Questo metodo può essere utilizzato per facilitare la visualizzazione di processi di astrociti molto fini per la valutazione delle interazioni neuronali degli astrociti alla sinapsi durante la malattia e gli stati stazionari. Questa tecnica può anche essere applicata in qualsiasi modello di topo, popolazione cellulare o regione cerebrale. Per preparare un elettrodo affilato con un'adeguata resistenza, tirare un elettrodo a canna singola in vetro borosilicato con un filamento su un estrattore di micropipette.
Conservare gli elettrodi tirati in un contenitore chiuso per evitare che la polvere entri nelle punte e mantenere gli elettrodi elevati dal fondo della scatola per evitare che le punte si rompano. Per riempire un elettrodo con soluzione di colorante giallo lucifero, posizionare un elettrodo in posizione verticale con la punta rivolta verso il basso e pipettare da uno a due microlitri di soluzione gialla lucifero nella parte posteriore dell'elettrodo. Attendere da cinque a 10 minuti affinché la soluzione si sposti sulla punta tramite azione capillare prima di fissare delicatamente l'elettrodo riempito in un supporto per elettrodi collegato a un manipolatore con il filo d'argento del supporto dell'elettrodo a contatto con il giallo lucifero all'interno dell'elettrodo.
Per il test di espulsione del colorante, posizionare delicatamente una fetta di cervello leggermente fissata in un piatto inferiore di vetro riempito con PBS molare 0,1 a temperatura ambiente e tenere la fetta in posizione con un'arpa di platino con corde di nylon. Collegare l'elettrodo a una fonte di tensione e posizionare l'elettrodo di terra nel bagno contenente la fetta cerebrale. Spostare l'obiettivo di un microscopio confocale nella regione cerebrale di interesse e abbassare l'elettrodo nella soluzione utilizzando la lente ad immersione in acqua 10X, spostando l'elettrodo al centro del campo visivo.
Sotto illuminazione a campo luminoso, esaminare attentamente l'elettrodo con la lente ad immersione dell'acqua 40X per assicurarsi che l'elettrodo appaia chiaro e senza detriti o bolle. Passa alla microscopia a scansione laser confocale con un laser da 488 nanometri. Accendere lo stimolatore a 12 volt per testare l'espulsione del colorante.
Una grande nube di colorante fluorescente dovrebbe essere visibile intorno alla punta dell'elettrodo. Quindi, sotto il campo luminoso abbassare lentamente l'elettrodo verso la fetta, fermandosi appena sopra la superficie. Per riempire un astrocita di interesse con la iontoforesi, utilizzare il contrasto di interferenza differenziale infrarossa per identificare gli astrociti con somata allungati di forma ovale di circa 10 micrometri di diametro, da 40 a 50 micrometri sotto la superficie della fetta.
Questo è lo strato radio dell'ippocampo direttamente sotto lo strato cellulare piramidale. Mentre ci muoviamo attraverso il tessuto, possiamo vedere vasi sanguigni, neuroni, astrociti e altri tipi di cellule. Una volta selezionato un astrocita, spostare la cella al centro del campo visivo e abbassare lentamente la punta dell'elettrodo nella fetta, navigando attraverso il tessuto fino a quando l'elettrodo non è sullo stesso piano del corpo cellulare.
Una volta che il corpo cellulare dell'astrocita è chiaramente visibile e delineato, avanzare lentamente e delicatamente l'elettrodo in avanti, spostando l'elettrodo fino a quando la punta impala il soma della cella. Spostare lentamente la messa a fuoco dell'obiettivo su e giù per notare se l'elettrodo si trova all'interno del soma. Una volta che la punta dell'elettrodo è all'interno della cella, accendere lo stimolatore a 0,5 a uno volt per espellere continuamente la corrente nella cella.
Utilizzando il microscopio confocale, guardare la pellicola cellulare, aumentando lo zoom digitale per visualizzare i dettagli della cella e assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia visibile all'interno della cella se necessario. Attendere circa 15 minuti fino a quando i rami e i processi più fini appaiono definiti prima di spegnere la tensione e ritirare delicatamente la punta dell'elettrodo dalla cella. Per visualizzare la cella riempita, attendere da 15 a 20 minuti affinché la cella ritorni alla forma originale prima di regolare l'impostazione sul microscopio confocale per assicurarsi che i rami e i processi più fini appaiano definiti sotto l'obiettivo 40X.
Impostare una pila Z con una dimensione del passo di 0,3 micrometri, spostando l'obiettivo durante l'imaging fino a quando non c'è segnale dalla cella e impostare quel passaggio come superiore. Quindi spostare l'obiettivo verso il basso, concentrandosi attraverso la cella fino a quando non c'è segnale e impostare quel passo come in basso. Al termine dell'imaging, controllare l'elettrodo per l'espulsione del colorante.
Se appare una grande nuvola di colorante, l'elettrodo può essere utilizzato per la fetta successiva. In caso contrario, sostituire l'elettrodo. Generando una proiezione di massima intensità, si può osservare una visione dettagliata della struttura di un astrocita nel suo dominio.
Uno zoom di magnitudine quattro X nell'astrocita rivela una proiezione di intensità massima di un ramo maggiore, diversi rami secondari e la distribuzione delle branchline e dei volantini circostanti. Qui viene mostrata l'immagine originale di un astrocita CA1. Il corpo cellulare, i rami, i processi e il volume del territorio racchiusi dall'astrocita sono ricostruiti in queste immagini successive.
Dopo la creazione delle ricostruzioni, i volumi del soma, dell'intera cellula e del territorio furono quantificati. E il numero di rami principali è stato contato. Come proteina citoscheletricha che etichetta i filamenti di astrociti intermedi è espressa nel soma cellulare, nei rami maggiori e in alcuni rami astrociti secondari, ma non nei rami e nei processi più fini.
In questa analisi rappresentativa, non sono state riscontrate differenze significative nel numero di rami primari etichettati dalla proteina acida fibrillare gliale e quelli che visualizzano per giallo lucifero. Inoltre, l'area cellulare e il volume dell'astrocita etichettato dalla proteina acida fibrillare gliale erano significativamente più piccoli dell'area e del volume visualizzato con il giallo lucifero, dimostrando che la proteina acida fibrillare gliale è un marcatore affidabile per l'etichettatura dei rami principali, ma non è utile per determinare l'area complessiva o il volume della cellula. La quantità di colorante rilasciata dalla punta dell'elettrodo dipende dalla resistenza dell'elettrodo che deve essere abbastanza alta da consentire l'espulsa di un flusso costante di colorante.
Studi futuri possono esaminare i diversi componenti della struttura degli astrociti mediante microscopia ottica a super risoluzione o mediante analisi immunoistochimica dell'espressione di proteine specifiche all'interno della struttura degli astrociti.
