Piscina progettazione e oligo recupero <ol><li> Il primo passo è quello di progettare il pre-mRNA piscina da studiare. Questo può essere fatto utilizzando il browser UCSC Genome e il download di particolari geni, giunzioni di splicing, o altre aree di interesse. </li><li> Una volta che le finestre di interesse sono stati selezionati, attraverso le piastrelle computazionalmente con le seguenti: lunghezza leggere dovrebbe essere di 30 nucleotidi con un 10 sovrapposizione nucleotide, quindi ogni oligo è spostato dal 20 nucleotidi prima uno. * Sovrapposizione Oligo deve essere aumentata in prossimità di siti di splicing per assicurare un&#39;adeguata copertura, aumentando la sovrapposizione 10-20 nucleotidi può realizzare questo. </li><li> Fianco ogni 30 oligo-nucleotidi con sequenze primer universale, che verrà utilizzato per amplificare la valle piscina. Piastrelle ordini oligo devono essere presentate alla Agilent, dove le sequenze verrà stampato su un oligonucleotide microarray su ordinazione. </li><li> Per recuperare il DNA oligo dalla superficie del microarray di iniziare a collocarlo nella diapositiva copertura matrice in una camera di ibridazione di array e delicatamente pipettaggio 500 ml di dH 2 O sul vetrino </li><li> Panino della matrice su parte superiore della diapositiva copertura, avendo cura di evitare bolle d&#39;aria che possono interferire con il processo. Assicurarsi di posizionare il volto serie giù in modo che il lato con l&#39;oligo sta toccando la superficie dell&#39;acqua. Una buona regola è &quot;Agilent tocca Agilent&quot;, che significa che l&#39;etichetta Agilent sulla matrice si affaccia l&#39;etichetta Agilent sul vetrino di copertura </li><li> Chiudere la camera di ibridazione e ruotare la notte a 99 ° C in un fornetto </li><li> Il giorno seguente, rimuovere con attenzione l&#39;array dalla camera e di erogare l&#39;acqua, che ora contiene le oligo liberato dalla superficie dell&#39;array. Questa è la piscina oligo </li><li> Posizionare la piscina in una provetta 1,5 ml Eppendorf e sonicare la piscina al 50% di ampiezza per 3-5 impulsi secondo </li><li> Successivamente, amplificare la vasca di ciclo PCR bassa, utilizzando il primer universale con un tag T7 aggiunto alla fine. Per il primo turno, denaturare a 94 ° C per 1 minuto, annealing a 55 ° C per 20 secondi, e allungare per 1 minuto a 72 ° C. Per i turni successivi, fare 10 secondi, 20 secondi e 10 secondi a ciascuna temperatura rispettivamente, con un passo allungamento finale di 5 minuti a 72 ° C. Poiché il numero di cicli necessari per amplificare la piscina dipende l&#39;efficienza di recupero oligo, può essere necessario per cercare i numeri ciclo multipli. Fare attenzione a non a un eccesso di amplificare la piscina, che è significata da una banda spalmato su un gel di acrilammide. Campioni di PCR amplificato può essere conservato a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> La fase finale in preparazione oligo è quello di trascrivere l&#39;RNA utilizzando il kit MEGAshortscript ™ da Ambion. * Il seguente protocollo è stato adattato da Ambion <ol class="lalpha"><li> Scongelare il tampone di reazione 10x T7, quattro soluzioni ribonucleotide e acqua a temperatura ambiente, mantenendo la miscela enzimatica T7 su ghiaccio </li><li> Montare la miscela di reazione in un RNasi-free provetta a temperatura ambiente. Componenti del tampone di reazione può causare DNA stampo per precipitare se la reazione è mista su ghiaccio. </li><li> Nel seguente ordine, pipetta 3 ml acqua priva di nucleasi, 2 l di buffer di reazione 10x, 2 ml di soluzione ogni 75 mm NTP, 5 ml di DNA stampo (la piscina oligo amplificato PCR) e 2 ml di T7 enzima, per un volume finale di 20 l </li><li> Flick il tubo delicatamente per mescolare la reazione poi brevemente microcentrifuga per raccogliere il composto sul fondo della provetta. </li><li> Incubare la reazione in un termociclatore a 37 ° C per 2 ore. Tempo di incubazione sarà modello-dipendente, per cui può essere necessario utilizzare un time-corso esperimento per determinare il tempo ottimale di incubazione per la resa massima </li><li> Dopo 2 ore, rimuovere il DNA stampo con l&#39;aggiunta di 1 ml di DNasi Turbo alla reazione e incubare a 37 ° C per altri 15 minuti </li><li> Terminare la reazione e recuperare l&#39;RNA per estrazione fenolo / cloroformio e precipitazione in etanolo. <ol class="lalpha"><li> Per un volume di reazione di 20 microlitri, aggiungere 115 ml di dH 2 O e 15 ml di acetato di sodio 3 M per la reazione. </li><li> Mescolare accuratamente, quindi aggiungere 75 ml di acido fenolo e 75 microlitri di cloroformio. Mescolare la soluzione con il vortex, poi microcentrifuga per un minuto a 13.000 giri al minuto a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e ripetere l&#39;estrazione </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 150 ml di cloroformio. Vortex il composto e centrifuga come prima. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. </li></ol></li><li> Recuperare l&#39;RNA con l&#39;aggiunta di due volumi del 100% di etanolo freddo per lo strato acquoso e mescolando bene. Freddo la miscela per un minimo di 15 minuti a -20 ° C quindi si centrifuga a 4 ° C per 15 minuti alla massima velocità per far sedimentare l&#39;RNA. Rimuovere con cura il supernatante e risospendere il pellet in 105 ml di 0.1x Tris-EDTA (TE) Buffer .. </li></ol></li><li> E &#39;difficile rimuovere tutti i nucleotidi liberi dalla reazione Kit T7, quindi per i risultati più accurati, quantificare l&#39;RNA utilizzando RiboGreen. <ol class="lalpha"><li> Per iniziare la quantificazione, in primo luogo diluire abbastanza 1x TE, 2.300 microlitri + 50μL/sample. </li><li> Quindi, rendere il RiboGreen. Avrete bisogno di 1000 ml + 50 microlitri / campione. Per i campioni di alta gamma (1 mg / ml a 20 ng / ml) mescolare il 1:200 RiboGreen in 1x TE, per i campioni di gamma bassa (50 ng / mL a 1 ng / ml) mescolare il 1:2000 RiboGreen in 1x TE ; Pipettare 50 ml di soluzione RiboGreen in ciascun pozzetto di una piastra opaca, a partire da A1 e in movimento verso il basso, e non tra </li><li> Diluire una soluzione madre di RNA a 2 mg / ml per i campioni di alta gamma o 100 ng / mL per i campioni gamma bassa </li><li> Utilizzando le soluzioni stock, creare una curva standard da sei successive diluizioni 1:02 dell&#39;originale 2 mg / ml o 100 ng / mL magazzino; Pipettare 240 l di stock in un tubo striscia di PCR. Nei restanti 7 tubi, pipetta 120 ml di TE 1x. Prendete 120 microlitri dal ceppo RNA bene, e mescolare con tubo 2. Prendete 120 microlitri da provetta 2 e miscelare con tubo 3. Ripetere l&#39;operazione fino tubo 7. Tubo 8 avrà solo TE e sarà il vostro vuoto. Pipettare 50 ml di soluzioni curva standard nella piastra opaca, A1: H2 (eseguire la curva due volte) </li><li> In un nuovo tubo, mescolare 45 ml di TE con 5 ml di piscina oligo e aggiungere tutti i 50 microlitri di un pozzo che contiene 50 ml di RiboGreen. </li><li> Utilizzando un lettore di piastre impostare la macchina per leggere la fluorescenza dall&#39;alto dopo un minuto di mescolare con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 485 nm e lunghezza d&#39;onda di emissione di 530 nm e leggere la piastra </li><li> Utilizzare la curva standard generato per quantificare l&#39;RNA recuperato, che devono essere conservati a -20 ° C. </li></ol></li></ol> Co-immunoprecipitazione della piscina oligo con un RNP di interesse <ol><li> Prima di iniziare la co-immunoprecipitazione, preparare la proteina A e proteina G Dynabeads da Invitrogen mescolando in un rapporto di 1:1 fino ad un volume finale di 50 microlitri per reazione. Ad esempio, per due reazioni si dovrebbe aggiungere 50 microlitri di ciascun ciascuna sfera. </li><li> Utilizzare un supporto magnetico di separazione come questo da Novagen per tenere le sfere in posizione mentre si rimuove il supernatante e lavare le perle due volte con un uguale volume di freddo 1x PBS </li><li> Dopo il secondo lavaggio, risospendere le sfere in un volume uguale di freddo 1x PBS e aggiungere 2 ng degli anticorpi per reazione. Tale importo può variare a seconda dell&#39;anticorpo, così la sperimentazione è necessario trovare le condizioni ottimali. </li><li> Incubare l&#39;anticorpo / tallone miscela notte a 4 ° C su una piattaforma rotante </li><li> Al mattino, aggiungere 2 mg per reazione di RNA totale sonicato lievito per bloccare legame non specifico, e ruotare per altri 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Utilizzando il sostegno magnetico per tenere le perline, rimuovere il supernatante e lavare le perle due volte con PBS freddo 1x, lasciando la PBS dal secondo lavaggio nel tubo. </li><li> Estrarre nuovi tubi, uno per ogni reazione e aliquota 50 microlitri della miscela tallone in ciascuna provetta. Lasciate le perline sedersi mentre si prepara una master mix </li><li> Per ogni reazione di aggiungere 200 ng del pool di oligo, un rapporto equimolare di primer di protezione, 2 mg di RNA totale sonicato lievito, 20 ml di estratto di HeLa nucleare (questa è la fonte RNP), ed E tampone per portare il volume fino a 120 microlitri. Il primer di protezione sono le versioni di RNA del primer universale. Modelli ordine trascrizione del primer universale con un tag T7 aggiunto alla fine, poi trascrivere RNA da i modelli utilizzando il kit MEGAshortscript ™. </li><li> Eliminare il surnatante dal aliquote tallone e perline risospendere in 120 microlitri della master mix. Rock the reazioni a 4 ° C per 1-2 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, per ogni reazione, rimuovere una piccola aliquota (tra cui le perle) per un campione &quot;totale&quot; RNA </li><li> Mettere il resto delle reazioni sulla separazione magnetica riposare e rimuovere il surnatante. Anche se non è necessario analizzare questo flow-through a valle del campione, può essere utile per salvare. </li><li> Lavare le perle 1-2 volte con 50 ml di freddo 1x PBS. L&#39;RNA legato l&#39;anticorpo sulle perle è il campione &quot;IP&quot;. </li><li> Risospendere il &quot;totale&quot; e la &quot;IP&quot; perle in 50 ml di 1% SDS a tampone 0,1 x TE e riscaldare i campioni a 65 ° C per 15 minuti per eluire l&#39;RNA. </li><li> Rimuovere il surnatante, che ora contiene l&#39;RNA che è stato precedentemente legato ai talloni e pulire per estrazione fenolo / cloroformio seguita da una precipitazione in etanolo. Asciugare il pellet e risospendere in 50 microlitri di buffer TE 0.1x. </li></ol> Trascrizione inversa e l&#39;amplificazione di co-IP campioni in preparazione per l&#39;etichettatura aminoallyl <ol><li> Successivamente, i campioni di RNA deve essere trascrizione inversa e PCR amplificato. Per la reazione di trascrizione inversa, utilizzare il primer reverse universale. </li><li> Per ogni campione, inizia mescolando 1 ml diil primer reverse universale, con 1 ml di modello di RNA (dalla reazione immunoprecipitazione) e 10 ml di dH 2 O. Calore le reazioni a 70 ° C per 5 minuti poi raffreddare sul ghiaccio o mantenere a 4 ° C. </li><li> Mentre i campioni raffreddare, portare il mix successivo master. Per ogni reazione di combinare 4 ml di 10 mM dNTPs, 2 ml di tampone 10x Arrayscript, 1 inibitore microlitri RNasi, enzimi e 1 microlitri trascrizione inversa. Mescolare bene e aggiungere 8 ml di mix master per ogni reazione di trascrizione inversa. </li><li> Utilizzare una macchina di PCR per incubare i campioni a 42 ° C per 2 ore, seguita da 95 ° C per 5 minuti, poi 4 ° C fino a quando i campioni sono necessari per l&#39;amplificazione. </li><li> Dopo la trascrizione inversa campioni di RNA, PCR li amplificano utilizzando il primer universale, con uno dei primer contenente un tag T7. Il numero di cicli necessari per amplificare la piscina dipende l&#39;efficienza del co-IP quindi potrebbe essere necessario provare più cicli. Ogni reazione richiede 5 ml di tampone di reazione 10X Taq, 0,2 ml di ogni primer (100 mm), 1 l di modello di cDNA (dalla reazione di trascrizione inversa), 1 ml di 10 mM dNTPs, 42,2 ml di dH 2 O, e 0,4 l di enzima Taq. Iniziare la PCR incubando i campioni a 94 ° C per 3 minuti. Successivamente, per ogni ciclo di snaturare, a 94 ° C per 45 secondi, annealing a 55 ° C per 30 secondi, e allungare a 72 ° C per un minuto, con un allungamento finale a 72 ° C per 10 minuti. </li><li> Successivamente, trascrivere i campioni di nuovo utilizzando il kit MEGAshortscript ™, però, questa volta aggiungere 2 l di aminoallyl UTP, al posto del UTP T7. L&#39;UTP aminoallyl saranno utilizzati per etichettare l&#39;RNA con i coloranti Cy. </li><li> Fenolo / cloroformio ed etanolo precipitare i campioni. NON utilizzare Glycoblue o acetato di ammonio, entrambi i quali possono interferire con l&#39;ibridazione dei campioni alla matrice. Asciugare il pellet e risospendere in 4,5 l di carbonato di sodio 0,1 M. </li></ol> Amino-allil etichettatura di RNA con coloranti Cy <ol><li> Per iniziare il protocollo di etichettatura sciogliere ciascuna delle tinture fluorescenti, Cy3 e Cy5, in 45 ml di DMSO. Per evitare la luce, avvolgere i tubi in foglio di alluminio e conservare a -20 ° C al buio </li><li> Aggiungere 2,5 l di acqua priva di nucleasi a RNA campioni e mescolare accuratamente </li><li> Successivamente, aggiungere 3 ml di Cy3 al campione &quot;totale&quot;, e 3 ml di Cy5 al campione &quot;IP&quot;. Incubare i campioni al buio per 1 ora a temperatura ambiente; Il Cy-3 del campione diventa rosso o rosa, mentre il Cy-5 diventerà blu. </li><li> Per terminare la reazione, aggiungere 6 uL di 4 M idrossilammina-HCl per ogni campione, mescolare bene e far girare brevemente. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Purificare i campioni etichettati per estrazione fenolo / cloroformio seguita da etanolo precipitazioni e risospendere pellet in 50 ml di 0,1 x TE </li></ol> Ibridare i campioni del microarray utilizzando il kit Array Agilent ibridazione <ol><li> Iniziare l&#39;ibridazione con delicatezza mescolando 50 ml di tampone di bloccaggio 10x, 140 ml di nucleasi-free H2 O, 25 microlitri della Cy3 marcato piscina &quot;totale&quot;, 25 microlitri della piscina-Cy5 etichettato &quot;IP&quot;, 10 microlitri della frammentazione tampone 25x e 250 ml di buffer di ibridazione 2x, avendo cura di evitare l&#39;introduzione di bolle. Microcentrifuga il campione leggermente per raccogliere la soluzione sul fondo del tubo e anche per ridurre le bolle. </li><li> Posizionare l&#39;O-ring far scivolare il coperchio della camera di ibridazione e con attenzione pipetta la soluzione sul vetrino. </li><li> Posizionare la matrice di rilevamento sulla parte superiore della diapositiva copertura a &quot;sandwich&quot; la soluzione. Ricordate di orientare la diapositiva array in modo che l&#39;etichetta Agilent sulla matrice volti l&#39;etichetta Agilent sul vetrino di copertura. </li><li> Morsetto della diapositiva / array panino nella camera di ibridazione e ruotare a 50 ° C per 3 ore. </li><li> Mentre la serie è rotante, effettuare le seguenti soluzioni di 50 mL in provette coniche da 50 ml: una conica riempita con 50 ml di dH 2 O, due 1x SCC soluzioni tampone, ciascuno in un tubo separato, e un buffer di 2x SCC. </li><li> Dopo le tre ore di incubazione, con attenzione sbloccaggio l&#39;array / slide panino e mettetelo nel 50 ml conica contenente il tampone 2x SCC. Utilizzando un paio di pinzette, separare delicatamente l&#39;array dalla diapositiva copertura ed estrarre il vetrino di copertura. Fare attenzione a non toccare l&#39;array come la diapositiva è tirato fuori. Chiudere il conica e capovolgere delicatamente per 60 secondi. </li><li> Con le pinze, la matrice di trasferimento alla soluzione 1x SCC, tappare la provetta, e capovolgere delicatamente per 1 minuto poi trasferire l&#39;array per la seconda soluzione 1x SCC e ancora capovolgere delicatamente per un altro minuto. </li><li> Infine, la matrice di trasferimento al tubo di dH 2 O e capovolgere delicatamente per 30 secondi. </li><li> Secco l&#39;array ponendo il bordo del vetrino su un Kimwipe. Continuare a ruotare l&#39;array sul pulire facendo attenzione a non disturbare il lato contenente le oligo. </li><li> Posizionare l&#39;array a secco inuna vuota da 50 ml tubo conico e scansione con uno scanner Microarray </li></ol> Interpretazione dei Microarray <ol><li> Lo scanner microarray creerà una immagine TIF dell&#39;array. Eseguire questa immagine attraverso il software di Agilent Feature Extraction, utilizzando il file della griglia (fornito da Agilent) che è unico alla tua riserva specifica. </li><li> Il software Agilent interpreterà il segnale in ogni funzione per creare un file, che viene analizzato con uno script Perl. Il segnale ad ogni funzione è di normalizzare l&#39;intensità totale in quel canale. Per esempio a una caratteristica particolare nel canale verde, l&#39;intensità del canale verde per la funzione individuale è divisa per l&#39;intensità totale del canale verde su tutte le caratteristiche. Il risultato finale è il rapporto log del canale rosso sul canale verde a ciascuna funzione sulla matrice. </li><li> I dati piscina oligo dal microarray può essere ri-mappata nuovo al genoma per ottenere un quadro di dove e come fortemente, la RNP di interesse legato. </li></ol> Figura 1. Schema sperimentale <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> A. Piastrelle schema. Dopo aver selezionato e il download di pre-mRNA sequenze di interesse, l&#39;area scelta è piastrellato con finestre in 30 nucleotidi che cambiano con incrementi di 10 nucleotidi. Universale fianco primer siti ogni lato della finestra. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> B. Sintesi di array. Piastrelle ordini oligo devono essere presentate alla Agilent, dove le sequenze verrà stampato su un oligonucleotide microarray su ordinazione. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Figura 1c" /> C. Co-immunoprecipitazione. Dopo aver fatto bollire l&#39;oligo fuori dell&#39;array, incubare in estratto HeLa nucleare, quindi aggiungere l&#39;estratto di sfere magnetiche che vengono preparati con un anticorpo contro la RNP di interesse. Etichetta la piscina oligo partire Cy3 e la piscina legato IP con Cy5 e applicare alla matrice di rilevamento e scansione. Figura 2. L&#39;annotazione del genoma e con l&#39;analisi dei dati di arricchimento. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Figura 2" /> A. Convertire il punteggio medio di ogni coordinata dai dati genomici array di base-ten log e mappa che punteggio alle coordinate date. Un esempio di questo passo media viene somministrato per 3 sovrapposizione di 30 nt oligo con i punteggi di 2, 4 e 0,5, in cui viene rappresentata graficamente il punteggio di arricchimento medio per ogni 10-nt finestra sopra. Le regioni genomiche selezionato può essere visualizzato usando una traccia personalizzati nel Browser Genome USCS. La finestra del browser esempio dato è nel gene clta, dove sono riportate le caratteristiche gene (esoni / introni / splicing alternativo, ecc) lungo la parte inferiore e punteggi arricchimento log media dal PTB-bound oligo sono rappresentate da barre rosse verticali scure. PTB si lega fortemente a monte dell&#39;esone 2 nel tratto polypyrimidine.

Quando si esegue questa procedura il suo importante ricordare che la creazione della piscina è flessibile e aperto a modifiche sia a livello del RNA o proteine. A livello di RNA regioni ortologhi, le mutazioni malattia, polimorfismi o mutazioni casuali possono essere introdotti nella sequenza di oligonucleotidi. A livello della proteina del fattore di RNA binding può essere modificata o modifiche fosforilazione altro post traduzionali. Inoltre, l&#39;ambiente vincolante possono essere manipolati per aumentare o diminu...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

Sequenziamento RNA che la co-immunoprecipitato (co-IP) con le proteine ​​RNA binding ha aumentato la nostra comprensione di splicing, dimostrando che ubicazione vincolante spesso influenza la funzione di un fattore di splicing. Tuttavia, come con qualsiasi strategia di campionamento la possibilità di individuare un RNA legato a un fattore di splicing è proporzionale alla sua abbondanza cellulare. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio in vitro per la rilevazione sulle specificità di legame altrimenti transitorio pre-mRNA. Questo approccio utilizza una piscina appositamente progettato oligonucleotide che le piastrelle in introni, esoni, giunzioni di splicing, o altre pre-mRNA. La piscina è sottoposto a una sorta di selezione molecolare. Qui, noi dimostrare il metodo separando la oligonucleotidi in una frazione legati e non legati e utilizzare una strategia a due serie a colori per registrare l&#39;arricchimento di ogni oligonucleotide nella frazione legata. I dati di matrice genera mappe ad alta risoluzione con la capacità di identificare la sequenza-specifica e strutturale determina di ribonucleoproteina (RNP) vincolanti per pre-mRNA. Un vantaggio unico di questo metodo è la sua capacità di evitare il bias di campionamento verso mRNA associati con IP corrente e le tecniche di SELEX, come la piscina è appositamente progettata e sintetizzata dal pre-mRNA sequenza. La flessibilità della piscina oligonucleotide è un altro vantaggio in quanto lo sperimentatore sceglie quali le regioni di studiare e piastrelle in tutto, adattando la piscina alle loro esigenze individuali. Utilizzando questa tecnica, si può dosaggio gli effetti di polimorfismi o mutazioni su vincolante su larga scala o clonare la libreria in un reporter splicing funzionale e identificare oligonucleotidi che si arricchisce nella frazione incluso. Questo romanzo in vitro ad alta risoluzione schema di mappatura fornisce un modo unico per studiare le interazioni RNP con transitorio pre-mRNA specie, la cui bassa abbondanza li rende difficili da studiare con le attuali tecniche in vivo.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e studiare<em&gt; In vivo</em&gt;. Qui, vi presentiamo un romanzo<em&gt; In vitro</emApproccio&gt; per indagare le interazioni RNA-proteina con un pool di sintesi oligo che le piastrelle in regioni selezionate del pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K Views.  Brown University. A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e studiare In vivo. Qui, vi presentiamo un romanzo In vitro per indagare le interazioni RNA-proteina con un pool di sintesi oligo che le piastrelle in regioni selezionate del pre-mRNA.

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Ricerca

Biologia

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Un metodo per la selezione di aptameri-struttura di commutazione Applicato ad una colorimetrico oro nanoparticelle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA