The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità alla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Arizona. Un elenco di materiali e attrezzature raccomandate possono essere trovate nella tabella 1. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Perfusion <ol><li> Euthanize roditore con una overdose di pentobarbital sodico (25 mg / kg, IP), e profumato transcardially con tampone fosfato salino (PBS) fino a completo dissanguato (3-5 min) a una velocità di flusso di 8 ml / min. Per le istruzioni di perfusione in profondità, vedi Gage et al 2012 9. </li><li> Subito dopo PBS filo, fissare il tessuto mediante perfusione con paraformaldeide al 4% in PBS per 15-20 min ad una velocità di flusso di 8 ml / min. </li><li> Rimuovere cervello e posto in paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da soluzioni di saccarosio graduati (15%, 30%, 30%, in sequenza, preparata in soluzione salina tamponata con Tris) a 4 ° C. Trasferire il cervello per la successiva soluzione di saccarosio oolo dopo che il cervello ha affondato in ogni soluzione. Nota: Di solito, 5 giorni in ogni soluzione è un tempo sufficiente per il tessuto di affondare. </li></ol></li><li> Tissue Congelamento e criosezionamento <ol><li> Posizionare il cervello in mezzo di inclusione, quali OCT e immergere in isopentano a una temperatura di -35 ° C. Lasciare che il cervello di congelare per un minimo di 10 minuti, e poi conservare a -80 ° C. Possono sorgere problemi se diligenza a temperatura non è presa; si rimanda la discussione per la risoluzione dei problemi. </li><li> Tagliare sezioni coronali seriali ad uno spessore di 20 um e una temperatura di -20 ° C. Raccogliere il tessuto su vetrini caricati positivamente. Sezioni del cervello possono essere collocati in una scatola di diapositive avvolto in un foglio in una busta zip-top e conservati a lungo termine a -80 ° C. Questo metodo di memorizzazione crea un doppio limite per evitare l&#39;esposizione all&#39;aria e al gelo. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Processing NOTA: attrezzature e materiali Esempio r, facoltativo per la colorazione sono mostrati in figura 3. Le alternative sono disponibili, tuttavia, queste immagini aiuteranno chi è nuovo di immunoistochimica per visualizzare elementi del caso prima di procedere all&#39;acquisto. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Figura 3: Esempio di oggetti necessari per la colorazione immunoistochimica La scatola nera mostrato in (A) è una camera di umidità ideale per immunofluorescenza, come diapositive sono protetti dalla luce, senza la necessità di avvolgere la scatola su un foglio.. Dopo sezionamento, vetrini possono essere memorizzati in una scatola quali la scatola gialla mostrato in (B). Avvolgere la scatola ermeticamente in un foglio e messa in un sacchetto di zip-top prima freezer aiuta a proteggere i campioni di tessuto da bruciature da freddo. Un esempio di diapositive è dato in (C), con diversi piatti di colorazione descritti in (D) e (E </strong&gt;). Coprioggetto può variare in termini di dimensioni e spessore (F), tuttavia 1.2 vetrini spessi di risultati di imaging belle sulla maggior parte microscopi diritti e confocale. Una matita come quello mostrato in (G) può essere utilizzato per etichettare diapositive. Marcatore permanente dovrebbe essere evitato come l&#39;inchiostro può essere eseguito, che interessano sia la colorazione e la capacità di determinare ciò che il campione è. Un mini penna pap come quello mostrato in (H) permette un bordo repellenti da trarre su vetrini. <ol><li> Preparazione diapositive <ol><li> Estrarre i vetrini da freezer e scongelare a temperatura ambiente. <ol><li> Opzionale: Se le sezioni hanno già galleggiare da diapositive, collocare le diapositive scongelati in forno a 60 ° C per non più di 4 ore per evitare sezioni di tessuto da galleggiante al largo diapositive. </li></ol></li><li> Posizionare i vetrini in un rack scorrevole e piatto corrispondente. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno, cambiando soluzione tra un lavaggio. Da questo punto in avanti, evitare di avere sectiComponenti senza liquidi per periodi di tempo prolungati. Nota: Se le sezioni asciugano, la colorazione di fondo è aumentata e dati significativi non può essere ottenuto in modo affidabile. </li></ol></li><li> Tissue Colorazione <ol><li> In una scatola di colorazione a tenuta di luce, creare una &quot;camera umida&quot; con i tessuti privi di lanugine imbevuto con acqua deionizzata. </li><li> Asciugare i bordi della slitta con un tessuto privo di lanugine, usare un mini penna pap per fare un bordo liquido repellente ai margini della diapositiva, lontano da sezioni di tessuto. Questo bordo dovrebbe garantire un ampio spazio fra il menisco del liquido e il bordo del tessuto in modo che la tensione superficiale non influisce colorazione. NOTA: Il confine repellente penna pap può essere applicato prima del 2.1.3, se gli anticorpi di interesse non richiedono microonde recupero dell&#39;antigene. Se la penna pap è stato applicato prima del lavaggio in PBS, l&#39;integrità del confine liquido repellente deve essere controllato in questa fase. Utilizzare una penna mini-pap per colmare eventuali lacune nel confine. </li><li&gt; Con diapositive disposti orizzontalmente, l&#39;antigene non specifico blocco vincolante incubando nel 4% v / v siero in PBS (soluzione di blocco). Dispensare 300 ml di soluzione di blocco per vetrino per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che la soluzione blocco estende alla penna pap al bordo della diapositiva e copre completamente il tessuto per evitare colorazione irregolare causato dalla tensione superficiale vicino al tessuto. <ol><li> Utilizzare siero dalla stessa specie in cui è fatto anticorpo secondario. Nota: In questa procedura, gli anticorpi secondari sono realizzati in asino, e quindi viene utilizzato siero asino. Se si utilizzano anticorpi secondari di due o più specie diverse, includere siero di ogni specie. </li></ol></li><li> Pipetta anticorpo primario su vetrini. Nota: le concentrazioni di anticorpi per questa colorazione sono stati ottimizzati a 1: 5.000 e 1: 500 per Iba1 e Pan-neuronale, rispettivamente. Queste concentrazioni sono stati trovati per mostrare colorazione significativo con l&#39;assenza di colorazione di fondo. <ol><li> Diluire soluzione blocco1% di siero in PBS e aggiungere anticorpi primari. Dispensare 300 ml di soluzione di anticorpo primario in 1% di siero per vetrino. Ancora una volta, assicura il fluido è al bordo della penna pap. Incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> Include tre vetrini di controllo: uno che contiene anticorpi né Iba1 né Pan-neuronali, una con Iba1 senza anticorpi Pan-neuronale, e uno con l&#39;anticorpo Pan-neuronale senza Iba1. Macchia queste diapositive nella stessa seduta con le stesse soluzioni, tuttavia omettere le anticorpi primari per verificare il legame degli anticorpi secondari non specifici. </li></ol></li><li> La mattina seguente, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno, cambiando soluzione tra un lavaggio. </li><li> Gli anticorpi fluorescenti sono sensibili alla luce, quindi, da questo punto in avanti, ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce garantendo contenitori lavaggio sono avvolti in fogli e ibridazione scatole sono nero o incubate al buio. Pipettare gli anticorpi secondari appropriati in tutte le diapositive e incubare per60 min a temperatura ambiente ad una concentrazione di 1: 250 in soluzione di blocco (vedere fase 2.2.3) in una &quot;camera umida&quot; a tenuta di luce (vedere fase 2.2.1). <ol><li> Utilizzare anticorpi secondari di differenti lunghezze d&#39;onda. Qui, per il coniglio anticorpo primario anti-Iba1, utilizzare asino anti-coniglio 594 come l&#39;anticorpo secondario appropriato. Per il mouse anticorpo primario anti-Pan-neuronale, utilizzare asino anti-topo 488 come l&#39;anticorpo secondario appropriato. In alternativa, utilizzare anti-coniglio 488 e anti-topo 594. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Opzionale: eseguire colorazione nucleare. <ol><li> Posto in Hoechst (o altro colorazione nucleare) ad una concentrazione di 0,03 mg / ml in doppia H 2 0 distillata per esattamente 60 sec. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Lavare in DDH 2 0. </li></ol></li><li> Coprioggetto <ol><li> Vetrini coprioggetto con un mezzo di montaggio a base acquosa, come Fluoromount-G o ProlongGold. Fare attenzione a rimuovere tutte le bolle con un applicatore di cotone con punta. Nota: Altri agenti di montaggio potrebbero essere utilizzati, per quanto alto sanguinare-through tra coloranti è stato notato da alcuni pochi giorni di copertura dei vetrini. </li><li> Utilizzare smalto trasparente per sigillare i bordi, impedendo sezioni si secchi a causa dell&#39;evaporazione. Lasciare smalto si asciughi in un contenitore a tenuta di luce mentre scivoli resta piatta ea temperatura ambiente, e poi conservare in un contenitore a tenuta di luce avvolti in un foglio a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Imaging Tissue Stained <ol><li> Microscopia <ol><li> Lasciare che il smalto ad asciugare per almeno un&#39;ora prima di iniziare la microscopia, che dovrebbe avvenire in una stanza buia. </li><li> Acquisire microfotografie usando un confocale o microscopio di ricerca con una sorgente di luce fluorescente e un attacco della telecamera digitale. Utilizzando il software di accompagnamento, impostare l&#39;esposizione per ogni lunghezza d&#39;onda - 405, 488, e 594 - separatamente. Nota: in modo approfondito le istruzioni di imaging dovrebbero essere disponibili on-line presso il produttore del microscopio. </li><li> Acquisire microfotografie in ogni canale senza spostare le sezioni o la regolazione della messa a fuoco. Prendere immagini a colori, in scala di grigi o alternativamente e convertire in colore dopo. Nota: Il colore o scala di grigi di ciascun canale possono essere raccolti in post-processing. </li><li> Assicurarsi che le sezioni di tessuto non siano esposti a luce ambiente o alla luce microscopica per lunghi periodi di tempo, come si verificherà fotometabolismo delle sezioni. Per evitare questo, aumentare il tempo di esposizione, piuttosto che aumentando l&#39;intensità della luce / laser. </li><li> Non spegnere la sorgente di luce fluorescente entro 30 minuti di essere stato acceso. Nota: Modificare la sorgente e lo spegnimento in rapida successione, potrebbe diminuire la durata della vita della lampadina fluorescente. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+antigens+and+antibodies.">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li><li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods.">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li><li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies:+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis.">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li><li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-labeled+antibodies:+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens.">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li><li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application.">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li><li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. , (1983).</li><li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Junqueira's basic histology : text and atlas. , (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).</li><li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy).">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li><li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+sections+of+70-100+mum:+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system.">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;obiettivo generale di questa comunicazione è stato quello di introdurre procedure immunoistochimiche al lettore. Per questo, l&#39;esempio della doppia etichettatura con Iba1 e antigeni Pan-neuronali per osservare microglia e neuroni in paraformaldeide perfusione, è stato utilizzato il saccarosio cervello crioprotetti, ratto cryosectioned. Questa tecnica può essere adattata per servire scopi infinite. Una serie di diversi antigeni in una varietà di tipi di tessuto, come, ma non lim...

<html> L&#39;immunoistochimica è un processo per rilevare antigeni (cioè proteine) in sezioni di tessuto utilizzando anticorpi primari che si legano specificamente agli antigeni di interesse. L&#39;immunoistochimica è stato lanciato da JR Marrack nel 1934, quando decise che gli anticorpi possano localizzare gli antigeni con grande specificità 1. A partire dal 1942, tra i primi studi in vitro con anticorpi fluorescenti per visualizzare immunoistochimica sono stati pubblicati 2,3, dopo di che il primo studio in vivo istochimico è stato pubblicato 4. Durante il 1960, tre decenni dopo l&#39;inizio dei metodi di immunoistochimica, gli anticorpi enzima-coniugati cominciarono ad essere usati come reagenti secondari. Questi metodi sono stati contemporaneamente e indipendentemente sviluppate in Francia e negli Stati Uniti 5,6. Oggi, una vasta gamma di anticorpi fornisce infinite possibilità per gli studi di immunoistochimica 7. &quot;&gt; L&#39;obiettivo generale di questa corrispondenza è quello di fornire una breve introduzione in immunoistochimica, ma non vuole essere una rassegna completa ed esaustiva di questa tecnica Nel metodo descritto, tecniche di immunoistochimica per due antigeni sono presentati (marker di microglia e. neuroni) per la colorazione di paraformaldeide perfuso, saccarosio crioprotetti, cervello di ratto cryosectioned. La colorazione immunoistochimica inizia con il blocco vincolante per ridurre la colorazione di fondo aspecifica antigene. Successivamente, l&#39;incubazione con l&#39;anticorpo primario consente per il legame ad un antigene specifico nel tessuto. Dopo l&#39;anticorpo primario, un altro anticorpo, chiamato anticorpo secondario, viene applicato per collegare l&#39;anticorpo primario a un segnale di visualizzazione coniugato 8. L&#39;anticorpo secondario obiettivi delle immunoglobuline G (IgG) dominio specifico per le specie in cui l&#39;anticorpo primario è stato sollevato. L&#39;anticorpo secondario amplifica il segnale dell&#39;anticorpo primario poiché le regioni Fab di tegli anticorpi legano secondario a più siti sul dominio IgG dell&#39;anticorpo primario. O enzimi o molecole fluorescenti coniugate alle regioni c F dell&#39;anticorpo secondario consentono la visualizzazione. Per esempio, un anticorpo primario anti-Iba1 coniglio è un coniglio IgG molecola specifica per Iba1. Quando IgG anti-coniglio asino viene applicato come anticorpo secondario, sarà riconoscere e legarsi a più regioni dell&#39;anti Iba1-IgG di coniglio (vedere Figura 1). L&#39;anticorpo asino può essere visualizzata con vari metodi. Questa corrispondenza concentra sulla rilevazione di un fluoroforo coniugato con l&#39;anticorpo secondario, che riconosce l&#39;anticorpo primario, per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. In immunoistochimica fluorescente, una macchia nucleare come Hoechst o DAPI può essere utilizzato per visualizzare tutti i nuclei. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Figura 1: SchRappresentazione ematico di vs diretta tecniche di etichettatura di anticorpi indiretto. Gli anticorpi legano all&#39;antigene di interesse e può essere amplificata da anticorpi secondari sollevate contro la specie degli anticorpi primari. Questa tecnica può essere eseguita utilizzando complesso avidina-biotina (ABC) per l&#39;amplificazione e DAB per la visualizzazione (A), o di un anticorpo secondario fluorescente direttamente coniugato (B). In alternativa, gli anticorpi primari possono essere coniugati direttamente con molte etichette diverse, tra cui la biotina o un fluoroforo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Un metodo alternativo per la visualizzazione di colorazione immunoistochimica utilizza 3,3&#39;-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB; vedi figure 1 e 2). Ciò differisce dalla fluorescenza utilizzando un biotinilato orafano perossidasi (HRP) anticorpo secondario coniugato, che fornisce un enzima per convertire DAB ad un precipitato che è visibile al microscopio in campo chiaro. Nei casi in cui un unico antigene è di interesse o colorazione è tenuto ad essere di lunga durata, DAB può essere più adatto di colorazione fluorescente. Tuttavia, DAB colorazione non è molto adatto per la differenziazione tra più marcatori, soprattutto se due antigeni nucleari sono di interesse. Per informazioni sui materiali DAB e modifiche di protocollo, consultare Tabella 1. In alternativa, nitro blu tetrazolio cloruro / 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) può essere utilizzato per visualizzare una fosfatasi alcalina (AP) secondario coniugato anticorpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Immagini rappresentative della DAB sezioni di tessuto cerebrale di ratto con etichetta singola nichel-enhanced cervello Rat sareZIONI che sono contrassegnati con DAB nichel-enhanced per Iba1 (A) e Pan-neuronale (B) consentire l&#39;analisi di lunga durata della microglia o neuroni da soli. Bar Scala 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Si deve considerare l&#39;abbondanza stimata dell&#39;antigene di interesse all&#39;interno del tessuto che viene analizzato. I metodi indiretti (come descritto sopra) sono utili per gli obiettivi a bassa abbondanza. Quando l&#39;antigene di interesse è molto abbondante, metodi diretti possono essere applicati. Metodi diretti implicano un anticorpo primario che è direttamente coniugato ad un segnale di visualizzazione, e quindi non è richiesta anticorpo secondario. Questo metodo semplifica il processo di colorazione, ma elimina l&#39;amplificazione ottenuti con metodi indiretti. Utilizzando un anticorpo primario direttamente coniugato elimina anche cross-reattività di anticorpi secondariquando doppia etichettatura. Dettagli La presente comunicazione il protocollo per la doppia etichettatura con Iba1 e Pan-neuronali (dettagli nella tabella 1). Iba1 macchie microglia in molti stati di attivazione, tra cui ramificato, iper-ramificato, attivato, ameboidi, e l&#39;asta. Macchie Pan-neuronali neuronale assoni, dendriti, e soma. Poiché Iba1 macchie più microglia e obiettivi Pan-neuronali del neurone, questa combinazione di macchie è utile ad acquisire una vasta comprensione delle interazioni microglia-neuroni. In sintesi, immunoistochimica si basa sulla selezione accurata degli anticorpi. Poiché la domanda di ricerca diventa più specifica, anticorpi diretti contro antigeni alternativi possono desiderare. Per individuare un particolare stato di attivazione della microglia, si può scegliere di utilizzare anticorpi CD45 o CD68, piuttosto che Iba1. Inoltre, in collaborazione con i topi, F4 / 80 può fornire i risultati necessari. Allo stesso modo, gli elementi neuronali possono essere specificamente mirati con anticorpi razato contro il nucleo, sinapsi (pre o post), assone, e cono di crescita. Inoltre, ci sono altri indicatori che differenziano l&#39;età del neurone (Double-Cortin, NeuN) e rigenerazione neuronale (GAP-43).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

L&#39;immunoistochimica è una tecnica largamente usata per rilevare la presenza, la posizione e l&#39;abbondanza relativa di antigeni in situ. Questo protocollo di livello introduttivo descrive i reagenti, le attrezzature e le tecniche necessarie per completare immunoistochimica del tessuto cerebrale dei roditori, utilizzando marcatori per microglia e gli elementi neuronali come esempio. In particolare, questo documento è un protocollo step-by-step per la visualizzazione fluorescente della microglia e neuroni tramite immunoistochimica per Iba1 e Pan-neuronale, rispettivamente. Fluorescenza doppia etichettatura è particolarmente utile per la localizzazione di più proteine ​​all&#39;interno dello stesso campione, fornendo la possibilità di osservare accuratamente interazioni tra tipi cellulari, recettori, ligandi, e / o la matrice extracellulare in relazione l&#39;uno all&#39;altro così come proteina co localizzazione all&#39;interno di una singola cellula. A differenza di altre tecniche di visualizzazione, la fluorescenza immunoistochimica intensità della colorazione può diminuire inle settimane a mesi seguenti la colorazione, se non si prendono le opportune precauzioni. Nonostante questa limitazione, in molte applicazioni di fluorescenza doppia etichettatura è preferito su alternative come 3,3&#39;-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) o fosfatasi alcalina (AP), come fluorescenza è più tempo efficiente e permette di differenziare più precisa tra due o più marcatori. La discussione include la risoluzione dei problemi e consigli per promuovere il successo.

Questo protocollo di colorazione si traduce in sezioni di tessuto di cervello di ratto che hanno microglia fluorescente nel 594 canali (rosso) e neuroni marcati nel 488 canali (verde; vedi Figura 4). Se una colorazione nucleare è stato fatto, mostrerà nel canale 405 (blu). Le immagini possono essere prese in canali diversi e sovrapposti per confronto diretto dei tre canali, o tra due canali. Molte suite software di acquisizione digitale comprendono questa funzionalità. Doppia etichettatura con Iba1 e...

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K Views.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Ricerca

Neuroscienze

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Quantificare la morfologia di Microglia da microfotografie di Immunohistochemistry preparato tessuto usando ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.