Il contributo principale del nostro documento è che abbiamo esplorato un panorama preciso e fine della patologia beta amiloide del cervello del morbo di Alzheimer con la tecnologia di imaging della spettrometria di massa di imaging MALDI. Abbiamo raggiunto progressi tecnologici generando uno speciale protocollo con pretrattamento dell'acido formico delle diapositive tissutali. A seguito di MALDI-IMS, vengono generate mappe di segmentazione e vengono eseguiti calcoli per scoprire nuove proteine marcatori o peptidi colocalizzati con placca e vascucolatura subaracnoidea.
Ottenere campioni corticali umani per l'IMS da cervelli che sono stati rimossi, elaborati e conservati a meno 80 gradi Celsius entro otto ore dopo la mortem. Prendi il campione cerebrale dalla corteccia occipitale dei pazienti affetti da AD e dai controlli abbinati all'età. Per tagliare le sezioni tissutali su un criostato, posizionare in primo luogo l'ossido di stagno di indio conduttivo o i vetri del microscopio rivestiti in ITO all'interno del criostato.
Riscaldare l'esemplare cerebrale dell'autopsia da meno 80 gradi Celsius a meno 22 gradi Celsius all'interno del criostato. Attaccare una nuova lama monouso al criostato per ogni esperimento. Cerca sempre di usare una parte pulita della lama.
Metti sul palco il cervello dell'autopsia congelato insieme a una piccola quantità di composto ottimale per la temperatura di taglio. Per l'IMS e l'immunoistochimica, tagliare da cinque a sei sezioni da ciascun campione di tessuto. Quando la lama sta appena iniziando a tagliare il tessuto, ruotare la ruota e affrontare il blocco fino a quando tutto il tessuto è esposto.
Se c'è una piccola striscia o strappo attraverso la sezione, attendere nel criostato fino a quando la regolazione della temperatura non lo fissa automaticamente. Contare pochi secondi prima di aprire l'antirollio con un tessuto sotto. Posizionare immediatamente la fetta di tessuto sul lato rivestito di ITO dello scivolo di vetro.
Scongelare la fetta di tessuto mettendo un dito sotto la diapositiva sul lato non rivestito di ITO. Il tessuto si attacca alla diapositiva. Assicurarsi che il tessuto sia il più piatto possibile senza rughe.
Per risciacquare le sezioni tissutali, immergere i campioni in 40-100 millilitri di etanolo al 70% in un barattolo di colorazione del vetro per 30 secondi per rimuovere lipidi endogeni e sali inorganici. Lavare i campioni utilizzando la sequenza di lavaggio elencata nel protocollo di testo. Quindi, asciugare i campioni nel vuoto per 30 minuti.
Ora, trattare le sezioni tissutali con un vapore acido formico per una migliore ionizzazione delle proteine beta amiloide dal tessuto cerebrale dell'autopsia. Per fare ciò, preparare il forno a 60 gradi Celsius e un piatto di vetro di incubazione con cinque millilitri di acido formico al 100%. Mantenere l'umidità dell'aria nel piatto di vetro di incubazione a livello di saturazione.
Posizionare i vetrini di tessuto nella teglia di vetro di incubazione evitando l'immersione nell'acido formico e trattare per sei minuti. Prendi un'immagine ottica dei campioni usando uno scanner di pellicole, uno scanner di gel o un microscopio digitale. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente.
L'allineamento dell'immagine ottica dei campioni è necessario quando la destinazione del campione è posizionata all'interno dello strumento. Di solito, non sarà possibile riconoscere la sezione del tessuto sotto lo strato della matrice. Per correlare le immagini ottiche con i campioni, creare segni guida visibili sia nell'immagine ottica che sotto lo strato della matrice nell'ottica della fotocamera.
Il modo più semplice è individuare almeno tre segni di fluido di correzione intorno al campione prima di prendere l'immagine ottica. Per spruzzare la matrice con uno spruzzatore ad ultrasuoni, rimuovere il tessuto da spruzzare dall'essiccatore e posizionarlo nella camera. Assicurarsi che il tessuto non copra la finestra del sensore.
Iniziare la preparazione premendo il pulsante Start. Di solito, il tempo di preparazione è di circa 90 minuti. La preparazione sarà regolata automaticamente attraverso il monitoraggio dello spessore e dell'umidità dello strato della matrice.
In alternativa, per spruzzare la soluzione a matrice sulla superficie del tessuto con uno spruzzatore automatico, utilizzare un sistema di pompaggio a solvente impostato a 10 psi e 0,15 millilitri al minuto per fornire la soluzione a matrice. Un flusso costante di gas di sheath riscaldato verrà consegnato congiuntamente con lo spray della soluzione a matrice. Esegui esperimenti di imaging ad alta produttività e ad alta risoluzione spaziale con MALDI-IMS.
Per la misurazione della spettrometria di massa, definire le aree tissutali utilizzando il software di controllo MALDI e il software di analisi dei dati. Acquisire spettri in modo lineare positivo con un intervallo di rapporto massa-carica da 2.000 a 20.000 e una risoluzione spaziale di 20 e 100 micron. Per rendere standard la calibrazione, sciogliere lo standard di calibrazione peptidica e lo standard di calibrazione proteica in un rapporto uno-quattro con soluzione CHCA e TA30 e quindi diluirlo 10 volte.
Posizionare un microlitro dello standard di calibrazione sullo scivolo in quattro posizioni diverse. Utilizzando un software di istologia molecolare, sovrapporre più immagini del segnale per trovare la correlazione spaziale di vari segnali come diversi peptidi beta amiloide colocalizzando in placche senili e pareti arteriosa. L'angiopatia amiloide cerebrale o fenotipi CAA del paziente numero tre sono stati i più importanti in questo studio.
MALDI-IMS del tessuto cerebrale di questo paziente ha chiaramente visualizzato che l'amiloide beta 1-42 e l'amiloide beta 1-43 sono stati depositati preferenzialmente come placche senili nel parenchima cerebrale. Al contrario, beta amiloide più corte come l'amiloide beta da 1-36 a 1-41 sono state depositate preferenzialmente sulle aree vascolari leptomeningee. Non ci sono stati segnali significativi nel controllo non patologico.
Le distribuzioni di amiloide beta 1-40 e amiloide beta 1-42 sono state ulteriormente convalidate con immunoistochimica utilizzando sezioni congelate adiacenti dei tessuti. L'anticorpo anti-amiloide beta 1-40 etichettato CAA e rivelato amiloide beta 1-40 è preferibilmente depositato nei vasi sanguigni leptomeningeali, che è chiaramente in contrasto con la distribuzione di beta amiloide 1-42 nel parenchima cerebrale come placche senili. Di seguito è mostrata una mappa di segmentazione ottenuta con un'analisi k-means di bisezione applicata alla stessa sezione dal paziente numero tre.
Questo metodo di clustering ha identificato con successo strutture simili a placche nel parenchima e nelle strutture vascolari nello spazio subaracnoideo. È interessante trovare una piccola area circolare nel parenchima che viene rilevata proprio intorno a una piccola arteriola nel parenchima e nello spazio subaracnoideo. Questo è verificato da singole immagini ioniche di questi singoli peptidi beta amiloide.
C'è un limite per rintracciare un'ampia gamma di beta amiloide contemporaneamente anche se si utilizzano gli anticorpi specifici. Qui, mostriamo la distribuzione della beta amiloide nel cervello umano usando il metodo di spettrometria di massa di imaging MALDI all'avanguardia. Riteniamo che questo contributo contribuisca alla ricerca sul morbo di Alzheimer perché questa relazione offre la caratterizzazione dell'intero insieme di proteine beta amiloide nel cervello autopsied umano.
La scoperta più impressionante è che solo una singola alterazione dell'amminoacido al terminale C della proteina beta amiloide fa un drastico cambiamento nella loro distribuzione. Le fasi di preparazione dei tessuti sono fondamentali per ottenere una ionizzazione efficace delle proteine aggregate nel tessuto cerebrale umano. Cocristallizzazione omogenea dell'alita con matrici cruciali per l'alta sensibilità e l'imaging privo di artefatti.
