ATAC-seq ci consente di identificare lo stato delle regioni aperte della cromatina nel genoma, che è spesso alterato negli stati di malattia rispetto alla condizione normale. Meno input cellulare, un protocollo semplificato di digestione Tn5, seguito dall'isolamento del DNA frammentato e dalla preparazione della libreria mediante amplificazione PCR e tempi sperimentali più brevi la rendono una tecnica più vantaggiosa. Il confronto del paesaggio epigenetico alterato da ATAC-seq tra condizioni normali e patologiche può far luce sugli elementi regolatori della cromatina associati alla malattia ed essere utile per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.
Questa tecnica è facile da eseguire, in quanto non include passaggi sperimentali critici. Per ottenere risultati ATAC-seq di successo, sono necessari solo un paio di passaggi di standardizzazione. Per iniziare, trasferire 25 microlitri da una sospensione cellulare contenente un milione di cellule per millilitro in PBS a un tubo di microcentrifuga da 1,7 millilitri e centrifugare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare con attenzione il surnatante e aggiungere 25 microlitri di tampone di lisi. Risospendere le cellule facendo pipettare delicatamente su e giù e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare con cura il surnatante.
Risospendere immediatamente il pellet in 25 microlitri di miscela di reazione Tn5 e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare la soluzione ogni 10 minuti. Aggiungere cinque microlitri di acetato di sodio a 3 molari e 125 microlitri di tampone PB alla soluzione di DNA marcata Tn5.
Mescolare bene. Quindi, posizionare la colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 2 millilitri e applicare il campione alla colonna di rotazione. Centrifugare a 17, 900 g per un minuto a temperatura ambiente e scartare il flusso attraverso.
Aggiungere il buffer PE alla colonna e ruotare la colonna. Riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta e centrifugarla per cinque minuti per asciugare completamente la membrana. Scartare il flusso e posizionare la colonna di rotazione in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,7 millilitri.
Eluire i frammenti di DNA con 10 microlitri di tampone EB e lasciare riposare la colonna per un minuto a temperatura ambiente. Quindi centrifugare a 17.900 G per un minuto a temperatura ambiente per eluire il DNA. Impostare la reazione PCR in provette PCR da 200 microlitri ed eseguire il programma di amplificazione PCR parte uno.
Per la QPCR in tempo reale, preparare la miscela di reazione PCR aggiungendo cinque microlitri di prodotto PCR, 0,75 microlitri di SYBR Gold 1.000 volte diluito, cinque microlitri di 2X PCR Master Mix e 3,75 microlitri di acqua priva di nucleasi. Determinare il numero richiesto di cicli PCR aggiuntivi utilizzando i parametri di esecuzione. Una volta determinato il numero del ciclo, impostare le PCR con i cicli aggiuntivi calcolati in precedenza.
Ai prodotti PCR amplificati, aggiungere 150 microlitri di perline e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per cinque minuti e rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare le perle con 200 microlitri di etanolo all'80% e rimuovere il surnatante.
Rimuovere completamente l'etanolo e asciugare all'aria i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, risospendere con 50 microlitri di tampone di eluizione. Posizionare il tubo su un supporto magnetico, quindi trasferire l'eluato in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri.
Un confronto dell'efficienza della lisi cellulare usando il blu di tripano è mostrato qui. Le cellule NMuMG sono state trattate con un tampone ipotonico e tampone CSK e colorate con blu tripano. Una maggiore efficienza di lisi cellulare è stata osservata nelle cellule trattate con CSK.
Le librerie ATAC-seq sono state preparate da cellule di cancro al seno MDA-MB-231. Dopo l'amplificazione della PCR, i prodotti PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio 0,5X TBE, 1,5% prima e dopo la purificazione delle perline. I primer vengono per lo più rimossi dalla purificazione iniziale delle perline.
Sono inoltre indicati i pattern delle bande di DNA da 1X TAE 1% elettroforesi su gel di agarosio e un'elettroforesi automatizzata. SYBR Gold è stato utilizzato per visualizzare i frammenti di DNA mostrati qui. Una traccia del browser del genoma che mostra il locus ERS1 è presentata qui.
La copertura del genoma dei dati ATAC-seq nelle cellule T47D è mostrata in questa immagine. Sono stati utilizzati primer di una precedente pubblicazione e le loro regioni target sono evidenziate in giallo. Qui è mostrato un grafico a barre che illustra l'arricchimento dell'amplicone del primer nelle librerie ATAC-seq.
Le librerie ATAC-seq sono state preparate dal buffer ipotonico o da un buffer CSK. L'immagine rappresentativa mostra la visualizzazione del browser del genoma per l'ottimizzazione ATAC-seq. I dati ATAC-seq della condizione di input di 25.000 cellule hanno mostrato il più alto arricchimento di frammenti privi di nucleosomi, mentre la condizione di input di 100.000 cellule ha presentato il DNA mononucleosomiale più alto.
Qui vengono presentate le tracce del browser del genoma che mostrano i dati ATAC-seq di diversi numeri di cella. L'analisi delle annotazioni di picco HOMER è rappresentata in questa immagine rappresentativa. HOMER ha classificato ogni picco come un promotore prossimale o distale picco.
Il numero di input cellulare scelto del tampone di lisi cellulare e la concentrazione dell'enzima Tn5 dipendente dal tipo di cellula sono il parametro più critico che deve essere standardizzato. Tn5 fuso con la proteina A nella tecnica cut-and-tack è ampiamente utilizzato per identificare il sito di legame del DNA per una proteina di interesse utilizzando anticorpi specifici per quella proteina di interesse.
