mL di PBS in ciascun pozzetto per lavare via i detriti.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 500 µ l di reagente di isotiocianato di fenolo e guanidina monofasica ad ogni pozzetto.</li>
			<li>Incubare per 5 minuti con dolce dondolo a RT. Trasferire in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lisi delle cellule<ol>
<li>Congelare il fenolo e guanidina isotiocianato miscela di cella a-20 ° C per 1 h. Nota: Il mix può essere lasciato a-20 ° C durante la notte o fino a quando necessario.</li>
		<li>Scongelare il fenolo e guanidina isotiocianato miscela di cella sul ghiaccio. Aggiungere 100 µ l di cloroformio al tubo del microcentrifuge in una cappa PCR. Vortexare il campione per 10-15 s fino a quando la miscela è rosa e opaco. Incubare il campione in ghiaccio (a 4 ° C) per 15 minuti.</li>
		<li>Centrifugare il campione per 15 min a 20.800 x g e a 4 ° C. Rimuovere con cautela la fase acquosa incolore superiore (~ 200 µ l) e il trasferimento ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Precipitazione di RNA<ol>
<li>Aggiungere un volume equivalente di isopropanolo per ogni campione. Aggiungere 1 µ l di coprecipitant (vedere Tabella materiali) per ogni campione per agire come un elemento portante per il RNA e aiutano a visualizzare il RNA nei passaggi successivi. Incubare il campione a-80 ° C per almeno 4 ore. Per risultati ottimali, incubare per una notte a-80 ° C.</li>
		<li>Trasferire il campione ad una centrifuga refrigerata. Centrifuga per 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; il RNA apparirà come un puntino blu sulla parte inferiore del tubo. Rimuovere con cautela l'isopropanolo dal campione. Aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% e risospendere il pellet brevemente nel Vortex per 3 s.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 20.800 x g a RT per 5 min. rimuovere tutto l'etanolo dall'esempio. Lasciate che il campione asciugare all'aria per circa 10 min. Risospendere il campione in 35 µ l di acqua RNAsi-libera. Posto su un blocco di calore (65 ° C) per 5 min garantire che il RNA è completamente in soluzione e collocare immediatamente il tubo sul ghiaccio.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di RNA totale usando uno spettrofotometro come precedentemente descritto, tranne usare 1,5 µ l del campione di RNA invece di 1 µ l15. Facoltativamente, eseguire 1 µ g di RNA totale su un gel di agarosio all'1% per determinare l'integrità del RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. trattamento dnasi
<ol><li>Dopo la quantificazione del RNA, eseguire dnasi trattamento sul RNA totale di degradare qualsiasi DNA genomic. Per ogni campione, è necessario aggiungere i seguenti reagenti dal kit di dnasi RNAsi-libera per fare una reazione totale di 20 µ l della miscela in una provetta da microcentrifuga separati:<ol>
<li>Mescolare 2 µ l di dnasi 10 X tampone di reazione con 4,4 µ g di RNA totale. Portare ad un totale di 14 µ l con acqua.</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l di dnasi RNAsi-libera. Incubare a 37 ° C per 30 min in presenza di 2 µ l di inibitore di RNAsi (dal Kit di trascrizione inversa).</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l di soluzione bloccante e calore su un blocco di calore per 10 min a 70 ° C per inattivare l'enzima dnasi. Nota: Trattamento della dnasi è facoltativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. sintesi del cDNA
Per un volume di reazione finale di 50 µ l:
<ol><li>Per un volume di reazione finale di 50 µ l: trasferimento 22 µ l della dnasi trattati RNA in un nuovo tubo, o trasferimento 4 µ g di RNA totale con aggiunta di acqua ad un volume totale di 22 µ l in una nuova provetta. Aggiungere 2 µ l di primer T7 oligo dT25 da 10 µM primer soluzione. La sequenza per il primer di T7 oligo dT25 è 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>Dal kit di trascrizione inversa aggiungere 2 µ l dell'inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 8 µ l di tampone di reazione di 5x, 4 µ l di 10 mM dNTPs e 2 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l). Nota: Impostare una reazione senza trascrittasi inversa ad agire come controllo negativo.</li>
	<li>Incubare a 42 ° C per 1 h. trasferimento direttamente al ghiaccio. Riscaldare il tubo a 75 ° C per 5 min e posizionare il tubo sul ghiaccio.</li>
</ol>5. ricerca primer per la trascrizione del Gene di fusione
<ol><li>
Disegno dell'iniettore
	<ol>
<li>Scarica la sequenza del cDNA dal browser genoma Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificare una regione all'interno del ORF della trascrizione destinazione (ANKHD1) a Monte del codone di arresto. Copiare e incollare l'intera regione (fino a 700 nucleotidi) che contengono le sequenze a Monte del codone di stop nella regione voce sequenza del software di progettazione primer (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Selezionare l'opzione di design personalizzato Visualizza e selezionare 10 per il numero degli iniettori che il sistema deve generare (risultati da restituire) e lasciare tutti gli altri parametri impostati di default.</li>
		<li>Scegliere cinque primer in avanti e due iniettori d'inversione che non si sovrappongono. Ordine di primer e ricostituire con RNAsi/dnasi-libera di acqua ad una concentrazione finale di 10 µM. Maggiori dettagli circa il disegno di primer universali per la PCR sono trattate altrove16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR per identificare potenziali primer per l'utilizzo in successive 3' gara Nota: Per determinare i primer forward finali da utilizzare nella reazione, test i primer progettati impostando combinazioni diverse di forward e reverse primer per PCR regolari in una cappa PCR.<ol>
<li>Trasferire il cDNA (2 µ l) in una provetta PCR fresca 0,5 mL. Aggiungere 1 µ l di primer in avanti e 1 µ l di primer inverso (da una soluzione di primer 10 mM). Fai fino a 12,5 µ l aggiungendo 8,5 µ l di acqua priva di nucleasi. Aggiungere 12,5 µ l di 2x Gel di PCR Master Mix.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti condizioni di ciclismo termiche PCR: 95 ° C per 2 min seguita da 29 cicli di 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min. impostare il ciclo finale a 68 ° C per 7 min.</li>
		<li>Dopo la PCR, è necessario eseguire i prodotti su un gel di agarosio 1% colorato con bromuro di etidio. Dettagli dell'elettroforesi sono come precedentemente descritto con poche modifiche17.<ol>
<li>Sciogliere 1 g di agarosio in 100 mL di tampone Tris-acetato (TAE) in un pallone da 250 mL. Fate bollire in un forno a microonde.</li>
			<li>Lasciare raffreddare per 1 min e aggiungere 7,5 µ l di soluzione di bromuro di etidio (10 mg/mL di brodo) in una cappa aspirante. Miscelare bene agitando la beuta e versare in un apparato di gel orizzontale. Lasciare la RT nella cappa fumi per almeno 30 minuti consentire il gel a solidificare.</li>
			<li>Coprire il gel con 1 tampone di x TAE e caricare 10 µ l di prodotto PCR su gel di agarosio insieme a 3-5 µ l della scala di peso molecolare di DNA. Eseguire a 175 V per 10 min. visualizzare i prodotti che utilizzano un dispositivo di imaging e se è necessaria una ulteriore separazione di prodotti, eseguire il gel per altri 5-10 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezione degli iniettori annidati per 3' gara
	<ol>
<li>Analizzare i risultati del gel dell'agarosi PCR per selezionare gli iniettori che hanno una banda PCR distinta, forte e unica. Utilizzare il primer 5'-la maggior parte (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') insieme con il primer di25 T7 oligodT nella PCR prima eseguire.</li>
		<li>Selezionare il primer nidificato che si trova a valle del primo iniettore (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') e utilizzarlo con il primer di T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') nel secondo set di reazioni di PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ottimizzazione del 3' gara per mappare il regione 3' UTR utilizzando due diversi enzimi
Nota: C'è stato un aumento nella diversità delle polimerasi del DNA usato per la PCR; Pertanto, abbiamo voluto determinare condizioni standard che possono essere applicate anche quando si utilizzano diversi enzimi per 3' reazioni di PCR di gara. Iniettori d'inversione per qualsiasi trascrizione vengono mantenuti costanti; le uniche modifiche sono nei primer forward nidificati che sono specifici per la trascrizione di destinazione.
<ol><li>
Protocollo 1:3 ' gara utilizzando una DNA polimerasi modificata da Pyrococcus furiosus (Pfu)
	<ol>
<li>Prima PCR<ol>
<li>Trasferire 1 µ l di cDNA in una provetta PCR e aggiungere 5 µ l di tampone di reazione Pfu x 10. Aggiungere 1 µ l di primo iniettore avanti nidificato, 1 µ l di primer T7 oligodT25 e 1 µ l di dNTP (da una soluzione di 10 mM).</li>
			<li>Fai fino a 49 µ l di volume totale aggiungendo 40 µ l di acqua. Aggiungere 1 µ l di Pfu DNA polimerasi e mescolare bene. Eseguire la PCR utilizzando il profilo PCR nella tabella 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Seconda PCR<ol>
<li>Trasferire 2 µ l dei prodotti di PCR prima ad un nuovo tubo PCR e mescolare con 5 µ l di tampone di reazione di Ultra II di Pfux 10. Aggiungere 1 µ l di primer PCR annidato secondo, 1 µ l di primer T7 e 1 µ l di dNTP (soluzione di 10 mM).</li>
			<li>Fai fino a 49 µ l di reazione totale aggiungendo 39 µ l di acqua. Aggiungere 1 µ l di Pfu DNA polimerasi. Eseguire la PCR utilizzando lo stesso profilo PCR come la prima installazione PCR (tabella 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocollo 2:3 ' gara utilizzando una DNA polimerasi chimerica costituito da un dominio di legame del DNA fuso a un Pyrococcus-come correzione di bozze mix master di polimerasi PCR
	<ol>
<li>Prima PCR<ol>
<li>Trasferire 1 µ l di cDNA in una provetta PCR. Aggiungere 1 µ l di primo iniettore nidificato in avanti e 1 µ l di primer T7 oligodT25 . Fai fino a 25 µ l aggiungendo 22 µ l di acqua.</li>
			<li>Aggiungere 25 µ l di Master Mix PCR: 2x e mescolare bene. Utilizzare la PCR ciclismo condizioni descritte nella tabella 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Seconda PCR<ol>
<li>Trasferire 2 µ l dei prodotti di PCR prima ad un nuovo tubo PCR. Aggiungere 1 µ l di primer PCR nidificati secondo insieme con 1 µ l di primer reverse T7.</li>
			<li>Fai fino a 25 µ l aggiungendo 22 µ l di acqua. Aggiungere 25 µ l di 2x PCR Master Mix. Eseguire la PCR utilizzando lo stesso profilo PCR come la prima installazione PCR (tabella 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. verificare il secondo prodotto PCR di 3' gara.
<ol><li>Prendere 5-10 µ l di prodotto di PCR secondo (come prodotto dal primo turno di PCRs se la trascrizione è abbondantemente espresso) ed eseguire su un gel di agarosio. Impostare il gel ed eseguire l'elettroforesi come descritto in precedenza (passaggi 5.2.3.1 a 5.2.3.3). Visualizzare i risultati su un dispositivo di imaging.</li>
</ol>8. sequenziamento e purificazione del prodotto
<ol><li>Purificare i prodotti PCR di gel dalla seconda PCR usando il Gel e sistema di Clean-Up di PCR frammento del DNA secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Eseguire Sanger sequenziamento (in alternativa, inviare il gel purificata campioni di prodotto PCR e primer di sequenziamento appropriato ad un laboratorio di sequenziamento). Analizzare i dati di sequenziamento dopo Sanger sequenziamento.</li>
	<li>Scarica il software di analisi di sequenza (Vedi Tabella materiali) e importare i file di traccia nel software. Utilizzare il QVs individuali di Base pura (valori di qualità) per ottenere la Base chiamata informazioni18. Scarica il cromatogramma con tracce di alta qualità per la visualizzazione. Facoltativo: Il gel prodotto purificato può essere clonato utilizzando un apposito kit di clonazione e i cloni isolati inviati per Sanger sequenziamento.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nonostante l'avvento delle tecnologie di sequenziamento massivo parallelo, su una base di gene di gene, 3' gara rimane ancora il metodo più facile ed economico per identificare la PAS e nucleotidi adiacenti per la coda di poli (a). L'adattamento qui descritto si espande con 3' gara per amplificare sia mappa sequenze che includono una parte di ORF, il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR della trascrizione del mRNA di ANKHD1 . Dei principali vantaggi di 3' gara è che con pochi piccoli adattamenti, prodot...

La formazione dell'estremità 3' è un passo fondamentale nella maturazione di mRNA che comprende il clivaggio del pre-mRNA a valle di un PAS seguita dall'aggiunta di ~ 250 tipo adenine, che compongono la coda di poli (a)1,2. La proteina legante il poli (a) (PABP) si lega alla coda di poli (a), e questo protegge la trascrizione di mRNA da degradazione e facilita la traduzione1.
Le stime attuali suggeriscono che il 70% dei geni umani hanno passaggio multiplo e quindi sono sottoposti ad poliadenilazione alternativa, con conseguente più 3' estremità3. Pertanto, è importante identificare dove la coda di poli (a) si attacca al resto del 3' UTR, nonché a identificare il PAS utilizzato da qualsiasi trascrizione dato. L'avvento di sequenziatori di ultima generazione ha provocato l'identificazione simultanea del 3' UTR e il passaggio di migliaia di geni. Questo aumento della capacità di sequenziamento ha richiesto lo sviluppo di algoritmi bioinformatici per analizzare i dati che coinvolgono poliadenilazione alternativa dell'estremità 3'. Per l'individuazione del de novo o la convalida della PAS e quindi mapping dell'estremità 3' dei singoli geni da dati di sequenziamento su larga scala, 3' gara rimane il metodo di scelta4,5. Le sequenze incluse nei prodotti di cDNA di 3' gara normalmente includono solo una parte del 3' UTR che contiene la coda di poli (a), il luogo di fenditura, la PAS e le sequenze a Monte della PAS. A differenza di PCR, che richiede la progettazione e la scelta del gene specifico primer forward e reverse, 3' gara richiede solo due primers gene nidificati specifici in avanti. Quindi, la PCR richiede una conoscenza più dettagliata della sequenza del nucleotide di una grande regione del gene di essere amplificato4,6. Dato che 3' gara utilizza lo stesso reverse primer che obiettivi il poli (a) di coda per tutte le trascrizioni di poliadenilazione RNA, solo i primer in avanti devono essere gene specifico, così, solo che richiedono la conoscenza di una regione significativamente più piccola del mRNA. In questo modo l'amplificazione delle regioni in cui le sequenze non sono completamente caratterizzato4,7. Questo ha permesso 3' gara per essere utilizzato non solo per determinare l'estremità 3' del gene, ma a anche determinare e caratterizzare grandi regioni a Monte della PAS che formano una parte significativa del 3' UTR. Combinando 5' corsa con modificate 3' gara che comprende porzioni più grandi di 3' UTR e regioni fiancheggianti, è possibile completamente di sequenza o clonare un'intero trascrizione di mRNA dall'estremità 5' alla sua 3' estremità8.
Un esempio di questa applicazione di modificate 3' gara è la recente identificazione di un romanzo di trascrizione del gene CCND1-MRCK fusione da linee cellulari di linfoma a cellule mantellari e malati di cancro. 3' UTR ha consistito di sequenze di geni MRCK sia il CCND1 ed era ricalcitrante a miRNA regolamento9. I due nidificati CCND1 avanti primers specifici erano complementari alla regione immediatamente adiacente e a valle del codone di arresto di CCND1 . Anche se l'intero trascrittoma sequenziazione insieme strumenti bioinformatici specifico può essere utilizzato per rilevare le fusioni del gene entro i 3' UTR10, molti laboratori potrebbero mancare le risorse finanziarie o perizia di bioinformatica per fare uso di questa tecnologia. Quindi, 3' gara è un'alternativa per de novo identificazione e validazione di geni di fusione romanzo che coinvolge il regione 3' UTR. Considerando il drastico aumento del numero di geni di fusione segnalati nonché a leggere attraverso le trascrizioni, 3' gara è diventata un potente strumento nella caratterizzazione genica sequenze11,12. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che diverse sequenze all'interno di 3' UTR, nonché la lunghezza del 3' UTR può influenzare la stabilità di trascrizione mRNA, la localizzazione, la traducibilità e funzione13. Dovuto in parte a un crescente interesse nella mappatura del transcriptome, c'è stato un aumento del numero di differenti polimerasi del DNA in fase di sviluppo per l'utilizzo in laboratorio. È importante determinare quali tipi di modifiche possono essere reso a 3' protocollo di gara in ordine di utilizzare il repertorio disponibile di polimerasi del DNA.
Questo lavoro rapporti adattandosi 3' gara per mappare l'intero regione 3' UTR, la PAS e il sito di clivaggio estremità 3' della trascrizione ANKHD1 utilizzando nidificati Primer all'interno della sezione di ANKHD1 della trascrizione e due diversi DNA polimerasi.

<table><tbody><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervical cancer cell line.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Granta-519 cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal bovine serum for cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic and antimycotic.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease Free-Water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&amp;nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&amp;nbsp; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment kit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Used for&amp;nbsp; reverse transcription of mRNA into&amp;nbsp; cDNA synthesis. Kit includes&amp;nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect size 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrophotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&amp;nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Power supply for gel electrophoresis.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&amp;nbsp; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood dedicated to PCR work.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Fume hood.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&amp;nbsp;Particle&amp;nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Particle counter. For counting cells before plating&amp;nbsp; for RNA extraction.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td></tr></tbody></table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

Maturazione degli mRNA eucariotico coinvolge 3' fine formazione, che prevede l'aggiunta di una coda di poli (a). Al fine di mappare il 3' estremità di un gene, il tradizionale metodo di scelta è 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara). Protocolli per 3' gara richiedono l'attenta progettazione e selezione degli iniettori annidati all'interno di regione 3' non tradotta (3' UTR) del gene target di interesse. Tuttavia, con alcune modifiche il protocollo può essere utilizzato per includere l'intera regione 3' UTR e sequenze all'interno l'open reading frame (ORF), fornendo un quadro più completo del rapporto tra l'ORF e 3' UTR. Ciò è oltre alla identificazione del segnale poliadenilazione (PAS), così come il sito di clivaggio e poliadenilazione fornito dai convenzionali 3' gara. Espanso 3' gara in grado di rilevare insolito 3' UTR, tra cui fusioni del gene all'interno di 3' UTR, e le informazioni di sequenza possono essere utilizzate per prevedere i potenziali siti di legame di miRNA così come AU ricca destabilizzare gli elementi che possono influenzare la stabilità della trascrizione.

Ricerca nidificata Forward Primer:
Il gel di agarosio da La figura 1 Mostra due distinti prodotti di gel PCR (corsie 1 e 2) che utilizzano lo stesso forward primer ma diversi iniettori d'inversione. Lane 3 ha un prodotto PCR distinto e ha un distinto primer forward e reverse. I primer ideali da utilizzare per la reazione di PCR di base sono quelli che danno un prodotto di PCR distinto ...

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Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

I due diversi 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara) protocolli descritto qui fanno uso di due diversi DNA polimerasi per mappare sequenze che includono un segmento dell'open reading frame (ORF), il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR di una trascrizione usando RNA ottenute da linee cellulari tumorali differenti.

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

12.3K Views.  Butler University. I due diversi 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara) protocolli descritto qui fanno uso di due diversi DNA polimerasi per mappare sequenze che includono un segmento dell'open reading frame (ORF), il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR di una trascrizione usando RNA ottenute da linee cellulari tumorali differenti.

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Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

L&#39;analisi del trascrittoma di singole cellule

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Neuroscienze

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Mappatura delle relazioni struttura-funzione dei fattori di trascrizione oncogenica disordinati utilizzando l'analisi trascrittomica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologia

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Medicina

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Rapid Amplification of cDNA Ends

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3 
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research 
2Department of Cell and Tissue Biology,&#160; 
3Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA&#160; &#160;&#160;
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique that allows amplification of full-length cDNA from mRNA by extending to the 3&#8217; or 5&#8217; end, even without prior knowledge of the sequence (Frohman et al., 1988). In contrast to regular PCR, it uses only one specific PCR primer and a second non-specific primer that will indiscriminately bind to most mRNAs. Depending on whether the area to be amplified is on the 3&#8217; or 5&#8217; end of the mRNA, the second primer is chosen to bind the polyA tail (3&#8217; end) or a synthetic linker added to all transcripts (5&#8217; end). These primer combinations are known to yield &#8220;one-sided&#8221; or &#8220;anchored&#8221; PCR due to PCR amplification using the known sequence of one side- 3&#8217; or 5&#8217;(Ohara et al., 1989). The approach allows the capture of gene-specific rare mRNAs that otherwise would be hard to detect, e.g. because of their relatively low expression or unknown complete sequence (Frohman et al., 1988).
RACE is initiated with a reverse transcription step (RT) to synthetize single stranded complimentary DNA (cDNA) from mRNA. This is followed by two consecutive PCRs that amplify the cDNA fragments from a gene of interest. To perform RACE, the sequence of the gene of interest must be at least partially known, as it is needed to design the gene-specific primers (GSPs; Frohman, 1994; Liu and Gorovsky, 1993). As the second primer pair is a generic primer that will anneal to all transcripts present in the sample, the specificity of the PCR reactions is reduced. RACE is therefore ideally performed with two nested PCRs to lower the chances of amplifying non-specific transcripts (Figure 1). Depending on the direction of amplification relative to the GSP, the technique is categorized as 5&#8217; or 3&#8217; RACE (Figure 1).&#160;
3&#8217; RACE (Figure 1A) takes advantage of the poly(A) tail present in mRNAs as a generic binding site for the non-specific primer. This simplifies the technique, as one can synthetize cDNA by using oligo (dT) primers. GSPs are located in the 5&#8217; region of the transcripts. This RACE variant allows the detection of transcript variants and different 3&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5&#8217; RACE (Figure 1B), GSPs are located in the 3&#8217; region of the gene. To be able to use a non-specific primer that binds to all transcripts, an adapter that serves as generic primer binding site is attached to the 5&#8217; RNA ends. To attach the adapter to the mRNA, the 5&#8217; cap that protects mRNAs against exonucleases and promotes translation must be removed (Bird et al., 2016). Opposed to 3&#8217; RACE, 5&#8217; RACE helps finding differential 5&#8217; splice variants and alternative 5&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007b).
Here we will perform 3&#8217; RACE to identify and isolate different transcript variants using the known 5&#8217; sequence (Figure 2A) encoded by the Drosophila dSmad2 (Smox) gene. dSmad2, a fly Smad protein, is an important transducer of Activin-&#946; signaling, a pathway of the TGF-&#946; superfamily. dSmad2 regulates multiple cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis and differentiation (Upadhyay et al., 2017). As differentially spliced transcripts of dSmad2 may have different functions in the adult fly, a first step in exploring these potential functions is to assess all transcript variants of dSmad2 at this developmental stage.

Amplificazione rapida delle estremità del cDNA

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
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